一种酶解乳清蛋白粉制备抗氧化肽粉的方法及在奶茶粉中的应用与流程

2021-01-07 10:01:24|

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本发明涉及一种酶解乳清蛋白粉制备抗氧化肽粉的方法及应用，涉及食品
技术领域：
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背景技术：
：乳清通常是指由牛乳生产干酪及干酪素的副产物，乳清蛋白（wheyprotein，wp）是乳清的主要成分之一，wp富含人体所需的各种氨基酸，易于为机体消化吸收，而且生物价较高、蛋白质功效比和利用率也较高，是目前可获得的营养最全面的天然蛋白质之一。wp制品主要有乳清浓缩蛋白粉（wheyproteinconcentrate，wpc）、乳清分离蛋白（wheyproteinisolate，wpi）等。将乳清经过预处理、超滤、喷雾干燥后生产出来的粉即为wpc，由蛋白含量的不同分为乳清浓缩蛋白-50（wpc-50）、乳清浓缩蛋白-80（wpc-80）等。乳源抗氧化剂是一种天然的抗氧化剂，具有清除自由基作用，与机体防御、免疫调节、促进矿物质吸收等功能有关，同时作为天然的含乳制品，具有极高的营养价值，食品中应用乳源抗氧化剂符合当代人们的健康观念。基于此，对于乳源抗氧化剂的研究越来越多的得到研究者们的关注。采用一种或多种蛋白酶协同酶解乳基原料是制备乳源抗氧化肽最常见的方法。常采用的蛋白酶有消化道蛋白酶、微生物蛋白酶等。较高的效率、温和的反应条件、广泛的蛋白酶来源、反应过程的易控制都是酶解法优于其他制备方法的特点，因此，制备乳源抗氧化肽时酶解法的应用最为广泛。抗氧化活性肽具有清除自由基的作用，适当的摄入可以维持机体内的自由基平衡，从而减少因自由基过多而引起的疾病。另外，乳源抗氧化剂可以通过逆梯度作用被机体吸收，且氨基酸含量丰富均衡，安全性高无毒副作用，而且用于制备乳源抗氧化剂的动物源乳基原料来源广泛、性价比高，将乳源抗氧化剂用于制备具有抗氧化功能的保健食品具有巨大的商业价值，同时这种保健食品很具前瞻性。技术实现要素：本发明提供了一种酶解乳清蛋白粉制备抗氧化肽粉的方法，采用该方法制备的乳清蛋白抗氧化肽粉，分子量低，对dpph自由基、羟自由基清除率较高，而且能够提高蒙古族传统奶茶粉的抗氧化活性。具体技术方案如下：一种酶解乳清蛋白粉制备抗氧化肽粉的方法，包括：步骤(1)：配制乳清蛋白粉水溶液，高温变性后，加入胰蛋白酶和菠萝蛋白酶进行酶解，酶解结束后，高温灭酶，得到乳清蛋白粉酶解液。步骤(2)：将乳清蛋白粉酶解液经真空冷冻干燥，得到乳清蛋白抗氧化肽粉。步骤(3)：将乳清蛋白抗氧化肽粉应用于奶茶粉中。步骤(1)中所述乳清蛋白粉为浓缩型乳清蛋白粉，质量分数为3g/100ml，其水溶液配置方法为将乳清蛋白粉置于去离子水中均质30s，所述高温变性的温度为95℃，时间为5min。步骤(1)中：所述胰蛋白酶和菠萝蛋白酶酶活力范围为：胰蛋白酶酶活力≥4000u/g，菠萝蛋白酶酶活力≥1200000u/g。胰蛋白酶和菠萝蛋白酶有其最适ph，在酸碱不适宜的情况下蛋白酶的空间构型会产生变化，从而导致酶或降低甚至失活。作为优选，步骤(1)中，所述酶解反应ph选择6.0。每种酶发挥其活性都有最适的温度，温度低于其最适温度时，酶活被抑制不能发挥其活性；温度高于其最适温度时，酶结构被破坏而失去活性。作为优选，步骤(1)中所述酶解反应温度为50℃。作为优选，步骤(1)中所述酶解反应酶底比选择为0.3%。作为优选，步骤(2)中所述乳清蛋白粉酶解液经真空冷冻干燥的温度选择-45℃。作为优选，步骤(3)中所述乳清蛋白抗氧化肽粉与奶茶粉的比例为0.2:1000。附图说明附图1：乳清蛋白抗氧化肽粉对奶茶粉感官品质的影响具体实施方式下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。实施例1一种酶解乳清蛋白粉制备抗氧化肽粉的方法，具体内容如下：复合蛋白酶酶解乳清蛋白粉：称取适量的乳清蛋白粉溶解于去离子水中，配制成一定底物浓度3%（w/v）的溶液，95℃水浴5min后冷却至50℃（并在整个酶解过程中保持溶液温度变化不超过±1℃），置于恒温电磁搅拌器上，用0.5mol/l的hcl溶液调节溶液ph至6.0，按照0.25%的酶底比（w/w）加入胰蛋白酶和菠萝蛋白酶，进行酶解2.5h，反应过程每隔10min向酶解液中加入0.5mol/l的naoh溶液保证ph的变化不超过±0.05。酶解结束后，置于沸水中10min以灭酶，冷却至室温，得到乳清蛋白粉酶解液。将乳清蛋白粉酶解液经真空冷冻干燥，得到乳清蛋白抗氧化肽粉：用75%的酒精擦拭后放入托盘并没于酶解液，关闭舱门，启动真空冷冻干燥程序。真空冷冻干燥程序结束后，酶解液冻干至粉状，关闭真空泵，待舱内外气压一致后打开舱门，取出托盘将乳清蛋白抗氧化肽粉装入自封袋，-20℃避光保存。乳清蛋白抗氧化肽粉分子量分布检测的方法，具体内容如下：采用高效液相凝胶色谱法（hplc）：色谱柱采用tskgelg2000swxl(300×7.8mm)；流动相组成为乙腈：水：三氟乙酸=45：55：0.1（v/v）；流速0.5ml/min；进样量10µl；检测波长采用220nm；柱温设置为30℃。将样品溶解于流动相并过膜，用高效液相色谱仪进行凝胶过滤，紫外检测器进行检测，用gpc软件处理数据。用四种肽标准品：乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（分子量189da）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（分子量451da）、杆菌酶（分子量1450da）和细胞色素c（分子量12500da）、杆菌酶（分子量1450da）和细胞色素c（分子量12500da）做相对分子质量标准曲线。乳清蛋白抗氧化肽粉的ph稳定性检测的方法，具体内容如下：将乳清蛋白抗氧化肽粉用去离子水稀释至一定浓度，用0.5m的hcl或naoh溶液调节ph至4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，40℃水浴0min、30min、60min、90min、120min、150min，测抗氧化指标（dpph自由基清除率、羟自由基清除率、总抗氧化能力）。乳清蛋白抗氧化肽粉的温度稳定性检测的方法，具体内容如下：乳清蛋白抗氧化肽粉用去离子水稀释至一定浓度，调节ph至6.0，分别置于4℃、25℃、40℃、60℃、80℃水浴锅，0min、30min、60min、90min、120min、150min后测抗氧化指标。乳清蛋白抗氧化肽粉涉及的dpph自由基清除率、羟自由基清除率、脂质氧化抑制率和分子量分布的测定方法如下：(1)dpph自由基清除率的测定：取2ml试样与等体积的dpph无水乙醇溶液（0.1mmol/l）混合，剧烈振荡使其混合均匀，室温，避光反应30min，用紫外分光光度计检测其517nm下的吸光值ai。取2ml去离子水与等体积的dpph无水乙醇溶液（0.1mmol/l）混合，剧烈振荡使其混合均匀，室温，避光反应30min，用紫外分光光度计检测其517nm下的吸光值a0。取2ml试样与等体积的无水乙醇混合，剧烈振荡使其混合均匀，室温，避光反应30min，用紫外分光光度计检测其517nm下的吸光值aj。dpph清除率用以下公式计算结果：dpph清除率（%）=(2)羟自由基清除率的测定：取2ml试样，加入到2ml浓度9mmol/l的feso4溶液和2ml浓度10mmol/l的h2o2水溶液，摇匀，37℃静置10min，加入2ml浓度9mmol/l的水杨酸溶液，混合后37℃静置30min，用紫外分光光度计检测其510nm下的吸光值ai。取2ml去离子水，加入到2ml浓度9mmol/l的feso4溶液和2ml浓度10mmol/l的h2o2水溶液，摇匀，37℃静置10min，加入2ml浓度9mmol/l的水杨酸溶液，混合后37℃静置30min，用紫外分光光度计检测其510nm下的吸光值a0。取2ml试样，加入到2ml浓度9mmol/l的feso4溶液和2ml浓度10mmol/l的h2o2水溶液，摇匀，37℃静置10min，加入2ml去离子水，混合后37℃静置30min，用紫外分光光度计检测其510nm下的吸光值aj。羟自由基清除率用以下公式计算结果：羟自由基清除率（%）=(3)脂质氧化抑制率测定：称取250mg大豆卵磷脂和250mg吐温20溶于50mlpbs（10mmol/l，ph7.4）溶液中，超声处理40min，得到均质的脂质分散液。移液枪准确吸取2ml脂质分散液于试管中，加入1mlfecl2溶液（0.04mol/l），再加入2ml一定浓度的乳清蛋白冻干粉水溶液，将试管置于水浴锅中37℃，避光反应1h后，取出试管加入2ml浓度为10%的tca溶液，静置10min，4000g离心10min，吸取4ml上清液加入2ml浓度为0.375%的tba溶液，100℃水浴15min，迅速冷却,用紫外分光光度计检测其532nm下的吸光值a1。称取250mg大豆卵磷脂和250mg吐温20溶于50mlpbs（10mmol/l，ph7.4）溶液中，超声处理40min，得到均质的脂质分散液。移液枪准确吸取2ml脂质分散液于试管中，加入1mlfecl2溶液（0.04mol/l），再加入2ml去离子水，将试管置于水浴锅中37℃，避光反应1h后，取出试管加入2ml浓度为10%的tca溶液，静置10min，4000g离心10min，吸取4ml上清液加入2ml浓度为0.375%的tba溶液，100℃水浴15min，迅速冷却,用紫外分光光度计检测其532nm下的吸光值a0。脂质氧化抑制率=%(4)分子量分布检测：采用高效液相凝胶色谱法（hplc）。色谱柱采用tskgelg2000swxl(300×7.8mm)；流动相组成为乙腈：水：三氟乙酸=45：55：0.1（v/v）；流速0.5ml/min；进样量10µl；检测波长采用220nm；柱温设置为30℃。将样品溶解于流动相并过膜，用高效液相色谱仪进行凝胶过滤，紫外检测器进行检测，用gpc软件处理数据。用四种肽标准品：乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（分子量189da）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（分子量451da）、杆菌酶（分子量1450da）和细胞色素c（分子量12500da）、杆菌酶（分子量1450da）和细胞色素c（分子量12500da）做相对分子质量标准曲线。(5)乳清蛋白抗氧化肽粉的ph稳定性检测：将乳清蛋白抗氧化肽粉用去离子水稀释至一定浓度，用0.5m的hcl或naoh溶液调节ph至4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，40℃水浴0min、30min、60min、90min、120min、150min，测抗氧化指标。(6)乳清蛋白抗氧化肽粉的温度稳定性检测：将乳清蛋白冻干粉溶液用去离子水稀释至一定浓度，调节ph至6.0，分别置于4℃、25℃、40℃、60℃、80℃水浴锅，0min、30min、60min、90min、120min、150min后测抗氧化指标。所得抗氧化肽粉（浓度：40mg/ml）抗氧化各指标检测结果见表1。表1抗氧化各指标检测结果抗氧化指标dpph自由基清除率羟自由基清除率脂质氧化抑制率数值94.14±1.23%83.61±1.0436.21±0.48%所得抗氧化肽粉（浓度：40mg/ml）小分子肽分子量检测结果见表2。表2乳清蛋白抗氧化肽粉的分子量分子量（da）10000以上5000-100003000-50002000-30001000-2000150-1000150以下占比（%）7.15±0.524.11±0.335.35±0.497.14±0.7716.80±0.6456.25±0.983.18±0.28所得抗氧化肽粉在ph6.0时抗氧化活性最为稳定。碱性环境中ph8.0-12.0，随着ph的增长抗氧化活性逐渐降低。在不同的温度下，乳清蛋白冻干粉的抗氧化活性的变化明显。在4℃和25℃时乳清蛋白抗氧化肽粉的抗氧化活性稳定，40℃时，其抗氧化能力变化亦不显著（p>0.05），表明乳清蛋白抗氧化肽粉在40℃以及低于40℃时抗氧化活性较为稳定。实施例2将实施例1中所述方法制备出的乳清蛋白抗氧化肽粉应用于奶茶粉中，具体内容如下：以0.2g/kg（w/w）的比例将乳清蛋白抗氧化肽粉添加于奶茶粉中，在充足的日光或白炽灯光下，取5g待检奶茶粉放在硫酸纸上，观察奶茶粉的组织状态。按照包装袋上的要求，以75℃温水：奶茶粉=8:1进行冲泡，室温避光放置温度50℃首先用清水漱口，然后用鼻子闻气味，最后喝一口（约5ml），仔细品味再咽下。以0.2g/kg（w/w）的比例将乳清蛋白抗氧化肽粉添加于奶茶粉中，准确称取奶茶粉1.0g于锥形瓶中，加入99ml去离子水，超声至奶茶粉完全溶解，4000r/min，离心15min，检测上清液的抗氧化活性指标。乳清蛋白抗氧化肽粉加入奶茶粉中可以提高奶茶粉的抗氧化活性，其中dpph自由基清率增加33.34%，羟自由基清率增加35.72%。加入乳清蛋白抗氧化肽粉前后奶茶粉的感官品评结果如表3、附图1所示，结果表明，加入乳清蛋白冻干粉后奶茶粉的奶香味更浓郁，米香味得以中和更加纯正，口感整体更加醇厚。表3感官评定表当前第1页1 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