一种柠檬桉精油/乳酸链球菌素纳米乳液及制备方法与流程

本发明属于食品抗菌保鲜材料领域，具体涉及一种柠檬桉精油/乳酸链球菌素纳米乳液及制备方法。

背景技术：

柠檬桉精油是从柠檬桉大乔木叶中提取的一种植物精油，散发出刺激性芳香气味，抑菌能力较强，具有广谱抑菌性，主要应用于香精香料、医药、害虫防治等领域，是一种天然无毒的添加剂。但柠檬桉精油易挥发，对光、热、氧气等较为敏感，使用时风味刺鼻，因此利用率较低。国内关于提高柠檬桉精油稳定性及利用率的专利申请极少。目前仅有中国专利cn105030677a申请公开了一种高稳定性的柠檬桉精油纳米脂质体抗菌剂及制备方法，但制备过程中采用了氯仿作为有机溶剂，不可避免会有溶剂残余，对人体具有一定毒害作用；另外所述抗菌剂不易分散均匀，无法高效发挥柠檬桉精油的抗菌作用。

乳酸链球菌素是一种由乳酸乳球菌乳酸亚种的某些菌株代谢过程中合成的天然生物防腐剂，具有良好的抑菌性，可以有效地抑制大部分革兰氏阳性菌，但对革兰氏阴性菌、霉菌以及酵母菌无直接抑制作用。早在上个世纪就被世界卫生组织批准用作食品防腐剂，已被多个国家和地区广泛应用于果蔬、乳制品、肉制品、酒制品、即食制品以及豆制品等食品保鲜行业中。

纳米乳液是粒径一般在10-200nm之间的一种乳化运输体系，一般由油相、水相和乳化剂组成，可使被包埋的脂溶性成分的水溶解度显著提高，可在极大程度上解决植物精油生物利用率低，易挥发，易氧化，对光、热敏感等问题。主要通过高压均质、微射流均质以及超声波均质等三种高能乳化法和自发乳化、相转变温度等两种低能乳化法制备而成。相比常规微米级的粗乳液，纳米乳液在贮存过程中基本无絮凝、聚集、沉淀、奥式熟化现象，具有优异的分散性与稳定性。

国内关于包载植物精油的纳米乳液的专利申请较少。中国专利cn104490661a申请公开了一种含柠檬精油的o/w型纳米乳液及其制备方法；中国专利cn107981143a申请公开了一种含有甜橙精油的纳米乳液的制备方法及其应用。中国专利cn107714516a申请公开了一种包埋薄荷精油纳米乳液的制备方法及其在漱口水中的应用。但目前关于抑菌型包载植物精油的纳米乳液的专利申请极少，目前仅有中国专利cn108719457a申请公开了一种具有抑菌活性麝香草酚的纳米乳液及其制备方法和应用，所述方法虽能制备纳米级乳液，但制备效率较低，且所制备的纳米乳液稳定性不够强。本发明则采用超声波乳化法克服此缺点，相比传统的搅拌均质，可大大提高制备效率，且所制备的纳米乳液稳定性较强。

将柠檬桉精油通过超声波乳化法制备成“水包油”型纳米乳液，加之与乳酸链球菌素的协同作用，在克服柠檬桉精油的应用缺点的同时，也拓宽了乳酸链球菌素的抑菌范围，提高了纳米乳液的稳定性和抑菌性，具有良好的应用前景和市场价值。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种柠檬桉精油/乳酸链球菌素纳米乳液及制备方法，通过将一定质量的乳酸链球菌素溶于去离子水中，加入吐温80与大豆卵磷脂组成的复合乳化剂形成水相，磁力搅拌后逐滴加入作为油相的载有柠檬桉精油的玉米油，在搅拌均质和超声破碎的作用下形成“水包油”型纳米乳液，所制备的纳米乳液可有效提高柠檬桉精油的水溶性和生物兼容性，避免了柠檬桉精油的直接挥发，可达到高效利用与长效抗菌的目的。纳米乳液结构示意图如图1所示。

本发明由乳酸链球菌素、玉米油、柠檬桉精油、吐温80、大豆卵磷脂制成纳米乳液，制备步骤如下：

首先将一定质量的乳酸链球菌素溶于去离子水中，加入一定比例的吐温80与大豆卵磷脂组成的复合乳化剂，磁力搅拌2h形成水相；向作为载体油的玉米油中加入一定体积的柠檬桉精油，混合搅拌5min后形成油相，然后逐滴加入到水相中，在搅拌均质和超声破碎的作用下形成“水包油”型乳液。

所述乳酸链球菌素在水相中的浓度为5mg/ml。

所述吐温80与大豆卵磷脂的质量比例为2:1,所组成的复合乳化剂与油相的质量比例为2:7。

所述玉米油与柠檬桉精油的体积比例为3:2。

所述水相与油相的体积比例为9:1。

所述油相逐滴加入到水相的速率为1滴/s。

所述搅拌均质的转速为1500r/min，搅拌均质的时间为30min。

所述超声破碎的功率为350w，超声破碎时间为15min，工作1s，间歇1s，超声变幅杆规格为6mm。

本发明将柠檬桉精油通过超声波乳化法制备成“水包油”型纳米乳液，加之与乳酸链球菌素的协同作用，在克服柠檬桉精油的应用缺点的同时，也拓宽了乳酸链球菌素的抑菌范围，提高了纳米乳液的稳定性和抑菌性，具有良好的应用前景和市场价值。

附图说明

图1柠檬桉精油/乳酸链球菌素纳米乳液结构示意图

图2柠檬桉精油/乳酸链球菌素纳米乳液的粒径分布图

图3柠檬桉精油/乳酸链球菌素纳米乳液的zeta电位分布图

图4柠檬桉精油/乳酸链球菌素纳米乳液的黏度曲线图

图5柠檬桉精油/乳酸链球菌素纳米乳液对e.colio157:h7的抑菌效果图

图6柠檬桉精油/乳酸链球菌素纳米乳液对staphylococcusaureus的抑菌效果图

具体实施方式

通过下面实例说明本发明的具体实施方式，但本发明的保护内容不仅局限于此。

实施例1柠檬桉精油/乳酸链球菌素纳米乳液的粒径、pdi(多分散系数)及zeta电位测定

1.1实验材料：

吐温80：ar；国药集团化学试剂有限公司

柠檬桉精油：法国florihana有限公司

大豆卵磷脂：ar；国药集团化学试剂有限公司

乳酸链球菌素：ar；阿拉丁化学试剂有限公司

玉米油：益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司

1.2实验方法：

(1)柠檬桉精油/乳酸链球菌素纳米乳液的制备

①称取45mg乳酸链球菌素加入到9ml蒸馏水中，于常温下磁力搅拌30min，配制成5mg/ml的乳酸链球菌素溶液。

②分别吸取180mg吐温80和90mg大豆卵磷脂加入到上述溶液中，于常温下磁力搅拌30min形成水相。

③分别吸取600μl玉米油和400μl柠檬桉精油(共计约945mg)于2ml离心管中，混合搅拌5min后，通过200ul移液枪在计时的同时按每秒1滴的速率逐滴滴加入到上述水相溶液中，在1500r/min的转速下搅拌均质30min，形成“水包油”型粗乳液。

④将上述粗乳液置于超声细胞破碎仪中，在冰水浴下以350w的功率超声15min，工作1s，间歇1s，即得柠檬桉精油/乳酸链球菌素纳米乳液。

(2)粒径、pdi及zeta电位测定

取适量上述所制备的纳米乳液样品置于激光粒度仪的样品槽中，分别对粒径、pdi及zeta电位进行测量。

1.3实验结果：

图2结果表明，所制备的柠檬桉精油/乳酸链球菌素纳米乳液的平均粒径为166.66nm，且粒径均匀分布在70nm-340nm之间；多分散系数(pdi)小于0.300，表明纳米乳液分散性能很好，没有发生团聚或油滴融合现象；另外，图3结果表明，所制备的纳米乳液的平均zeta电位为-1.75mv，且zeta电位基本均匀分布在-75mv-75mv之间。综合以上结果分析，所制备的纳米乳液较为稳定。

实施例2柠檬桉精油/乳酸链球菌素纳米乳液的黏度测定

2.1实验材料：

柠檬桉精油/乳酸链球菌素纳米乳液

2.2实验方法：

取实施例1制备的柠檬桉精油/乳酸链球菌素纳米乳液1.3ml置于旋转流变仪的夹具上，选用直径为40mm的锥形板，于常温下测量剪切速率在10-100l/s范围内的纳米乳液的黏度变化。

2.3实验结果：

图4结果反映出所制备的纳米乳液的黏度整体偏低，黏度最大时也不及0.0025pa·s，且随着剪切速率的增大，纳米乳液的黏度逐渐下降，表明纳米乳液的流动性较好。

实施例3柠檬桉精油/乳酸链球菌素纳米乳液协同抑菌性能的测定

3.1实验材料：

柠檬桉精油/乳酸链球菌素纳米乳液

氯化钠：ar；国药集团化学试剂有限公司

牛肉浸膏：br；国药集团化学试剂有限公司

鱼粉蛋白胨：br；国药集团化学试剂有限公司

琼脂粉：br；国药集团化学试剂有限公司

无水磷酸氢二钠：ar；国药集团化学试剂有限公司

磷酸二氢钾：ar；国药集团化学试剂有限公司

菌种：e.colio157:h7；staphylococcusaureus

3.2实验方法：

取适量实施例1中制备的柠檬桉精油/乳酸链球菌素纳米乳液放置于超净台中进行紫外灭菌处理1h。

接种e.colio157:h7和staphylococcusaureus于营养肉汤培养基(nb),37℃摇床中振荡培养24h,获得对数生长期的菌悬液，取适量处于对数生长期的e.colio157:h7和staphylococcusaureus加到磷酸盐缓冲液中，十倍逐级梯度稀释至e.colio157:h7和staphylococcusaureus的浓度均为10^5-6cfu/ml。

将灭菌后的柠檬桉精油/乳酸链球菌素纳米乳液加入上述含有e.colio157:h7和staphylococcusaureus的试管中，使其浓度为25％(v:v)，于37℃下振荡反应，分别在0d、1d、2d、3d、4d时取适量培养液十倍梯度稀释到合适浓度，然后取100μl稀释液滴到固体培养基上，涂布均匀后放入37℃恒温培养箱中倒置培养，48h后进行平板计数，实验重复三次，结果取平均值。对照组则用等量的去离子水代替纳米乳液。

3.3实验结果

图5和图6表明，随着纳米乳液分别与e.colio157:h7和staphylococcusaureus作用时间的延长，对应的残存菌数均呈逐渐下降趋势，未加纳米乳液的对照组的残存菌数则有缓慢上升至稳定的趋势，这表明所制备的纳米乳液具有一定的抑菌效果。

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