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您当前的位置： 一种含双歧杆菌益生菌的发酵乳制品及其制备方法与应用与流程
2021-01-07 10:01:18|
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起点商标网 本发明涉及一种含双歧杆菌益生菌的发酵乳制品及其制备方法与应用，具体是指一种含乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)的发酵乳制品及其在预防骨质疏松等方面的应用，所述的发酵乳制品含双歧杆菌且活菌含量高，风味浓郁，组织状态稳定，适合商业化应用。
背景技术：
：发酵乳产品因其独特的风味、良好的口感已经越来越受到消费者的喜欢，产品不仅美味可口，更因其含有的活性益生菌，可以调节肠道微生物菌群，改善便秘情况，降血脂降胆固醇提高机体免疫能力而受到人们的青睐，因此，开发出高益生菌含量的发酵乳产品将增加产品的市场竞争力。发酵乳是指以生牛(羊)乳或乳粉为原料，经杀菌、发酵后制成的ph值降低的产品，目前，市场上的发酵乳产品均为基础菌株+益生菌的发酵剂搭配，即基础菌保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，益生菌通常为双歧杆菌和嗜酸乳杆菌等，基础菌保证了产品的发酵时间及组织状态，添加益生菌保证了产品的益生功能。添加的益生菌需保证菌种在产品中的活菌数，从而确保益生功能效果，同时需满足添加的益生菌不影响产品发酵及产品组织状态，保证产品在保质期内的稳定性。技术实现要素：本发明提供了一种新颖的乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)，并据此提供了一种含所述乳双歧杆菌的发酵乳制品。一方面，本发明提供了一种乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)，将其命名为bl-99。该菌株已于2018年04月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心cgmcc(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名：乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)；保藏编号为cgmccno.15650。本发明的乳双歧杆菌bl-99(即保藏编号为cgmccno.15650的乳双歧杆菌)具有耐胃酸和耐肠液性能，在ph2.5的胃酸液中处理30min时活菌存活率62％以上，处理2小时活菌存活率61％以上；在ph6.8的小肠液中处理2小时活菌存活率70％以上。本发明的乳双歧杆菌bl-99具有促进肠道双歧杆菌和乳酸菌增长的能力。并且，研究表明，bl-99死菌对致病菌例如幽门螺旋杆菌、埃希氏菌-志贺菌属的抑制效果优于活菌。此外，小鼠实验表明该菌株无口服急性毒性，无抗生素耐受，安全可以用于食品加工。本发明的乳双歧杆菌bl-99，其可在领域中常用的乳双歧杆菌培养基(例如tpy培养基、bbl培养基等)中厌氧发酵培养。最佳发酵温度35～38℃，最佳发酵时间7～24h。乳双歧杆菌bl-99活性菌粉的活力可达1×1011cfu/g以上。进一步，本发明提供了一种含双歧杆菌益生菌的发酵乳制品，其是以生鲜乳或复原乳为原料，添加或不添加其它原料作为发酵底物，经杀菌、接种包括保藏编号cgmccno.15650的乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)的发酵剂菌种发酵而制成的发酵乳或风味发酵乳。根据本发明的具体实施方案，本发明的发酵乳制品，保藏编号cgmccno.15650的乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)在发酵底物中的添加量为0.001％～0.01％。根据本发明的具体实施方案，本发明的发酵乳制品中，所述发酵剂菌种还可包括保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、乳球菌、嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌中的一种或多种。这些菌种的具体用量可按照所属领域的常规操作进行。根据本发明的具体实施方案，本发明的发酵乳制品中，以发酵底物的总重量为1000重量份计，发酵底物的原料组成包括：800～900kg原料乳，白砂糖50～80kg，稳定剂0～10kg，麦芽提取物1～10kg，水余量。根据本发明的具体实施方案，本发明的发酵乳制品中，以发酵底物的总重量为100％计，所述稳定剂包括琼脂0.03％～0.1％，果胶0.04％～0.15％，结冷胶0.02％～0.08％。根据本发明的具体实施方案，本发明的发酵乳制品，其蛋白质含量≥2.3％，脂肪含量≥2.5％。优选地，发酵乳制品中bl-99活菌数为≥1×106cfu/g。另一方面，本发明还提供了制备所述的发酵乳制品的方法，该方法包括：以生鲜乳或复原乳为原料，添加或不添加其它原料作为发酵底物，经杀菌、接种包括保藏编号cgmccno.15650的乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)的发酵剂菌种，40℃～43℃发酵4～8小时，停止发酵，制成发酵乳或风味发酵乳。根据本发明的具体实施方案，本发明的发酵乳制品的制备方法还可进一步包括停止发酵后向发酵后的物料中添加水果再制品和/或谷物制品的过程。在本发明的一些具体实施方案中，本发明的发酵乳制品的制备方法包括以下步骤：1)对原料乳进行标准化处理；2)将白砂糖、稳定剂、麦芽提取物等添加到原料乳中，定容、循环搅拌20～30min；3)对步骤2)所得混合物料进行脱气、均质和杀菌；4)冷却至40℃～43℃，加入发酵剂；5)发酵4～8小时，制得发酵乳。6)发酵后酸奶可破乳进一步添加水果再制品和/或谷物制品等。进一步地，在本发明的发酵乳制品的制备方法中，均质时，均质压力为30～40/160～180bar。进一步地，在本发明的发酵乳制品的制备方法中，配料后的混合物料杀菌时，杀菌温度为95±5℃/300s。另一方面，本发明还提供了所述的发酵乳制品作为具有预防骨质疏松功效的发酵乳制品中的应用。本发明的酵乳制品中的乳双歧杆菌bl-99可以用于预防骨质疏松，并具有提高血液的钙离子和/或磷离子浓度的功效。另一方面，本发明还提供了所述的发酵乳制品作为具有调节胃肠道菌群平衡功效和/或提高免疫力功效的发酵乳制品中的应用。本发明的发酵乳制品中的乳双歧杆菌bl-99能够促进肠道双歧杆菌和乳酸菌增长。本发明的发酵乳制品，在保证产品组织状态良好的前提下，能保持产品中较高的益生菌活菌数。由于双歧杆菌bl-99发酵过程中会代谢利用淀粉，分解产生葡萄糖，进而影响产品发酵体系，因此本发明在产品稳定体系中需避免添加淀粉，但为了保证产品口感及稳定性，单纯添加果胶、琼脂等稳定剂，添加量增大会影响发酵，因此开发了果胶、琼脂和结冷胶复配的稳定剂方案保证产品状态及口感，同时为了保证产品中双歧杆菌bl-99益生菌增值，添加麦芽提取物，而不是通常的低聚糖益生元保证产品中的活菌数。专利程序的微生物保存：本发明的乳双歧杆菌bl-99：保藏日期：2018年04月26日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏编号：cgmccno.15650；分类命名：乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)。具体实施方式为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例及对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或者按照仪器制造商所建议的条件。本发明的以下各实施例中，实验数据表示为mean±s.e.m.。数据采用prismversion5.0(graphpad,sandiego,ca,usa)进行统计。组间差异采用one-wayanova跟随tukery’smultiplecomparisontest的方法进行统计。p<0.05时具有显著的统计学差异。实施例1：乳双歧杆菌bl-99及其性能测定本发明的乳双歧杆菌bl-99，来自上海交大昂立股份有限公司，是自婴儿肠道中分离得到的。该菌株已于2018年04月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)(保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名：乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)；保藏编号为cgmccno.15650。1.乳双歧杆菌bl-99的分类学特征理化试验结果参见表1。表12.乳双歧杆菌bl-99的人工胃液、肠液耐受性测试本发明的乳双歧杆菌bl-99的人工胃液、肠液耐受性，同时以目前领域中公认耐酸性能极好、可以通过胃肠道存活的乳双歧杆菌bb-作为对比。将待测菌株分别在人工胃液、人工小肠液中培养，37℃处理0、30min、2h后进行活菌计数分析，以存活率评价菌株的耐酸及耐肠液性能。存活率＝(处理后的活菌数/0时刻活菌数)×100％。菌株在人工胃酸(ph2.5)中的存活率检测结果如表2所示。表2、菌株在人工胃酸(ph2.5)中的存活率菌株在人工小肠液(ph6.8)中的存活率检测结果参见表3。表3、菌株在人工小肠液(ph6.8)中的存活率3.乳双歧杆菌bl-99的的毒力实验及安全性检测将本发明的乳双歧杆菌bl-99接种于bbl液体培养基中，36±1℃厌氧培养48±2小时，计数培养液中乳双歧杆菌bl-99活菌数为3.7×108cfu/ml，将培养物的原液和5倍浓缩液，经口以20.0ml/kgbw给受试小鼠连续灌胃3天，观察7天。试验设培养基原液和5倍浓缩液对照组。试验结果表明：乳双歧杆菌bl-99的bbl培养物原液和5倍浓缩液组与各自对照组相比，对小鼠体重增长的影响无统计学意义(p＞0.05)，同时未观察到受试小鼠有毒性反应或死亡。采用sn/t1944-2007《动物及其制品中细菌耐药性的测定》方法，评估乳双歧杆菌bl-99的抗生素敏感性能。评价结果显示，乳双歧杆菌bl-99对氨苄西林ampicillin、青霉素gpenicilling、红霉素erythromycin、氯霉素chloramphenicol、克林霉素clindamycin、万古霉素vancomycin和四环素tetracycline等敏感。符合欧洲食品安全委员会(europeanfoodsafetyauthority)对食用细菌耐药性评价规范中的要求。乳双歧杆菌bl-99不含外源抗生素耐药基因，食用安全。4.肠道菌群调节效果本研究中，分别检测了不同剂量活性乳双歧杆菌bl-99及灭活菌种的肠道菌群调节效果。活菌样品：依据样品规格，称取1g活菌样品，使用pbs溶液悬浮至40ml，即活菌浓度均为2.5x109cfu/ml。高剂量组：按照小鼠0.2ml/10g灌胃量计算，20g小鼠灌胃量为0.4ml，高剂量组小鼠灌胃剂量为109cfu/20g。中剂量组：分别取5ml高剂量悬浮液加入pbs定容至50ml，按照小鼠0.2ml/10g灌胃量计算，20g小鼠灌胃量为0.4ml，中剂量组小鼠灌胃剂量为108cfu/20g。低剂量组：分别取5ml中剂量组悬浮液加入pbs定容至50ml，按照小鼠0.2ml/10g灌胃量计算，20g小鼠灌胃量为0.4ml，低剂量组小鼠灌胃剂量为107cfu/20g。死菌样品：依据样品规格，称取1g活菌样品，使用pbs溶液悬浮至40ml，即活菌浓度为2.5x109cfu/ml。将浓度为2.5x109cfu/ml的活菌样品菌液100℃热杀死20min。其高、中、低剂量组样品配置方法与上述活菌组相同。6周龄babl/c小鼠饲养于清洁级动物房，温度22℃，湿度10～60％，12小时明暗交替照明，标准饲料喂养，自由饮水。适应性喂养5天，182只小鼠随机分为13组，每组14只，分组情况见表4。表4、调节肠道菌群实验分组开始灌胃前，无菌条件下采集每只小鼠粪便，标记，-20℃保存，检测肠道菌群。实验按照0.2ml/10g灌胃量给予各受试物，对照组1～14天给予pbs，实验组分别依据表11灌胃给予相应剂量的受试物。小鼠每周称重一次，根据体重调整灌胃量。14天后无菌条件下采集每只小鼠粪便，标记，-20℃保存，检测肠道菌群。实验前后，各组小鼠体重无显著差异。在门的水平，补充不同剂量的益生菌后，小鼠肠道菌群中厚壁菌门(firmicutes)相对丰度增加而拟杆菌门(bacteroidetes)、变形菌门(proteobacteria)相对丰度降低。研究表明，厚壁菌门与拟杆菌门的比值与人体肠道疾病具有较强的相关性，肥胖病人倾向于二者比值降低。而肠炎、肠应激综合症患者则倾向于具有较高的变形菌门(proteobacteria)丰度。bl-99在属的水平对肠道菌群的影响参见表5。表5、bl-99对肠道菌群的影响在属的水平，控制组相比，益生菌组小鼠肠道菌群中bl-99可显著增加小鼠肠道中的乳酸杆菌属(lactobacillus)相对丰度，且bl-99低剂量组对乳酸杆菌(lactobacillus)的增加程度最为显著。而bl-99死菌高剂量组对脱硫弧菌(desulfovibrio)、肠杆菌属(enterorhabdus)具有显著抑制作用。bl-99对致病菌幽门螺杆菌、埃希氏菌-志贺氏菌属的抑制效果参见表6。表6、bl-99对致病菌的抑制效果实施例2：含双歧杆菌bl-99的益生菌发酵乳及其制备方法本实施例的含双歧杆菌bl-99的益生菌发酵乳，每1000kg产品中含有以下成分：本实施例的含双歧杆菌bl-99的益生菌发酵乳的制作方法包括：1)对原料奶进行标准化处理；2)将白砂糖、稳定剂、麦芽提取物等添加到原料乳中，定容、循环搅拌30min；3)对步骤2)所得混合物料进行脱气、均质和杀菌；4)冷却至42℃，加入发酵剂；5)发酵4～8小时，制得发酵乳。对比例1制作工艺：1)对原料奶进行标准化处理；2)将白砂糖、稳定剂、麦芽提取物等添加到原料乳中，定容、循环搅拌30min；3)对步骤2)所得混合物料进行脱气、均质和杀菌；4)冷却至42℃，加入发酵剂；5)发酵4～8小时，制得发酵乳。对比例21000kg产品中含有以下成分：制作工艺：1)对原料奶进行标准化处理；2)将白砂糖、稳定剂、麦芽提取物等添加到原料乳中，定容、循环搅拌30min；3)对步骤2)所得混合物料进行脱气、均质和杀菌；4)冷却至42℃，加入发酵剂；5)发酵4～8小时，制得发酵乳。对比例31000kg产品中含有以下成分：制作工艺：1)对原料奶进行标准化处理；2)将白砂糖、稳定剂、麦芽提取物等添加到原料乳中，定容、循环搅拌30min；3)对步骤2)所得混合物料进行脱气、均质和杀菌；4)冷却至42℃，加入发酵剂；5)发酵4～8小时，制得发酵乳。对比例4制作工艺：1)对原料奶进行标准化处理；2)将白砂糖、稳定剂、麦芽提取物等添加到原料乳中，定容、循环搅拌30min；3)对步骤2)所得混合物料进行脱气、均质和杀菌；4)冷却至42℃，加入发酵剂；5)发酵4～8小时，制得发酵乳。对比例51000kg产品中含有以下成分：制作工艺：1)对原料奶进行标准化处理；2)将白砂糖、稳定剂、麦芽提取物等添加到原料乳中，定容、循环搅拌30min；3)对步骤2)所得混合物料进行脱气、均质和杀菌；4)冷却至42℃，加入发酵剂；5)发酵4～8小时，制得发酵乳。将实施例2和对比例所得产品为样品进行稳定性考察试验，观察贮藏期间组织状态、风味、口感变化。结果参见表7、表8。表7、保质期稳定性表8、双歧杆菌bl-99活菌数观测天数实施例2(cfu/g)对比例4(cfu/g)对比例5(cfu/g)1d8.9×1062.6×1062.8×1067d5.8×1061.9×1062.1×10614d5.3×1061.7×1061.9×10621d4.9×1061.5×1061.6×106从表7、表8中对比可以看出，实施例样品在保质期内稳定性及口感优于对比例1、2、3。同时，添加麦芽提取物，相比其他低聚糖益生菌，对双歧杆菌的增值作用有很好的效果。当前第1页1 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：发酵乳产品因其独特的风味、良好的口感已经越来越受到消费者的喜欢，产品不仅美味可口，更因其含有的活性益生菌，可以调节肠道微生物菌群，改善便秘情况，降血脂降胆固醇提高机体免疫能力而受到人们的青睐，因此，开发出高益生菌含量的发酵乳产品将增加产品的市场竞争力。发酵乳是指以生牛(羊)乳或乳粉为原料，经杀菌、发酵后制成的ph值降低的产品，目前，市场上的发酵乳产品均为基础菌株+益生菌的发酵剂搭配，即基础菌保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，益生菌通常为双歧杆菌和嗜酸乳杆菌等，基础菌保证了产品的发酵时间及组织状态，添加益生菌保证了产品的益生功能。添加的益生菌需保证菌种在产品中的活菌数，从而确保益生功能效果，同时需满足添加的益生菌不影响产品发酵及产品组织状态，保证产品在保质期内的稳定性。技术实现要素：本发明提供了一种新颖的乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)，并据此提供了一种含所述乳双歧杆菌的发酵乳制品。一方面，本发明提供了一种乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)，将其命名为bl-99。该菌株已于2018年04月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心cgmcc(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名：乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)；保藏编号为cgmccno.15650。本发明的乳双歧杆菌bl-99(即保藏编号为cgmccno.15650的乳双歧杆菌)具有耐胃酸和耐肠液性能，在ph2.5的胃酸液中处理30min时活菌存活率62％以上，处理2小时活菌存活率61％以上；在ph6.8的小肠液中处理2小时活菌存活率70％以上。本发明的乳双歧杆菌bl-99具有促进肠道双歧杆菌和乳酸菌增长的能力。并且，研究表明，bl-99死菌对致病菌例如幽门螺旋杆菌、埃希氏菌-志贺菌属的抑制效果优于活菌。此外，小鼠实验表明该菌株无口服急性毒性，无抗生素耐受，安全可以用于食品加工。本发明的乳双歧杆菌bl-99，其可在领域中常用的乳双歧杆菌培养基(例如tpy培养基、bbl培养基等)中厌氧发酵培养。最佳发酵温度35～38℃，最佳发酵时间7～24h。乳双歧杆菌bl-99活性菌粉的活力可达1×1011cfu/g以上。进一步，本发明提供了一种含双歧杆菌益生菌的发酵乳制品，其是以生鲜乳或复原乳为原料，添加或不添加其它原料作为发酵底物，经杀菌、接种包括保藏编号cgmccno.15650的乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)的发酵剂菌种发酵而制成的发酵乳或风味发酵乳。根据本发明的具体实施方案，本发明的发酵乳制品，保藏编号cgmccno.15650的乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)在发酵底物中的添加量为0.001％～0.01％。根据本发明的具体实施方案，本发明的发酵乳制品中，所述发酵剂菌种还可包括保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、乳球菌、嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和鼠李糖乳杆菌中的一种或多种。这些菌种的具体用量可按照所属领域的常规操作进行。根据本发明的具体实施方案，本发明的发酵乳制品中，以发酵底物的总重量为1000重量份计，发酵底物的原料组成包括：800～900kg原料乳，白砂糖50～80kg，稳定剂0～10kg，麦芽提取物1～10kg，水余量。根据本发明的具体实施方案，本发明的发酵乳制品中，以发酵底物的总重量为100％计，所述稳定剂包括琼脂0.03％～0.1％，果胶0.04％～0.15％，结冷胶0.02％～0.08％。根据本发明的具体实施方案，本发明的发酵乳制品，其蛋白质含量≥2.3％，脂肪含量≥2.5％。优选地，发酵乳制品中bl-99活菌数为≥1×106cfu/g。另一方面，本发明还提供了制备所述的发酵乳制品的方法，该方法包括：以生鲜乳或复原乳为原料，添加或不添加其它原料作为发酵底物，经杀菌、接种包括保藏编号cgmccno.15650的乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)的发酵剂菌种，40℃～43℃发酵4～8小时，停止发酵，制成发酵乳或风味发酵乳。根据本发明的具体实施方案，本发明的发酵乳制品的制备方法还可进一步包括停止发酵后向发酵后的物料中添加水果再制品和/或谷物制品的过程。在本发明的一些具体实施方案中，本发明的发酵乳制品的制备方法包括以下步骤：1)对原料乳进行标准化处理；2)将白砂糖、稳定剂、麦芽提取物等添加到原料乳中，定容、循环搅拌20～30min；3)对步骤2)所得混合物料进行脱气、均质和杀菌；4)冷却至40℃～43℃，加入发酵剂；5)发酵4～8小时，制得发酵乳。6)发酵后酸奶可破乳进一步添加水果再制品和/或谷物制品等。进一步地，在本发明的发酵乳制品的制备方法中，均质时，均质压力为30～40/160～180bar。进一步地，在本发明的发酵乳制品的制备方法中，配料后的混合物料杀菌时，杀菌温度为95±5℃/300s。另一方面，本发明还提供了所述的发酵乳制品作为具有预防骨质疏松功效的发酵乳制品中的应用。本发明的酵乳制品中的乳双歧杆菌bl-99可以用于预防骨质疏松，并具有提高血液的钙离子和/或磷离子浓度的功效。另一方面，本发明还提供了所述的发酵乳制品作为具有调节胃肠道菌群平衡功效和/或提高免疫力功效的发酵乳制品中的应用。本发明的发酵乳制品中的乳双歧杆菌bl-99能够促进肠道双歧杆菌和乳酸菌增长。本发明的发酵乳制品，在保证产品组织状态良好的前提下，能保持产品中较高的益生菌活菌数。由于双歧杆菌bl-99发酵过程中会代谢利用淀粉，分解产生葡萄糖，进而影响产品发酵体系，因此本发明在产品稳定体系中需避免添加淀粉，但为了保证产品口感及稳定性，单纯添加果胶、琼脂等稳定剂，添加量增大会影响发酵，因此开发了果胶、琼脂和结冷胶复配的稳定剂方案保证产品状态及口感，同时为了保证产品中双歧杆菌bl-99益生菌增值，添加麦芽提取物，而不是通常的低聚糖益生元保证产品中的活菌数。专利程序的微生物保存：本发明的乳双歧杆菌bl-99：保藏日期：2018年04月26日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏编号：cgmccno.15650；分类命名：乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)。具体实施方式为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例及对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或者按照仪器制造商所建议的条件。本发明的以下各实施例中，实验数据表示为mean±s.e.m.。数据采用prismversion5.0(graphpad,sandiego,ca,usa)进行统计。组间差异采用one-wayanova跟随tukery’smultiplecomparisontest的方法进行统计。p<0.05时具有显著的统计学差异。实施例1：乳双歧杆菌bl-99及其性能测定本发明的乳双歧杆菌bl-99，来自上海交大昂立股份有限公司，是自婴儿肠道中分离得到的。该菌株已于2018年04月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)(保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，分类命名：乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)；保藏编号为cgmccno.15650。1.乳双歧杆菌bl-99的分类学特征理化试验结果参见表1。表12.乳双歧杆菌bl-99的人工胃液、肠液耐受性测试本发明的乳双歧杆菌bl-99的人工胃液、肠液耐受性，同时以目前领域中公认耐酸性能极好、可以通过胃肠道存活的乳双歧杆菌bb-作为对比。将待测菌株分别在人工胃液、人工小肠液中培养，37℃处理0、30min、2h后进行活菌计数分析，以存活率评价菌株的耐酸及耐肠液性能。存活率＝(处理后的活菌数/0时刻活菌数)×100％。菌株在人工胃酸(ph2.5)中的存活率检测结果如表2所示。表2、菌株在人工胃酸(ph2.5)中的存活率菌株在人工小肠液(ph6.8)中的存活率检测结果参见表3。表3、菌株在人工小肠液(ph6.8)中的存活率3.乳双歧杆菌bl-99的的毒力实验及安全性检测将本发明的乳双歧杆菌bl-99接种于bbl液体培养基中，36±1℃厌氧培养48±2小时，计数培养液中乳双歧杆菌bl-99活菌数为3.7×108cfu/ml，将培养物的原液和5倍浓缩液，经口以20.0ml/kgbw给受试小鼠连续灌胃3天，观察7天。试验设培养基原液和5倍浓缩液对照组。试验结果表明：乳双歧杆菌bl-99的bbl培养物原液和5倍浓缩液组与各自对照组相比，对小鼠体重增长的影响无统计学意义(p＞0.05)，同时未观察到受试小鼠有毒性反应或死亡。采用sn/t1944-2007《动物及其制品中细菌耐药性的测定》方法，评估乳双歧杆菌bl-99的抗生素敏感性能。评价结果显示，乳双歧杆菌bl-99对氨苄西林ampicillin、青霉素gpenicilling、红霉素erythromycin、氯霉素chloramphenicol、克林霉素clindamycin、万古霉素vancomycin和四环素tetracycline等敏感。符合欧洲食品安全委员会(europeanfoodsafetyauthority)对食用细菌耐药性评价规范中的要求。乳双歧杆菌bl-99不含外源抗生素耐药基因，食用安全。4.肠道菌群调节效果本研究中，分别检测了不同剂量活性乳双歧杆菌bl-99及灭活菌种的肠道菌群调节效果。活菌样品：依据样品规格，称取1g活菌样品，使用pbs溶液悬浮至40ml，即活菌浓度均为2.5x109cfu/ml。高剂量组：按照小鼠0.2ml/10g灌胃量计算，20g小鼠灌胃量为0.4ml，高剂量组小鼠灌胃剂量为109cfu/20g。中剂量组：分别取5ml高剂量悬浮液加入pbs定容至50ml，按照小鼠0.2ml/10g灌胃量计算，20g小鼠灌胃量为0.4ml，中剂量组小鼠灌胃剂量为108cfu/20g。低剂量组：分别取5ml中剂量组悬浮液加入pbs定容至50ml，按照小鼠0.2ml/10g灌胃量计算，20g小鼠灌胃量为0.4ml，低剂量组小鼠灌胃剂量为107cfu/20g。死菌样品：依据样品规格，称取1g活菌样品，使用pbs溶液悬浮至40ml，即活菌浓度为2.5x109cfu/ml。将浓度为2.5x109cfu/ml的活菌样品菌液100℃热杀死20min。其高、中、低剂量组样品配置方法与上述活菌组相同。6周龄babl/c小鼠饲养于清洁级动物房，温度22℃，湿度10～60％，12小时明暗交替照明，标准饲料喂养，自由饮水。适应性喂养5天，182只小鼠随机分为13组，每组14只，分组情况见表4。表4、调节肠道菌群实验分组开始灌胃前，无菌条件下采集每只小鼠粪便，标记，-20℃保存，检测肠道菌群。实验按照0.2ml/10g灌胃量给予各受试物，对照组1～14天给予pbs，实验组分别依据表11灌胃给予相应剂量的受试物。小鼠每周称重一次，根据体重调整灌胃量。14天后无菌条件下采集每只小鼠粪便，标记，-20℃保存，检测肠道菌群。实验前后，各组小鼠体重无显著差异。在门的水平，补充不同剂量的益生菌后，小鼠肠道菌群中厚壁菌门(firmicutes)相对丰度增加而拟杆菌门(bacteroidetes)、变形菌门(proteobacteria)相对丰度降低。研究表明，厚壁菌门与拟杆菌门的比值与人体肠道疾病具有较强的相关性，肥胖病人倾向于二者比值降低。而肠炎、肠应激综合症患者则倾向于具有较高的变形菌门(proteobacteria)丰度。bl-99在属的水平对肠道菌群的影响参见表5。表5、bl-99对肠道菌群的影响在属的水平，控制组相比，益生菌组小鼠肠道菌群中bl-99可显著增加小鼠肠道中的乳酸杆菌属(lactobacillus)相对丰度，且bl-99低剂量组对乳酸杆菌(lactobacillus)的增加程度最为显著。而bl-99死菌高剂量组对脱硫弧菌(desulfovibrio)、肠杆菌属(enterorhabdus)具有显著抑制作用。bl-99对致病菌幽门螺杆菌、埃希氏菌-志贺氏菌属的抑制效果参见表6。表6、bl-99对致病菌的抑制效果实施例2：含双歧杆菌bl-99的益生菌发酵乳及其制备方法本实施例的含双歧杆菌bl-99的益生菌发酵乳，每1000kg产品中含有以下成分：本实施例的含双歧杆菌bl-99的益生菌发酵乳的制作方法包括：1)对原料奶进行标准化处理；2)将白砂糖、稳定剂、麦芽提取物等添加到原料乳中，定容、循环搅拌30min；3)对步骤2)所得混合物料进行脱气、均质和杀菌；4)冷却至42℃，加入发酵剂；5)发酵4～8小时，制得发酵乳。对比例1制作工艺：1)对原料奶进行标准化处理；2)将白砂糖、稳定剂、麦芽提取物等添加到原料乳中，定容、循环搅拌30min；3)对步骤2)所得混合物料进行脱气、均质和杀菌；4)冷却至42℃，加入发酵剂；5)发酵4～8小时，制得发酵乳。对比例21000kg产品中含有以下成分：制作工艺：1)对原料奶进行标准化处理；2)将白砂糖、稳定剂、麦芽提取物等添加到原料乳中，定容、循环搅拌30min；3)对步骤2)所得混合物料进行脱气、均质和杀菌；4)冷却至42℃，加入发酵剂；5)发酵4～8小时，制得发酵乳。对比例31000kg产品中含有以下成分：制作工艺：1)对原料奶进行标准化处理；2)将白砂糖、稳定剂、麦芽提取物等添加到原料乳中，定容、循环搅拌30min；3)对步骤2)所得混合物料进行脱气、均质和杀菌；4)冷却至42℃，加入发酵剂；5)发酵4～8小时，制得发酵乳。对比例4制作工艺：1)对原料奶进行标准化处理；2)将白砂糖、稳定剂、麦芽提取物等添加到原料乳中，定容、循环搅拌30min；3)对步骤2)所得混合物料进行脱气、均质和杀菌；4)冷却至42℃，加入发酵剂；5)发酵4～8小时，制得发酵乳。对比例51000kg产品中含有以下成分：制作工艺：1)对原料奶进行标准化处理；2)将白砂糖、稳定剂、麦芽提取物等添加到原料乳中，定容、循环搅拌30min；3)对步骤2)所得混合物料进行脱气、均质和杀菌；4)冷却至42℃，加入发酵剂；5)发酵4～8小时，制得发酵乳。将实施例2和对比例所得产品为样品进行稳定性考察试验，观察贮藏期间组织状态、风味、口感变化。结果参见表7、表8。表7、保质期稳定性表8、双歧杆菌bl-99活菌数观测天数实施例2(cfu/g)对比例4(cfu/g)对比例5(cfu/g)1d8.9×1062.6×1062.8×1067d5.8×1061.9×1062.1×10614d5.3×1061.7×1061.9×10621d4.9×1061.5×1061.6×106从表7、表8中对比可以看出，实施例样品在保质期内稳定性及口感优于对比例1、2、3。同时，添加麦芽提取物，相比其他低聚糖益生菌，对双歧杆菌的增值作用有很好的效果。当前第1页1 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