用于低盐低酸型酸肉制备的酿酒酵母CMRC1Y及其应用的制作方法

2021-01-07 10:01:19|

351|

起点商标网

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及用于低盐低酸型酸肉制备的酿酒酵母cmrc1y及其应用。

背景技术：

中国贵州、湖南和云南地区的少数民族如侗族、苗族和壮族，大多数还保持着传统的生活方式并保留着很多特色美食，酸肉是其特色食品之一。传统酸肉以猪肉为原料，采用自然发酵工艺，保质期长、风味独特、并且富含游离氨基酸和活性肽等功能成分。然而，传统酸肉采取自然发酵工艺，容易被有害微生物污染，不利于其规模化生产。为了保证食用安全性，酸肉生产中氯化钠添加量通常高达8~20%，导致产品中氯化钠含量过高，不利于人体健康，容易引起消费者高血压和心血管等疾病；同时，自然发酵酸肉中优势微生物通常为乳酸菌，导致其ph值范围通常可低至3.9~4.7，虽然较高的酸度（即较低的ph值）有利于抑制有害微生物的生长，但过酸的口感导致酸肉不易被消费者接受。

为了保证低盐低酸型发酵肉制品的食用安全性和风味品质，可采用生产中添加微生物发酵剂的方法。研究表明，酵母菌作为发酵剂可抑制肉制品中有害菌生长，其抗氧化能力有利于稳定肉制品的色泽，酵母还可降解肌肉蛋白、脂肪，并在发酵过程中代谢产生大量风味物质，其中支链醇类物质可产生威士忌酒、香草、麦芽等气味，酯类物质则可形成玫瑰香、鸢尾香、水果香气。另外，酿酒酵母除了可以改善发酵肉的风味感官品质，对促进人体健康也具有积极作用。

中国专利cn201611245694.0公开了一株弯曲乳杆菌sr6快速发酵低盐型酸肉的方法，该方法中腌制酸肉的食盐添加量为4~6%，发酵时间为1~3个月，含盐量仍然较高且发酵周期较长。中国专利cn201910991609.2公开了一种利用乳酸菌和酵母菌混菌制备发酵羊肉的方法，发酵羊肉的ph值为4.3~4.4，酸度仍然较高（即ph值较低）。

技术实现要素：

本发明的目的是提供酿酒酵母cmrc1y，该菌株可作为用于低盐低酸型酸肉制备的发酵剂。

本发明提供酿酒酵母cmrc1y，该菌株为从自然发酵酸肉中分离获得，具有高效产生蛋白酶和脂肪酶的优良性能，并且耐盐耐酸，能够在酸肉发酵过程中代谢产生大量的醇类、酯类等挥发性风味物质，并可抑制低盐低酸型酸肉中有害菌的生长，适用于作为低盐低酸型酸肉的发酵剂，有利于提高酸肉的感官风味和营养价值。该菌株已于2019年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为酿酒酵母saccharomycescerevisiae，保藏编号为cgmccno.18725。

基于酿酒酵母cmrc1y，本发明提供含有酿酒酵母cmrc1y的微生物制剂。

优选地，所述微生物制剂为菌剂或发酵剂。

本发明所述的微生物制剂可为固体制剂或液体制剂。

优选地，所述微生物制剂为固体制剂，所述固体制剂中，酿酒酵母cmrc1y的有效活菌数≥10⁹cfu/g。

以上所述的固体制剂包括但不限于冻干粉。冻干粉可采用本领域常规方法制备得到。

具体地，所述微生物制剂的制备方法包括将酿酒酵母cmrc1y进行培养后，将菌体与辅料混合的步骤。

所述辅料包括但不限于冻干保护剂。

作为本发明的一种实施方式，所述微生物制剂的制备方法包括如下步骤：

（1）菌体的培养

将酿酒酵母cmrc1y接种于ypd培养基中，接种量为1~2%（v/v），28℃培养20~24h，连续转接培养2次，得到第三代发酵菌液；

（2）微生物制剂的制备

将200ml第三代发酵菌液经4℃、5000rpm、离心15min后，用无菌生理盐水（0.85%氯化钠溶液）洗涤菌体两次，继续经4℃、5000rpm、离心15min后得到的菌体沉淀与等质量的冻干保护剂（每100ml质量浓度为10%的脱脂乳中添加有2g甘油，6g蔗糖，10g海藻糖。）混合，-20℃预冻2h后，置于真空冷冻干燥机中，进行真空干燥（冷阱温度-45℃，真空度10~20pa）22~24h，菌粉含水量降至2.5~3%时停止干燥，即得到干粉形式的菌剂，菌剂中活菌含量为10⁹cfu/g。

本发明进一步提供酿酒酵母cmrc1y或含有酿酒酵母cmrc1y的微生物制剂在低盐发酵肉制品、低酸发酵肉制品或低盐低酸发酵肉制品制备中的应用。

优选地，所述肉制品为酸肉。

本发明提供一种制备低盐低酸型酸肉的方法，其包括利用酿酒酵母cmrc1y或所述微生物制剂发酵原料肉的步骤。

优选地，所述原料肉包括肉和nacl，nacl与肉的质量百分比为2~4%。

为实现低盐酸肉的制备，所述发酵原料肉中nacl的含量更优选为2~3%。

优选地，所述酿酒酵母cmrc1y的加入量为10⁶-10⁸cfu/g肉，所述发酵为在20-25℃进行固态发酵。

具体地，所述制备低盐低酸型酸肉的方法包括如下步骤：

（1）将所述酿酒酵母cmrc1y或所述微生物制剂按照10⁷cfu/g肉的用量与原料肉混匀；

（2）在20-25℃进行固态发酵10-20天。

优选地，所述原料肉包括肉以及占肉质量百分比为2-4%的nacl、占肉质量百分比为0.5-2%的葡萄糖和占肉质量百分比为4-10%的米粉。

更优选地，所述肉为猪肉。

本发明提供利用所述方法制备得到的低盐低酸型酸肉，所述酸肉的ph≥5.0。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明从自然发酵酸肉中分离获得一株酿酒酵母cmrc1y，该菌株能够在肉类环境中生长并代谢产生大量的醇类、酯类等挥发性风味物质，在改善低盐低酸型酸肉风味的同时能够有效抑制有害菌生长。

（2）本发明将酿酒酵母cmrc1y作为发酵剂生产低盐低酸型酸肉，可将氯化钠的最低添加量控制在2%左右，较传统的酸肉发酵中氯化钠的添加量（通常为8~20%）降低了75%以上。在低盐发酵环境下，酿酒酵母cmrc1y不仅能够有效抑制霉菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等有害菌的生长，保证低盐低酸型酸肉的食用安全性，而且还可显著提高醇类和酯类等挥发性风味物质以及游离氨基酸等营养物质的含量，同时降低酸肉的酸度，有利于提高酸肉制品的营养价值、风味和口感，使酸肉制品的风味更丰富且带酒香味，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中酿酒酵母cmrc1y在含不同氯化钠浓度的ypd液体培养基中的生长曲线。

图2为本发明实施例1中酿酒酵母cmrc1y在不同ph值的ypd液体培养基中的生长曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

霉菌检测参照gb4789.15-2016,大肠埃希氏菌检测参照gb4789.38-2012，金黄色葡萄球菌检测参照gb4789.10-2016。

游离氨基酸含量检测参照李平兰，沈清武，等.微生物酶与肉组织酶对干发酵香肠中游离氨基酸的影响[j].食品与发酵工业，2005，31（5）：134-138.中所提供的方法。

挥发性风味物质含量检测参照k.a.gutsche,t.b.tran,r.f.vogel,productionofvolatilecompoundsbylactobacillussakeifrombranchedchainalpha-ketoacids[j].foodmicrobiology,2012,29:224-228.中所提供的方法（spme-gc-ms法）。

ypd液体培养基的组成成分为(1l)：酵母提取物10.0g，蛋白胨20.0g，葡萄糖20.0g。

实施例1酿酒酵母cmrc1y的获得

1、备选菌株获取过程

从湖南地区自然发酵成熟的侗族酸肉中，无菌获取肉样25g，加入225ml无菌生理盐水，均质2min后进行不同浓度稀释。将不同稀释度菌悬液均匀涂布于pda固体培养基上，28℃培养48h后，从最高稀释度的培养平板上随机挑取表面光滑、呈乳白色的菌落70个，转接到ypd液体培养基中，得到酵母70株。

将菌株经过多次纯化后，在无菌条件下，将备选菌株培养液均匀涂布于添加有2%脱脂奶粉的pda固体培养基上，28℃培养48h后筛选出高蛋白酶活性（透明圈直径>5mm）菌株26株。

在无菌条件下，将筛选出的26株高蛋白酶活性备选菌株培养液，均匀涂布于添加有1%三丁酸甘油酯的pda固体培养基上，28℃培养48h后筛选出透明圈直径最大的菌株，即为具有高蛋白酶和高脂肪酶活性的菌株cmrc1y。

2、耐盐性试验

将cmrc1y菌株按10⁶cfu/ml分别接种于不同氯化钠浓度（0%、10%、15%）的ypd液体培养基中，并放于恒温培养箱中28℃培养72小时，期间连续检测波长600nm下的吸光值度（od600）。培养24小时后，菌株吸光值相对恒定直至培养结束。从图1中可知，当氯化钠浓度从0%升高至10%或15%时，菌株的吸光值下降较大，然而当氯化钠浓度为10%时，虽然吸光值下降，但酵母活菌数量级为10⁷cfu/ml，满足作为酸肉发酵剂的需要。

3、耐酸性试验

将cmrc1y菌株按10⁶cfu/ml分别接种于不同ph值（3.0、5.0、7.0）的ypd液体培养基中，并放于恒温培养箱中28℃培养3天，期间连续检测波长600nm下的吸光度（od600）。从图2中可知，随着ph值的降低，菌株的生长没有受到显著影响。满足作为酸肉发酵剂的需要。

4、种属鉴定

采用生物梅里埃公司vitek2型全自动微生物鉴定仪进行生理生化鉴定，经鉴定该菌株属于酿酒酵母。同时，对菌株的its序列进行测定，该菌株的its序列（如seqidno.1所示）与酿酒酵母ku535607.1的同源性为99.13%。

经形态学、生理生化性质和分子生物学鉴定，cmrc1y菌株为酿酒酵母（saccharomycescerevisiae），该菌株已于2019年10月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为酿酒酵母saccharomycescerevisiae，保藏编号为cgmccno.18725。

实施例2酿酒酵母cmrc1y发酵低盐低酸型酸肉的方法

1、酵母发酵剂菌粉的制备

将酿酒酵母cmrc1y接种于ypd培养基中，接种量为1~2%（v/v），28℃培养20~24h，连续转接培养2次，得到第三代发酵菌液；将200ml第三代发酵菌液经4℃、5000rpm、离心15min后，用无菌生理盐水（0.85%氯化钠溶液）洗涤菌体两次，继续经4℃、5000rpm、离心15min后得到的菌体沉淀与等质量的冻干保护剂（每100ml质量浓度为10%的脱脂乳中添加有2g甘油，6g蔗糖，10g海藻糖。）混合，-20℃预冻2h后，置于真空冷冻干燥机中，进行真空干燥（冷阱温度-45℃，真空度10~20pa）22~24h，菌粉含水量降至2.5~3%时停止干燥，即得到干粉形式的菌剂，菌剂中活菌含量为10⁹cfu/g。

2、低盐低酸型酸肉的生产

选取肥瘦相当的猪五花肉，切成长5cm、宽4cm、厚1cm的肉条；添加占猪肉总质量2%的食盐、1%的葡萄糖和8%的米粉；酿酒酵母cmrc1y菌粉用占猪肉总质量1%的无菌水溶解后，均匀接种于猪肉表面，接种量为10⁷cfu/g猪肉。上述材料混合均匀后，将肉一条挨着一条压紧实，铺于经无菌处理的发酵坛中，装至坛容量的95%，用封口膜封口后置于25℃发酵20天。

酸肉ph和微生物检测结果如表1所示。结果表明，与未添加发酵剂的酸肉相比，酵母发酵剂的添加可提高酸肉ph值，降低酸度，改善口感，同时高效抑制低盐型酸肉中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的生长，保证食用安全性。

表1酵母发酵剂对低盐酸肉（食盐添加量2%）中ph和微生物的影响

挥发性风味物质的检测结果如表2所示。结果表明，与未添加发酵剂的酸肉相比，酵母发酵剂的添加使低盐型酸肉中挥发性风味化合物种类数量略有增加（其中，挥发性风味化合物的具体种类也较未添加酵母的低盐酸肉发生了明显改变），同时将酸肉中挥发性风味物质的总含量提高了4.32倍，其中支链醇类、酯类风味化合物的含量分别提高了19.75、10.26倍。

表2酵母发酵剂对低盐酸肉（食盐添加量2%）中挥发性风味物质种类和含量的影响

游离氨基酸的检测结果如表3所示。结果表明，与未添加发酵剂的酸肉相比，酵母发酵剂的添加将低盐型酸肉中游离氨基酸总含量提高了24%。

表3酵母发酵剂对低盐酸肉（食盐添加量2%）中游离氨基酸含量的影响

实施例3酵母菌cmrc1y不同接种量下的酸肉发酵工艺

以上述实施例中筛选得到的酿酒酵母cmrc1y为发酵剂，以发酵酸肉的感官风味评价得分和游离氨基酸总含量为指标进行酿酒酵母cmrc1y接种量的优化实验，具体如下：

选取肥瘦相当的猪五花肉，切成长5cm、宽4cm、厚1cm的肉条；添加占猪肉总质量2%的食盐、1%的葡萄糖和8%的米粉；酿酒酵母菌粉用占猪肉总质量1%的无菌水溶解后，均匀接种于猪肉表面，接种量分别为10⁶cfu/g、10⁷cfu/g、10⁸cfu/g猪肉。上述材料混合均匀后，将肉一条挨着一条压紧实，铺于经无菌处理的发酵坛中，装至坛容量的95%，用封口膜封口后置于25℃发酵20天。

感官风味评价标注：规定酸肉所带有的酒香味等发酵香气最浓且没有令人不愉快的气味为5分，酒香味等发酵香气越淡或有不愉快的气味则分值越低；规定酸肉滋味具有令人愉悦的发酵味道且酸度适宜的为5分，发酵味道越淡或口感越酸则分值越低。对感官风味进行评价时，将试验分为对照组和试验组，其中对照组为未添加酵母的低盐酸肉，试验组则接种了不同数量的酵母菌cmrc1y进行发酵。对结果的评定主要通过不同性别、不同年龄段的人进行嗅觉感官评定。各组参与气味评价的人数为15人，男女比例均为1：1，年龄在25~40之间。

结果见表4，不同酵母菌接种量的低盐酸肉气味和滋味评价平均分均高于未接菌的低盐酸肉；不同酵母菌接种量的低盐酸肉制品的风味更丰富且带酒香味；添加酵母菌的酸肉游离氨基酸总含量均高于未接菌的酸肉，酵母接种量达到10⁶cfu/g猪肉及以上时，游离氨基酸总含量即可超过8g/kg酸肉。

表4不同酵母发酵剂接种量对低盐酸肉（食盐添加量2%）中游离氨基酸和感官风味评分的影响

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>中国肉类食品综合研究中心

<120>用于低盐低酸型酸肉制备的酿酒酵母cmrc1y及其应用

<130>khp201111686.6

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>818

<212>dna