一种富含芳香族氨基酸的改善睡眠酶解物及其制备方法与流程

本发明涉及乳制品及食源性活性肽开发技术领域，具体涉及一种富含芳香族氨基酸的改善睡眠酶解物及其制备方法。

背景技术：

古语有言，牛奶有助于睡眠，睡前一杯牛奶帮助提高睡眠质量。多年以前，学者们都认为主要是因牛奶中含有大量色氨酸的作用。然而在21世纪，miclo等人¹研究新发现，酪蛋白酶解物具有舒缓压力、改善睡眠功效，提出一种酪蛋白中的食源性功能活性肽α-czp(ylgyleqllr)，它具有良好的抗焦虑、舒缓情绪、改善睡眠障碍的效果，能够结合gabaa受体，打开“睡眠开关”，引起大脑中一系列神经递质变化，发挥改善睡眠作用，并且通过动物及多次随机人群临床实验验证，含α-czp的酶解物确有抗焦虑及改善睡眠活性。

酪蛋白是牛奶中含量最多的一种蛋白，高达80％，其资源丰富、来源广泛、营养价值高，对产品开发极具优势。酪蛋白氨基酸组成特殊，含有较多酪氨酸及其他芳香族氨基酸，因其良好的生物特性，已开发多种生物活性肽，如降血压、抗氧化肽以及降血糖活性肽等。其中近年来，据调查显示中国失眠人群已达3亿人以上，焦虑、失眠问题已受到大众关注，以酪蛋白为原料开发改善睡眠产品，符合当今大健康产业市场迫切需求及发展趋势。

改善睡眠活性包括直接诱导睡眠以及间接改善睡眠障碍作用，其中研究较多的活性有抗焦虑、阿片活性。研究表明二者活性肽结构具有一定规律，含tyr及phe肽具有显著活性，尤其是n末端tyr结构肽。已有报道发现酪蛋白水解物具有良好的抗焦虑活性，中国专利cn200980120762中公开一种包含αs1-酪蛋白肽的抗焦虑组合物，提出生物合成或化学合成的方法制备两条肽ylgyl及ylgyle具有抗焦虑活性。以及专利us005846939a中公开一系列αs1-酪蛋白来源的以n-末端为tyr的α-czp同源序列抗焦虑肽。但以上两项专利中提及使用酪蛋白分离纯化亚基进一步酶解的工艺或化学合成肽的处理方法过于复杂，并且操作仪器设备昂贵，如冷冻干燥机，液相分离色谱等，不利于生产中广泛使用。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足，提出一种简单有效的酶解制备工艺，制得一种含芳香族氨基酸特征性肽组成的酶解物，不仅富集α-czp释放量，而且还释放其他多种抗焦虑肽，其改善睡眠潜在活性肽含量丰富，能够有效地解决量产问题，提供一种活性显著的改善睡眠酶解物。

本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

本发明提出一种富含芳香族氨基酸的改善睡眠酶解物及其制备方法，具体包括如下步骤：

(1)按照质量份数1:8～15比例分别称量加入酪蛋白和蒸馏水，并且注意先加入部分水开始预处理，升温至30～50℃搅拌溶解，制得酪蛋白分散液；

(2)在上述酪蛋白分散液中加入可食用碱调节ph至7～8，搅拌分散液至基本无大颗粒，加入一种或多种1‰～1％的蛋白酶(按原料酪蛋白质量计)，酶解0.5～4h，得到酶解液，迅速升温至85～95℃加热10～15min灭酶，灭酶后将酶解液冷却至室温，4～10℃、8000～10000g离心去除大分子沉淀；

(3)随即取上清液浓缩、喷雾干燥成品。

进一步地，在本发明较优实施例中，酪蛋白与水混合质量比例为1:10～12，加热温度在35～40℃，搅拌频率在20～60hz。

进一步地，上述酶解温度为对应酶的最佳酶解温度。

进一步地，上述离心为4℃、8000g。

进一步地，在本发明较优实施例中，蛋白酶选用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶及碱性蛋白酶的一种或多种，进行一步酶解或分步酶解，酶添加量为2‰～8‰，酶解时间为1～4h。

进一步地，在本发明较优实施例中，喷雾干燥的条件为：浓缩后固形物含量达到20％～35％，进风温度为160～210℃，出风温度为70～120℃。

本发明提供一种由上述最优制备方法得到的富含芳香族氨基酸的改善睡眠酶解物，经质谱鉴定肽谱，其中含芳香族氨基酸的肽得率达70％以上，尤其n末端为芳香族氨基酸的含量高达30％，典型抗焦虑肽α-czp释放含量高，并且同时含有多种抗焦虑肽，能够广泛应用于改善睡眠食品、功能食品、保健食品中。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：

(1)本发明提供的最优酪蛋白酶解工艺，改善睡眠肽α-czp基本可达全释放，酶解物中含芳香族氨基酸的肽得率达70％以上，具有极高的改善睡眠潜力。

(2)本发明提供的制备方法，通过简单的加热搅拌预处理提高酪蛋白的溶解度，能很大程度减少酶添加量及酶解时间。以及特殊酶解工艺过程，克服复杂昂贵的化学合成及亚基分离纯化的生产方法，有效富集多种含量丰富的抗焦虑肽，工艺条件相较更简单有效，工厂量产方便。

(3)本发明制得的改善睡眠酶解物，n末端为芳香族氨基酸组成肽显著高于其他普通酪蛋白酶解物，其中色氨酸作为神经递质五羟色胺前体物质，有助于睡眠，n末端为tyr及phe的肽具有镇静活性。

(4)本发明制得的改善睡眠酶解物经二级质谱鉴定肽，本发明产品富集除tyr-leu-gly-tyr-leu-glu-gln-leu-leu-arg(α-czp)以外还有多种抗焦虑活性及阿片活性肽，如tyr-leu(yl)、phe-phe(ff)、tyr-pro-val-glu-pro-phe(ypvepf)，能够有效辅助缓解压力、焦虑情绪，改善睡眠障碍。

附图说明

图1为实施例1-3质谱鉴定肽氨基酸分析图；

图2a为质谱鉴定酪蛋白酶解物中tyr-leu(yl)的二级谱图；

图2b为质谱鉴定酪蛋白酶解物中phe-phe(ff)的二级谱图；

图2c为质谱鉴定酪蛋白酶解物中tyr-pro-val-glu-pro-phe(ypvepf)的二级谱图；

图2d为质谱鉴定酪蛋白酶解物中tyr-leu-gly-tyr-leu-glu-gln-leu-leu-arg(α-czp)的二级谱图；

图2e为α-czp定量外标曲线图。

具体实施方式

以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。

下列实施例中涉及超高效液相色谱联用二级质谱鉴定酪蛋白改善睡眠肽以及外标定量法如下：

样品前处理：由酶解工艺制得的上清液立即与0.1％甲酸-乙腈以1:3的体积比混合，在4℃下放置2～4h，4℃、8000g离心10～15min，取上清液用流动相0.1％甲酸水稀释至0.5mg/ml，过0.22μm滤膜于液相小瓶中，于-20℃冷冻保存备用，24h内进行质谱分析。

使用超高效液相色谱联用质谱(uplc-ms/ms)鉴定生物活性肽，采用梯度洗脱色谱分离，联用二级质谱鉴定定量，洗脱速度为0.2ml/min，进样量为2μl。流动相a为0.1％甲酸水，b为乙腈(色谱纯)，洗脱程序为：0～10min，5％～40％b；10～12min，40％～90％b；12～14min，90％b；14～15min，90％～5％b；15～18min，5％b平衡至初始状态。质谱参数：电子轰击离子源能量7ev，毛细管电压4500v，离子源温度200℃，干燥气体流量8.0l/min，雾化器压力1.5bar，质量扫描范围m/z50～1500。

其中外标定量法的uplc-ms/ms程序保持与上述设置相同，α-czp标准品浓度分别为1.25、2.5、5、6.25、12.5、25μmol/l，测定浓度-峰面积标准曲线(图2e)，换算样品中改善睡眠肽相对含量。

实施例1

(1)按照质量份数1:8比例分别称量加入酪蛋白和蒸馏水，开始预处理，升温至35℃，20hz恒速搅拌溶解，制得酪蛋白分散液。

(2)在上述酪蛋白分散液中加入可食用碱调节ph至7，搅拌分散液至基本无大颗粒，加入1‰的胰蛋白酶(按原料酪蛋白质量计)，37℃酶解4h，得到酶解液，迅速升温至85～95℃加热10～15min灭酶。灭酶后将酶解液冷却至室温，4℃、9000g离心去除大分子沉淀。

(3)随即取上清液浓缩，至固形物含量达到30％，进风温度为210℃，出风温度为120℃，喷雾干燥成品。

实施例2

(1)按照质量份数1:10比例分别称量加入酪蛋白和蒸馏水，开始预处理，升温至40℃，恒速40hz搅拌溶解，制得酪蛋白分散液。

(2)在上述酪蛋白分散液中加入可食用碱调节ph至7.5，搅拌分散液至基本无大颗粒，加入2‰木瓜蛋白酶(按原料酪蛋白质量计)，55℃酶解1h，灭酶后冷却至室温，再加入5‰的胰蛋白酶(按原料酪蛋白质量计)，37℃酶解1.5h，得到二次酶解液，迅速升温至85～95℃加热10～15min灭酶。灭酶后将酶解液冷却至室温，4℃、10000g离心去除大分子沉淀。

(3)随即取上清液浓缩，至固形物含量达到35％，进风温度为185℃，出风温度为85℃，喷雾干燥成品。

实施例3

(1)按照质量份数1:12比例分别称量加入酪蛋白和蒸馏水，不经预处理，直接制得酪蛋白分散液。

(2)在上述酪蛋白分散液中加入可食用碱调节ph至8，搅拌分散液至基本无大颗粒，加入2‰的碱性蛋白酶alcalase(按原料酪蛋白质量计)，55℃酶解1h，得到酶解液，灭酶后冷却至室温，再加入8‰木瓜蛋白酶(按原料酪蛋白质量计)，ph7、55℃酶解2h，迅速升温至85～95℃加热10～15min灭酶。灭酶后将酶解液冷却至室温，10℃、8000g离心去除大分子沉淀。

(3)随即取上清液浓缩，至固形物含量达到20％，进风温度为160℃，出风温度为70℃，喷雾干燥成品。

对实施例1-3所得成品酶解物的多肽组分进行质谱鉴定分析，所得数据如图1，实施例2所得酶解物中含芳香族氨基酸的肽得率达70％以上，n末端为芳香族氨基酸的含量高达30％；

对实施例1-3所得成品酶解物进行质谱鉴定(图2a、图2b、图2c、图2d)，从图中可以看出，实施例1-3所得成品酶解物含有tyr-leu(yl)、phe-phe(ff)、tyr-pro-val-glu-pro-phe(ypvepf)和tyr-leu-gly-tyr-leu-glu-gln-leu-leu-arg(α-czp)；ylgyleqllr、ypvepf、yl和ff可在文献报道或在biopep数据库http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep中查询活性，均是具有抗焦虑及改善睡眠活性的肽，并且含量丰富，因此本发明所得酶解物具有极高的改善睡眠潜力。

对实施例1-3所得成品酶解物进行超高效液相色谱联用质谱鉴定生物活性肽，通过α-czp定量外标曲线计算所得α-czp在蛋白酶解物中含量如表1，原料酪蛋白包埋状态α-czp理论含量为1.85％，实施例1-3所得酶解物α-czp释放量较高，其中实施例2基本可达全释放。

表1α-czp在蛋白酶解物中含量

以上实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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