二硒类化合物作为冠状病毒木瓜样蛋白酶抑制剂的应用及抑制剂、药物的制作方法

本发明属于药物化学技术领域，具体涉及二硒类化合物在制备抗冠状病毒感染药物中的新用途及药物。

背景技术：

冠状病毒是一个大型病毒家族，在目前已知的正链rna病毒中基因组是最大的。根据宿主、血清型基因序列以及结构的不同可将冠状病毒分为四类：α类、β类、γ类和δ类。在这四类α类、β类只会感染哺乳动物，γ类和δ类主要感染鸟类；α属冠状病毒包括人冠状病毒(hcov-229e、hcov-nl63)、长翼蝠冠状病毒(hku1、hku8)、犬冠状病毒(ccov)和猫冠状病毒(fcov)等；β属冠状病毒包括人冠状病毒(hcov-oc43、hcov-hku1)、新型冠状病毒(sars-cov-2)、sars冠状病毒(sars-cov)，中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)、鼠冠状病毒、果蝠冠状病毒(hku9)等；γ类冠状病毒主要包括禽冠状病毒如鸡传染性支气管炎病毒(ibv)、土耳其冠状病毒(tcov)等；δ属冠状病毒包括夜莺冠状病毒(bucovhku11)、绣眼鸟冠状病毒(wecov)、野鸭冠状病(wicov)、黑水鸡冠状病毒(cmcov)等。

冠状病毒主要侵害呼吸道，胃肠道和神经系统等，往往会造成呼吸道和肠道疾病、神经系统症状和心肌炎。2003年，严重的上呼吸道疾病(sars)暴发，全世界约8000人感染，死亡率高达10％。2014年，中东呼吸综合征(mers)在全世界多个国家暴发，死亡率比sars更高，约达40％。新型冠状病毒(sars-cov-2)是一种以前从未在人类中发现的冠状病毒新毒株，这种新毒株引起了新型冠状病毒肺炎(covid-19)，有比2003年sars病毒有更强的感染能力，致死力约为5％。自从疫情爆发以来至今，全球累计感染人数已经超过三千万，死亡人数多达上百万，并且疫情还在继续发酵。这些疾病的感染严重影响了人们的健康。冠状病毒的反复发作，提示人类对于其研究知之甚少，开发治疗冠状病毒的药物迫在眉睫。

木瓜样蛋白酶(plpro)是表达在冠状病毒5’末端基因组nsp3上的水解酶，主要功能为酶切多聚蛋白pp1a上nsp1-2，nsp2-3，nsp3-4之间特异性四肽结构lxgg，该多聚蛋白需要被水解后成为成熟的功能蛋白；另外，木瓜样蛋白酶具有从宿主细胞里脱离泛素的附加功能，该功能保护冠状病毒进而规避宿主固有的免疫反应。因此，木瓜样蛋白酶对于病毒的生命周期至关重要，可以作为抗冠状病毒药物设计筛选的理想靶点。经查阅相关资料，未见二硒化合物抑制冠状病毒木瓜样蛋白酶的相关报道。

技术实现要素：

本发明针对现有的抗病毒药物中，对冠状病毒引起的肺部，呼吸道和肠道疾病、神经系统症状和心肌炎等相关炎症疾病缺乏有效防治效果的问题，提出二硒化合物在制备冠状病毒木瓜样蛋白酶抑制剂、及抗冠状病毒炎症药物中的新用途。

本发明是基于新型冠状病毒木瓜样蛋白酶(sars-cov-2plpro)的三维结构进行药物设计，对包括天然产物库，临床化合物库，抗病毒药物库的数千个化合物进行理论筛选，得到可能对新型冠状病毒plpro有抑制作用的化合物。然后，通过酶活性测试对这些化合物进行实验筛选。

本发明提供的第一种技术方案是：二硒类化合物作为冠状病毒木瓜样蛋白酶抑制剂的应用。

所述的冠状病毒为hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku、sars-cov、mers-cov、或者sars-cov-2中的任一种。

本发明提供的第二种技术方案是：一种冠状病毒木瓜样蛋白酶抑制剂，所述抑制剂的活性成分为二硒类化合物，所述的二硒类化合物具有式(i)所示结构：

其中，r1、r2分别选自苯基、取代苯基、吡啶基、酰胺基、c1-c6直链或支链烷基、c1-c6烷氧基、c2-c7直链或支链烯基、c3-c8环烷基或杂环烷基、c5-c8环烯或杂环烯基中的任一种。

进一步优选地，其中的烷基或烯基链被选自羟基、卤素原子、硝基、氨基、羧基、羟甲基、酰胺基、三氟甲基、三氟甲氧基中的任一个或者多个基团所取代。

作为本发明的一种优选方式，所述的二硒类化合物包括式(i)所述化合物的旋光异构体、其水合物，或其与酸形成的可药用的盐。

进一步优选地，所述水合物的结晶水数目为1-16中的任意实数。

进一步优选地，所述的酸选自盐酸、硫酸、氢溴酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、草酸、酒石酸、苯甲酸或苹果酸中的任一种。

进一步优选地，所述抑制剂的活性成分为二硒类化合物纯净物或两种以上二硒类化合物的混合物。

本发明还进一步提供了一种抗冠状病毒感染的药物，包含有效剂量的冠状病毒木瓜样蛋白酶抑制剂。

进一步优选地，所述药物可以制备成各种剂型，例如：胶囊、片剂、丸剂、颗粒冲剂、注射药剂或喷剂，可以采用多种给药途径，例如口服、经皮、静脉或肌肉注射等。

本发明是基于新型冠状病毒木瓜样蛋白酶(sars-cov-2plpro)的三维结构进行药物设计，对包括天然产物库，临床化合物库，抗病毒药物库的数千个化合物进行理论筛选，得到可能对新型冠状病毒plpro有抑制作用的化合物。然后，通过酶活性测试对这些化合物进行实验筛选。最终筛选出的二硒类化合物经实验验证，对新型冠状病毒木瓜样蛋白酶具有显著的抑制作用，提示该二硒类化合物可以用作冠状病毒木瓜样蛋白酶抑制剂、及用于制备抗冠状病毒炎症药物，为治疗新型冠状病毒肺炎提供了新思路。

附图说明

图1为实施例1中化合物1-3不同浓度底物肽在木瓜样蛋白酶代谢下荧光强度随时间变化示意图；a、b、c分别表示化合物1-3；

图2为实施例2中化合物1-3对新型冠状病毒木瓜样蛋白酶的抑制曲线；a、b、c分别表示化合物1-3。

具体实施方式

下面结合附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

整个实验过程中，所有的操作方法和操作步骤以及底物的反应条件等，都是根据本领域的普通技术人员熟知的方法设计、实施的。

本发明实施例中所用的抑制剂筛选试剂盒为本发明申请人具有自主知识产权的产品(申请专利号为202010674650.x)，包括以下组分：

sars-cov-2木瓜样蛋白酶、

底物肽dabcyl-ftlkggaptkvt-e(edans)、

硼酸硼砂缓冲液。

其中，sars-cov-2木瓜样蛋白酶浓度为0.01-1mg/ml；

底物肽dabcyl-ftlkggaptkvt-e(edans)的浓度为0.1mm-5mm；

dabcyl是猝灭剂4-二甲胺偶氮苯4’-羧酸，edans是荧光团5-(2-氨基乙氨基)-1-萘磺酸；

硼酸硼砂缓冲液的浓度为10-100毫摩尔/升；硼酸硼砂缓冲液的ph为7-9。

其中采用的sars-cov-2木瓜样蛋白酶购自crystalobiopharma，底物dabcyl-ftlkggaptkvt-e(edans)委托glbiochem定制合成，硼酸硼砂缓冲液购自雷根生物。优选地，sars-cov-2木瓜样蛋白酶(浓度为0.1mg/ml)、底物肽dabcyl-ftlkggaptkvt-e(edans)(浓度为0.1mm-5mm)、硼酸硼砂缓冲液(ph＝7-9)。

上述试剂盒需配合荧光酶标仪进行荧光检测。

实施例1：不同浓度化合物1-3作用下底物肽在木瓜样蛋白酶代谢下荧光强度随时间变化

其中，化合物1-3的结构式为：

(1)sars-cov-2木瓜样蛋白酶和底物肽储液均保存于-80℃冰箱中；

(2)将sars-cov-2木瓜样蛋白酶在冻存板(-4至4℃)里室温下融化，取1ul稀释于98ul硼酸硼砂缓冲液(ph＝7.4)中，加入检测板中；

(3)将浓度为0、0.025mm、0.125mm、0.25mm、0.5mm、1mm、2.5mm的化合物1-3，分别取1ul加入上述步骤(2)获得的溶液中；

(4)将相同浓度的底物肽(0.5mm)1ul分别加入上述步骤(3)获得的溶液中，使用荧光酶标仪37℃孵育，并使用荧光酶标仪检测342nm激发，496nm处的荧光发射值，边孵育边检测，每1分钟采一点；

(5)化合物1-3存在的条件下，底物肽在酶代谢下荧光强度随时间缓慢增强效果如图1中(a)、(b)、(c)，其结果显示，该底物肽被酶催化产生的荧光增强可以被化合物1抑制，并且这种抑制现象是浓度相关的。

实施例2：化合物1-3对新型冠状病毒木瓜样蛋白酶的抑制能力检测

(1)sars-cov-2木瓜样蛋白酶和底物肽储液均保存于-80℃冰箱中；

(2)将sars-cov-2木瓜样蛋白酶在冻存板(-4至4℃)里室温下融化，取1ul稀释于98ul硼酸硼砂缓冲液(ph＝7.4)中，加入检测板中；

(3)将浓度为0，0.025mm，0.125mm，0.25mm，0.5mm，1mm，2.5mm的化合物1-3，分别取1ul加入上述步骤(2)获得的溶液中；

(4)将相同浓度的底物肽(0.5mm)1ul加入上述步骤(3)获得的溶液中，使用荧光酶标仪37℃孵育，并使用荧光酶标仪监测342nm激发，496nm处的荧光发射值，边孵育边检测，孵育1h；

(5)统计各组孵育前后342nm激发，496nm处的荧光发射值。以control组(浓度为0组)孵育前后的荧光变化值作为100，不同浓度组的孵育前后荧光变化值与之相比得到剩余活性值(residualactivity)。使用graphpadprism6软件，以化合物浓度的对数值(logc(inhibitor))为横坐标，对应的剩余活性值(residualactivity)为纵坐标作图。结果如图2中(a)、(b)、(c)所示，得到化合物1-3的ic50值。表1列举了化合物1-3对sars-cov2plpro抑制的活性数据。ic50计算的公式为y＝100/(1+10^((x-logic50)))，其中y代表剩余活性分数，x代表抑制剂化合物浓度的常用对数，∧指的是幂算法。可以得到该化合物的抑制能力，用抑制酶活性一半时的抑制剂浓度来表示，如表1所示。

表1：化合物1-3结构和抑制新型冠状病毒木瓜样蛋白酶(plpro)ic50值

从图2及表1可以看出，化合物1-3在25μm浓度下对sars-cov-2木瓜样蛋白酶的抑制率都达到90％以上，化合物1-3抑制剂的ic50值分别为0.8μm、1.101μm、和2.967μm。表明这类化合物能够有效的抑制新型冠状病毒木瓜样蛋白酶的活性。并且，鉴于文献报道的冠状病毒木瓜样蛋白酶具有高度相似性，可推测该类化合物也能够有效抑制其它冠状病毒木瓜样蛋白酶的活性，尤其是对于sars-cov，mers-cov，hcov-229e，hcov-oc43，hcov-nl63和hcov-hku。

实施例3采用上述冠状病毒木瓜样蛋白酶抑制剂可以制备成抗冠状病毒感染的药物。

采用上述二硒类化合物，与药学上可接受的辅剂结合，通过现有常规制药工艺，制备成抗冠状病毒感染的药物。

辅剂包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂。该药物可以制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂的形式使用。其给药途径可为口服、经皮、静脉或肌肉注射。

利用二硒类化合物对冠状病毒木瓜样蛋白酶活性的显著抑制能力，制备成的抗病毒感染的药物，通过抑制冠状病毒木瓜样蛋白酶活性，打破其免疫逃逸，从而实现抗新冠病毒感染的目的。

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