左旋L-半胱氨酸在治疗原发性闭角型青光眼中的应用的制作方法

2021-01-08 12:01:43|

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本发明涉及青光眼治疗技术领域，具体而言，涉及左旋l-半胱氨酸在治疗原发性闭角型青光眼中的应用。

背景技术：

青光眼(glaucoma)是一组以视神经凹陷性萎缩和视野缺损为共同特征的疾病，病理性眼压增高是青光眼视神经病变的主要危险因素病，视神经对压力损害的耐受性也与青光眼的发生和发展有关。临床上将青光眼分为原发性、继发性和先天性三大类。原发性青光眼根据眼压升高时前房角的状态，分为闭角型青光眼和开角型青光眼。原发性闭角型青光眼(primaryangleclosureglaucomapacg)是由于周边虹膜堵塞小梁网，或与小梁网发生永久性粘连，房水外流受阻，引起眼压升高并导致视神经损伤的一类青光眼。青光眼是导致人类失明的三大致盲眼病之一，总人群发病率为1％，45岁以后为2％。由于我国庞大的人口基数，青光眼患者可达千万之众，给家庭和社会带来了沉重的负担。

目前治疗pacg主要以手术治疗为主，药物治疗为辅，然而pacg的诊断和治疗依然面临许多困难，这主要归因于其在临床表型和遗传上具有高度的异质性，引起房角关闭的因素多样化，并且针对其病理机制系统研究不足。典型的pacg患者眼部特殊的解剖生物学特征包括前房浅﹑房角狭窄﹑晶状体增厚和位置靠前、眼轴短以及远视性屈光不正，这些都可能与基因和遗传因素有关。从解剖结构上来看，pacg是由于虹膜小梁网的接触造成小梁网处房水外流通道的堵塞所致，但其发病可能包括多种分子生物学机制。此外，研究者们发现pacg是具有高度遗传异质性的复杂眼病，存在基因位点突变。研究报道，pacg患者一级亲属的发病率为普通人的6～9倍；在中国pacg患者的兄弟姐妹中，具有房角狭窄解剖特征表现型的可能性约为50％，证明遗传因素是pacg的危险因素之一，其遗传方式主要为常染色体显性遗传或多基因遗传，但其致病基因尚不清楚，这为pacg的临床诊断和治疗带来极大阻碍。并且在对pacg患者手术治疗后，缺乏有效的药物治疗手段，因此有必要对pacg的药物治疗进行深入研究。

而目前，缺乏pacg的动物模型以及相应的药物治疗方案。

鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供左旋l-半胱氨酸在治疗原发性闭角型青光眼中的应用。本发明的研究发现以左旋l-半胱氨酸作为活性成分可以治疗原发性闭角型青光眼；本发明提供了一种新的治疗原发性闭角型青光眼的方法以及左旋l-半胱氨酸的新用途。

本发明是这样实现的：

pitx2(paired-likehomeodomaintranscriptionfactor2，mgi:109340)基因位于小鼠3号染色体129199878-129219591bp，全长19.07kb。该基因突变已被报道与axenfeld-rieger综合征(ars)(omim:180500)相关，该综合征包括各种具有眼部和全身特征的疾病。大约50％的ars患者患有特别严重的早期青光眼，其病因是前段发育畸形，其特征是角膜混浊、虹膜发育不全和虹膜粘连。pitx2编码的是类同源域转录因子中的一员，在胚胎发育和组织形态形成中发挥关键作用。到目前为止，在ars患者中发现了一系列的pitx2突变，包括错义突变、无义突变、剪接突变和拷贝数变异等。在小鸡、斑马鱼和啮齿动物中，pitx2基因编码三种独特的异构体(pitx2a、pitx2b和pitx2c)，对小鼠的研究表明，pitx2c对于确定左右不对称性以及心脏、肺、肝脏和卵巢的形态形成和肠道循环至关重要。pitx2基因缺失导致眼部，牙齿和大脑发育异常，病理特征类似于ars患者。已有研究表明，杂合pitx2敲除小鼠表现为眼球前段发育不良和pacg，表明pitx2基因突变/缺失与pacg发病密切相关。

本发明以pitx2^r115l点突变小鼠(c57bl/6j-pitx2egl1/boc，pitx2基因发生g344t点突变)为pacg疾病模型进行研究，首次发现单独以左旋l-半胱氨酸作为活性成分可以明显改善pacg疾病模型的相关症状例如改善抑制pacg疾病模型的氧化应激表型，减缓神经节细胞丢失表型等；说明左旋l-半胱氨酸具有治疗pacg疾病的潜力，为pacg疾病的治疗提供了一种新的策略。

基于此，一方面，本发明提供左旋l-半胱氨酸作为活性成分在制备用于治疗原发性闭角型青光眼疾病的药物中的应用。

可选的，在本发明的一些实施方案中，所述药物的剂型为注射剂。

需要说明的，所述药物的剂型可以根据需要选择，并不限于注射剂，其他剂型能够使用发挥治疗作用，也是属于本发明的保护范围。

可选的，在本发明的一些实施方案中，所述原发性闭角型青光眼疾病是由pitx2基因突变或缺失所致。

可选的，在本发明的一些实施方案中，所述原发性闭角型青光眼疾病是由pitx2蛋白发生r115l突变所致。

需要说明的是，本发明所述的原发性闭角型青光眼疾病并不限于由pitx2蛋白突变所致的原发性闭角型青光眼疾病，其他原因导致的原发性闭角型青光眼也是属于本发明的范围。

可选的，在本发明的一些实施方案中，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

需要说明的，药学上可接受的辅料可以根据需要进行选择，这对本领域技术人员来说容易实现的。

另一方面，本发明提供一种制备用于治疗原发性闭角型青光眼疾病的药物的方法，其包括：将左旋l-半胱氨酸作为活性成分与药学上可接受的辅料混合。

可选的，在本发明的一些实施方案中，所述原发性闭角型青光眼疾病是由pitx2基因突变或缺失所致。

可选的，在本发明的一些实施方案中，所述原发性闭角型青光眼疾病是由pitx2蛋白发生r115l突变所致。

可选的，在本发明的一些实施方案中，所述药物的剂型为注射剂。

另一方面，本发明还提供左旋l-半胱氨酸作为活性成分在制备用于抑制原发性闭角型青光眼氧化应激表型或用于减缓原发性闭角型青光眼神经节细胞丢失表型的药物制剂中的应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1：pitx2^r115l点突变小鼠的检测；图中：a：pitx2^r115l点突变小鼠的检测引物设计示意图；b：sanger测序验证该小鼠pitx2基因发生g344t点突变；图中pitx2^wt为对照小鼠，pitx2^mut为点突变小鼠。

图2：pitx2^r115l点突变小鼠出现pacg疾病表型；图中：a：pitx2^r115l点突变小鼠眼压升高；b：pitx2^r115l点突变小鼠视网膜中神经节细胞(ganglioncell，rgc)统计结果；c：免疫组化(immunohistochemistry，ihc)染色结果表明pitx2^r115l点突变小鼠神经节细胞(ganglioncell，rgc)丢失；d：小鼠视网膜石蜡切片h&e染色结果，pitx2^r115l点突变小鼠视网膜石蜡切片h&e染色结果，神经纤维层(nfl)明显变薄；e：对pitx2^r115l点突变小鼠视网膜nfl厚度统计；图中pitx2^wt为对照小鼠，pitx2^mut为点突变小鼠。

图3：pitx2^r115l点突变小鼠视网膜rna测序检测结果；小鼠年龄：3个月；a：pitx2^r115l点突变小鼠视网膜中抗氧化基因表达降低；b：实时定量pcr实验验证抗氧化基因表达降低；图中pitx2^wt为对照小鼠，pitx2^mut为点突变小鼠。

图4：pitx2^r115l点突变小鼠视网膜出现严重地氧化应激表型；小鼠年龄：3个月；图中：a-c：视网膜中氧化应激指标gpx、sod以及mda的酶联免疫吸附检测结果，表明pitx2^r115l点突变小鼠视网膜抗氧化减弱，氧化应激增强；d：免疫组化染色结果表明pitx^2r115l点突变小鼠活性氧(reactiveoxygenspecies，ros)增多，表明氧化应激出现；e：对pitx2^r115l点突变小鼠ros荧光强度统计结果；图中pitx2^wt为对照小鼠，pitx2^mut为点突变小鼠。

图5：左旋l-半胱氨酸治疗改善了pitx2^r115l点突变小鼠的青光眼表型；图中：a：左旋l-半胱氨酸腹腔注射治疗策略示意图；vehicle组为注射pbs阴性对照组；b：治疗后pitx2^r115l点突变小鼠依然表现为高眼压；c：免疫组化染色结果表明pitx2^r115l点突变小鼠治疗后活性氧较vehicle组降低，表明氧化应激得到改善；d：免疫组化染色结果表明pitx2^r115l点突变小鼠治疗后神经节细胞数目较vehicle组增加，表明青光眼所致的细胞损伤得到改善；e：视网膜不同位置神经节细胞数目的统计结果；f：治疗前与治疗后神经节细胞数目差值的统计结果；图中pitx2^wt为对照小鼠，pitx2^mut为点突变小鼠。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

1采用sanger测序法验证自美国杰克森实验室(jacksonlaboratory)购买的pitx2^r115l点突变小鼠pitx2基因发生g344t点突变。

方法：提取小鼠视网膜的总rna，具体步骤如下：

1)将组织置于1.5ml离心管，加入1mltrizol提取液，室温20分钟。

2)加入200ul氯仿，充分混匀，室温静置10分钟。

3)将样品置于4度离心机，10000转离心15分钟。

4)小心吸取上清液，加入等体积异丙醇，充分混匀，10000转离心沉淀rna。

5)75％乙醇清洗析出的总rna，离心再次沉淀，然后晾干加入depc水溶解。

6)以总rna为模板，然后用cdna合成试剂盒(invitrogen)合成cdna。根据pitx2的cdna序列设计引物(见图1中a)：

pitx2-cdna-f：5’-cggtagagaggttgtagatgggagtct-3'。

pitx2-cdna-r：5’-gcagagagccgctgaggttgtag-3'。

7)以提取的cdna为模板，进行测序前pcr扩增。

8)扩增后将pcr产物上机进行sanger测序。所用正向引物序列如下：

pitx2-seq-f：5’-cggtagagaggttgtagatgggagtct-3'。

结果见图1中b，可以看出，通过sanger测序方法检测验证pitx2^r115l点突变小鼠pitx2基因发生了g344t点突变。

实施例2

1本实施例以pitx2^r115l点突变小鼠为目标动物，为了确定该小鼠的青光眼表型，首先进行眼压检测，具体操作如下：

1)对测量小鼠腹腔注射氯胺酮(16mg/kg)等待5min。

2)用手轻轻地将小鼠固定在支架上，用眼压仪(tonolabcolonialmedicalsupply)测量眼压。

3)连续5次iop读数取平均值。

2对小鼠视网膜铺片进行免疫组化(immunohistochemistry，ihc)染色检测视网膜中神经节细胞数量。

方法：

取3月龄的野生型小鼠断颈处死后，快速取眼球，并放入4％的pfa中，冰上固定15min后，将视网膜分离，剪成花瓣状继续固定12h。

次日pbs洗三遍以去除固定液，然后5％的nds(含有0.25％triton)封闭通透2h，孵育神经节细胞特异标志物brn-3a抗体，4℃过夜。第二天，pbs清洗三次后，孵育相应的荧光二抗，然后再用pbs清洗三次，封片，观察。

3视网膜石蜡切片h&e染色：

对3月龄小鼠的视网膜进行石蜡切片、苏木精-伊红染色法(h&e染色方法)染色，具体操作如下：

1)快速取小鼠眼球组织，并置于固定液中固定24h。

2)石蜡包埋，切片，厚度为4μm。

3)切片常规用二甲苯脱蜡，经多级乙醇至水洗：二甲苯(i)5min→二甲苯(ⅱ)5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min。

4)苏木素染色5分钟，自来水冲洗。

5)盐酸乙醇分化30秒。

6)自来水浸泡15分钟。

7)置伊红液2分钟。

8)常规脱水，透明，封片：95％乙醇(i)1min→95％乙醇(ⅱ)1min→100％乙醇(i)1min→100％乙醇(ⅱ)1min→二甲苯石碳酸(3：1)1min→二甲苯(i)1min→二甲苯(ⅱ)1min→中性树脂封固。

9)显微镜下拍照。

结果显示pitx2^r115l点突变小鼠表现为高眼压(图2中a)，brn-3a染色表明pitx2^r115l点突变小鼠神经节细胞(ganglioncell，rgc)丢失(图2中b和c)。h&e染色结果发现在3个月时，相较于对照小鼠，pitx2^r115l点突变小鼠的nfl层已经开始变薄，表明视神经变性损伤(图2中d和e)。

实施例3

1测pitx2^r115l点突变小鼠进行rna测序分析检测，具体方法如下：

1)收集每只动物的视网膜并立即冷冻并进行rna提取。

2)使用生物分析仪2100rnananokit评估rna完整性和浓度。对于文库的准备，每个样品总共使用2ug的rna作为rna样品。

3)使用nebnext，的ultrarna文库准备试剂盒构建测序文库并检测浓度。

4)使用hiseqpeclusterkitv4-cbot-hs对索引编码的样本进行聚类。

5)集群生成后，在illuminahiseq2500平台对库进行测序，得到的所有基因表达值改为log2值进行进一步分析。p值小于或等于0.05被认为是显著的。

结果见图3中a，通过富集分析和筛选，rna测序结果表明pitx2^r115l点突变小鼠视网膜中数个抗氧化基因表达显著下调。基因表达log2值统计分析表明抗氧化相关基因cyp2f2、cyp4a12b、cyp2a5以及rrm2下降最为显著，这些结果表明pitx2^r115l点突变小鼠视网膜中抗氧化能力减弱。

2实时定量pcr(qpcr)验证pitx2^r115l点突变小鼠视网膜中抗氧化基因表达情况。具体实验方法如下：

分别分离野生型和敲除型小鼠视网膜组织，提取小鼠视网膜的总rna，然后用cdna合成试剂盒(invitrogen)合成cdna。以提取的cdna为模板，进行qpcr检测：

1)将cdna用ddh2o稀释20倍用于实时荧光定量pcr(qpcr)反应。首先设计扩增引物，序列如下：

cyp2a5-f：gagatttcctcctccccaag；

cyp2a5-r：tagccagtccttctccgaaa；

upk3bl-f：cccacggaaggtagaagaca；

upk3bl-r：gagcttctcggaatgtctgg；

rrm2-f：gatcgtgtgttcttcgctga；

rrm2-r：ttgcttgatggtcactgctc；

cyp26a1-f：ttcgggttgctctgaagact；

cyp26a1-r：tcctccaaatggaatgaagc；

plet1-f：cttccacacctgggactgtt；

plet1-r：tcactgctttcaggatcacg；

slc25a24-f：cggctagctgtagccaaaac；

slc25a24-r：gatagggctccacagctcag；

cyp2s1-f：ctgctcctgctgagataccc；

cyp2s1-r：cagagggaagacctcagtgc；

cyp2f2-f：tgcaggaagagattgaccgt；

cyp2f2-r：tgtgatgacatctgtgccct；

cyp26b1-f：ctgcatctctgccaggtgta；

cyp26b1-r：aaaggggcagagagctaagg；

cyp4a12b-f：tcatgaagtgtgccttcagc；

cyp4a12b-r：tgtgtgtcatgggcaagtt；

gapdh-f：ggtggacctcatggcctaca；

gapdh-r：ctctcttgctctcagtatccttgct。

2)然后按照下表配制pcr反应体系：

3)将反应体系混匀瞬时离心后放入qpcr仪中进行检测。

4)按照2^-△(△ct)法统计计算基因相对表达水平，gapdh作为内参基因。

结果见图3中b。可以看出，通过qpcr方法检测抗氧化基因在pitx2^r115l点突变小鼠视网膜中表达量显著降低。rna表达水平相对变化以野生型表达水平为1。

实施例4

1对3月龄的pitx2^r115l点突变小鼠进行氧化应激指标elisa检测，具体操作如下：

1)取目标小鼠断颈处死后，快速取眼球并剥离视网膜，研磨后加入pbs制成悬液。

2)按照购买试剂盒：谷胱甘肽过氧化物酶(gpx)试剂盒、丙二醛(mda)试剂盒以及超氧化物歧化酶(sod)试剂盒(南京建成生物，货号分别为a005、a003、a001-1)中的产品说明书配制酶促体系，混匀后瞬时离心，取上清1ml作显色反应。

3)按照说明书配制显色反应液，混匀后静置15min，在生化仪上检测od值，再根据说明书进行活力/浓度换算。

结果见图4中a-c，pitx2^r115l点突变小鼠视网膜中gpx和sod活力降低，而mda浓度升高，表明氧化与抗氧化体系失衡，机体出现过氧化。

2视网膜冰冻切片免疫染色：取目标小鼠断颈处死后，快速取眼球，并放入4％的pfa中，冰上固定15min后，在角膜上剪口，然后继续冰上固定。2h后，pbs缓冲液冲洗3遍，然后将眼球置于30％蔗糖溶液中脱水2h，然后解剖镜下剪去角膜及晶体，oct包埋并迅速置于-80℃冰箱冷冻。大约10min后，取出oct包埋的眼球，置于冰冻切片机-25℃平衡约30min后即可切片。切片厚度为12μm。

切片完成后，选取质量较高的片子于37℃烘箱放置30min，然后免疫组化笔在有视网膜组织的地方画圈，pbs洗三遍以去除oct，然后5％的nds(含有0.25％triton)封闭通透2h，孵育ros标记物dhe一抗，4℃过夜。第二天，pbs清洗三次后，孵育相应的荧光二抗，然后再用pbs清洗三次，封片，观察。

结果见图4中d和e，在小鼠3月龄时，通过视网膜冰冻组织切片染色ros标记物dhe后发现，相较于野生型(pitx2^wt)小鼠，点突变小鼠dhe荧光强度明显增高，表明氧化应激出现。

以上结果显示，pitx2^r115l点突变小鼠具有原发性闭角型青光眼疾病的症状，可以作为原发性闭角型青光眼疾病模型。

实施例5

1本实施例首先对pitx2^r115l点突变小鼠进行左旋l-半胱氨酸治疗，从5周龄开始持续治疗至10周龄，给药剂量为每天每千克体重注射25毫克pbs配制的左旋l-半胱氨酸溶液，给药方式为腹腔注射。同时设置溶剂对照组，以相同方式注射等量pbs溶液(图5中a)，作为对照组。以治疗的pitx2^r115l点突变小鼠为目标动物，首先进行眼压检测，具体操作如下：

1)对测量小鼠腹腔注射氯胺酮(16mg/kg)等待5min。

2)用手轻轻地将小鼠固定在支架上，用眼压仪(tonolabcolonialmedicalsupply)测量眼压。

3)连续5次iop读数取平均值。

结果见图5中b，对照组中pitx2^r115l点突变小鼠相较于野生型小鼠眼压明显升高。同样，治疗组中pitx2^r115l点突变小鼠眼压相较于野生型小鼠也明显升高，且与对照组相比并无显著改善，表明左旋l-半胱氨酸治疗后pitx2^r115l点突变小鼠依然表现为高眼压。

2为了确定该小鼠的氧化应激是否改善，随后进行视网膜冰冻切片免疫染色：取目标小鼠断颈处死后，快速取眼球，并放入4％的pfa中，冰上固定15min后，在角膜上剪口，然后继续冰上固定。2h后，pbs缓冲液冲洗3遍，然后将眼球置于30％蔗糖溶液中脱水2h，然后解剖镜下剪去角膜及晶体，oct包埋并迅速置于-80℃冰箱冷冻。大约10min后，取出oct包埋的眼球，置于冰冻切片机-25℃平衡约30min后即可切片。切片厚度为12μm。

结果见图5中c和d，ros标记物dhe染色显示对照组中pitx2^r115l点突变小鼠相较于野生型小鼠dhe荧光强度显著增强。然而治疗组中pitx2^r115l点突变小鼠dhe荧光强度与野生型小鼠无明显差别，表明左旋l-半胱氨酸治疗能够抑制pitx2^r115l点突变小鼠的氧化应激表型。

3为了确定该小鼠的神经节细胞死亡表型是否改善，对小鼠视网膜铺片进行免疫组化(immunohistochemistry，ihc)染色检测视网膜中神经节细胞数量，并计算治疗前后差值。

方法：

取目标小鼠断颈处死后，快速取眼球，并放入4％的pfa中，冰上固定15min后，将视网膜分离，剪成花瓣状继续固定12h。

结果见图5中e-g，神经节细胞标记物brn-3a染色显示对照组中pitx2^r115l点突变小鼠相较于野生型小鼠神经节细胞数量显著减少。然而，治疗组中pitx2^r115l点突变小鼠神经节细胞数量与野生型小鼠相比虽也有减少，但减少幅度较小，且对比对照组和治疗组的pitx2^r115l点突变小鼠神经节细胞数量，治疗组pitx2^r115l点突变小鼠神经节细胞数量较对照组增多，表明左旋l-半胱氨酸治疗能够挽救pitx2^r115l点突变小鼠神经节细胞丢失表型。

综上结果，可以看出，本发明实施例以一种原发性闭角型青光眼疾病模型pitx2点突变小鼠为研究对象，通过对pitx2基因点突变动物模型进行检测，明确目标动物出现典型的原发性闭角型青光眼的疾病特征。随后对该疾病模型进行左旋l-半胱氨酸腹腔注射治疗，使目标动物的青光眼疾病表型明显改善，为该疾病的治疗或预防提供新的思路和方法。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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