高车前素在制备治疗和/或预防心血管疾病的药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及高车前素在制备治疗和/或预防心血管疾病的药物中的应用。

背景技术：

心力衰竭是心血管疾病(如高血压、冠心病、各种心肌病、心脏瓣膜病等)发展到终末阶段的共同表现。心室重构包括心肌肥厚和心肌纤维化，是心力衰竭进展的核心环节。心血管疾病早期，心肌缺血、心脏前/后负荷增加、心肌病变等病理性因素作用于心脏，首先引起心肌代偿性肥厚以保证心脏泵血功能，维持心功能的稳定，主要表现为心肌细胞体积增大、心脏重量增加、室壁增厚，心肌肥厚相关的信号转导通路被激活，蛋白质合成增加，胚胎基因心房利钠肽(atrialnatriureticpeptide，anp)与b型利钠肽(b-typenatriureticpeptide，bnp)表达显著增多。然而随着病情进展，持续的心肌肥厚会促进心肌纤维化的进展，引起心肌细胞凋亡坏死，心室壁相应变薄，心腔扩大，心肌顺应性减退，心输出量下降，最终引起心力衰竭。因此，心肌肥厚和心肌纤维化作为心力衰竭发生发展的核心环节，抑制心肌肥厚和心肌纤维化的进展对防治心力衰竭具有重要意义。

心脏作为机体高能量需求的器官，需要足够的能量供应以确保其收缩和舒张功能。心脏中的三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate，atp)95％以上来自线粒体氧化磷酸化(oxidativephosphorylation，oxphos)。atp经由线粒体氧化磷酸化产生，其受到能量底物、兴奋-收缩偶联和氧化还原平衡等多个方面调控。心肌肥厚时心脏前后负荷增大，心脏能量需求增加。同时，线粒体氧化磷酸化水平降低，atp合成减少；并且，线粒体电子传递链释放活性氧增多，抗氧化系统受抑制，氧化应激增强。由于能量需求的增加及产量减少，以及氧化应激损伤的出现，最终加剧心肌肥厚向心衰的发展。既往研究中，利用31p磁共振波谱(31pmrs)发现，心衰患者心脏中磷酸肌酸：三磷酸腺苷(pcr：atp)比率明显降低，表明心衰患者中心肌细胞能量供给不足，其常提示左心室(lv)功能障碍和预后不良。

线粒体作为心肌细胞最主要的产能细胞器，线粒体功能的稳定对抑制心肌肥厚的进一步发展具有重要意义。在主动脉缩窄术诱导的小鼠心肌肥厚模型中，线粒体呼吸功能显著抑制。通过基因及蛋白组学分析发现，线粒体电子传递链相关复合体ⅰ(nadh脱氢酶复合体)、复合体ⅱ(琥珀酸脱氢酶复合体)，复合体ⅲ(细胞色素还原酶复合体)、复合体ⅳ(细胞色素氧化酶复合体)的蛋白及mrna表达水平显著降低，从而抑制线粒体电子传递链活性，导致线粒体atp合成减少，心脏功能下降。多项研究证实，改善线粒体功能障碍能够抑制心肌肥厚以及抑制其向心力衰竭发展。阿米普肽(elamipretide，ss-31)作为线粒体靶向抗氧化肽，多种动物模型中均证实，其通过与心磷脂结合稳定细胞色素c的电子传递功能，提高线粒体氧化磷酸化效率并抑制线粒体ros产生，从而抑制心肌肥厚发展。辅酶q(coenzymeq)作为一种脂溶性电子载体，能够改善线粒体电子传递和atp合成，临床研究明确证实其作为慢性心衰的辅助用药可降低心衰发病率和死亡率。然而，尽管已知线粒体功能的稳定对心肌肥厚和心力衰竭的发展具有抑制作用，但目前的心肌肥厚和心力衰竭治疗方法仍主要限于抑制神经内分泌的激活，通过降低心室负荷来减少心肌耗氧量以及降低心率，对直接针对性改善心肌中线粒体功能的药物的发掘十分有限。因此，探寻新的对心肌中线粒体功能具有保护作用的药物和靶点并深入研究其作用机制对心肌肥厚和心力衰竭的防治具有重要意义。

高车前素存在于奇异果，雪莲，雪草，蒿类和丹参中的，因其具有抗氧化，抗凋亡，抗炎，抗突变和抗肿瘤等多种生物学作用，在肿瘤及神经病学领域已有诸多应用。然而，在心血管领域，国内外尚无高车前素的相关研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供高车前素在制备治疗和/或预防心血管疾病的药物中的应用。本发明以主动脉缩窄诱导的压力过负荷小鼠作为实验对象，以心脏超声、心脏重量和大小、心脏横截面苏木素-伊红(hematoxylin-eosin，h&e)、麦胚凝集素wga染色、心脏线粒体功能和线粒体氧化应激为检测指标。结果显示，高车前素作为一种天然的黄酮类化合物，对压力过负荷诱导的心肌肥厚有显著的预防和治疗作用，并且可显著改善心力衰竭，深入机制研究发现高车前素可通过保护线粒体线粒体产能功能、抑制线粒体氧化应激从而发挥对心肌肥厚和心力衰竭的保护作用，提示高车前素在心肌肥厚和心力衰竭等心血管疾病的防治中发挥重要作用(图1)。

发明人经过研究发现高车前素作为一种天然的化合物，对心肌肥厚和心力衰竭有预防和治疗作用。高车前素可作为防治心肌肥厚和心力衰竭等心血管疾病的一种新方法。

本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：

本发明要求保护高车前素在制备治疗和/或预防心血管疾病的药物中的应用。

优选地，所述心血管疾病为心力衰竭。

更优选地，所述心力衰竭为高血压、冠心病、心肌病、或心脏瓣膜病任意的一种或几种进展到终末环节的复杂临床综合征。

更优选地，所述心力衰竭表现为心肌肥厚。

更优选地，所述心肌肥厚为压力过负荷诱导的。

优选地，高车前素减轻心肌肥厚。

优选地，高车前素改善线粒体功能。

高车前素通过提高线粒体功能从而抑制心肌肥厚，发挥其心血管保护的作用。

更优选地，高车前素抑制肥厚心脏组织atp水平下降。

更优选地，高车前素抑制肥厚心脏组织中ros水平上升。

更优选地，高车前素抑制肥厚心脏组织中线粒体的结构异常。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所述的高车前素，解决了传统上没有针对心力衰竭复杂临床综合征进行有效预防和治疗以及临床药物治疗存在不良反应的问题，为防治心力衰竭这一严重心血管疾病提出了新的思路和具体应用。

本发明为高车前素为高车前素防治心肌肥厚和心力衰竭，从分子学的角度提供了新的作用机制，进而为中国传统中草药艾蒿等的生物活性成分的开发利用提供了新的依据，这也对中草药在心力衰竭领域的的有效合理利用有着重要的意义。并为临床上心肌肥厚和心力衰竭药物治疗的靶点开发提供新的策略。

附图说明

图1为高车前素功能示意图。

图2为体内实验中，高车前素抑制主动脉缩窄术诱导的小鼠心力衰竭并提高心功能，在手术前一天至手术后4周腹腔注射高车前素，4周后行超声心动图检测；(a)各组小鼠心脏的超声心动图图像；(b)经胸超声心动图测量小鼠左心室舒张末期直径(lvedd)；(c)经胸超声心动图测量小鼠左心室收缩末期直径(lvesd)；(d)经胸超声心动图测量小鼠左心室后壁厚度(lvpwd)；(e)经胸超声心动图测量小鼠射血分数(ef％)；(f)经胸超声心动图测量小鼠左室短轴缩短率(fs％)；*p<0.05vscorrespondingshamgroup,#p<0.05vsdmso+abgroup。

图3为体内实验中，高车前素抑制主动脉缩窄术诱导的小鼠心力衰竭，在手术前一天至手术后4周腹腔注射高车前素；(a)术后4周白光摄取小鼠心脏图片；(b)术后4周小鼠心脏石蜡切片h&e染色；(c)术后4周小鼠心脏石蜡切片wga染色；*p<0.05vscorrespondingshamgroup,#p<0.05vsdmso+abgroup。

图4为高车前素逆转主动脉缩窄术诱导的心脏线粒体结构紊乱，在手术前一天至手术后4周腹腔注射高车前素；(a)透射电镜在放大倍数为5800×和26500×下四组小鼠心脏组织中线粒体图像；(b)四组小鼠心脏单个线粒体面积；(c)术后4周小鼠心脏线粒体长宽比；*p<0.05vscorrespondingshamgroup,#p<0.05vsdmso+abgroup。

图5为高车前素提高心力衰竭中线粒体atp合成，主动脉缩窄术诱导小鼠心力衰竭，高车前素于术前1天至术后4周腹腔给药，4周后收取小鼠心脏标本，试剂盒检测心肌细胞中atp浓度，以蛋白浓度校正，*p<0.05vscorrespondingshamgroup,#p<0.05vsdmso+abgroup。

图6为高车前素对主动脉缩窄术诱导的心力衰竭中活性氧(ros)水平的影响，术后4周收取小鼠心脏标本，利用dhe荧光探针标记小鼠心脏冰冻切片ros，在荧光显微镜下观察和拍摄各组图片。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

为了更好地理解本发明的实质，下面将用小鼠作为实验对象来说明其在制药领域的新用途。选用8～10周龄雄性c57bl/6小鼠，利用主动脉缩窄术(aorticbanding，ab)建立压力过负荷诱导的心肌肥厚模型，设置假手术组(sham)。术后4周收取小鼠心脏标本，当我们发现，主动脉缩窄术组的小鼠与假手术组相比，出现心脏明显增大(心重/体重比和心重/胫骨长度比明显增高)，心脏扩大(超声心动图上的lvpwd，lvedd和lvesd升高)以及心脏功能恶化(ef％，fs％降低)，说明造模成功。

实验分组：将小鼠随机分为4组(每组8～10只)：(1)dmso+sham组，(2)高车前素+sham组(高车前素+假手术组)，(3)dmso+ab组，(4)高车前素+ab组。高车前素溶解于dmso溶液中，然后按20mg/kg/天给予小鼠每日腹腔注射高车前素溶液，对照组每日等量溶剂dmso溶液，共4周，采用vevo2100高分辨小动物超声成像系统，检测心脏结构及心功能。

实施例1高车前素干预对压力过负荷诱导的心肌肥厚和心力衰竭的影响

一、小鼠基本状态观察

1、实验方法

对各组小鼠进行基本状态观察，包括：发育情况、行动、皮毛、饮食、体重等。

2、实验结果

sham组小鼠生长发育良好，皮毛光滑、活动灵活、摄水摄食正常。ab组小鼠活动量降低，但无显著差异。高车前素小鼠状态较主动脉缩窄术组有所好转。

二、小鼠心功能

1、实验方法

给药4周后，给予吸入麻醉(1.5-2％异氟烷与100％o2混合)，采用小动物超声影像系统进行经胸超声心动图检测。取左室长轴行m-超声检查，测量小鼠心脏左心室舒张末期直径(leftventricularend-diastolicdimension，lvedd)、心室收缩末期直径(leftventricularend-systolicdimension，lvesd)、左心室后壁厚度(leftventricularposteriorwalldimension，lvpwd)、左室短轴缩短率(shorteningfraction，fs％)和射血分数(ejectionfraction，ef％)。

2、实验结果

超声心动图结果如图2显示，与dmso+sham组相比，dmso+ab组小鼠lvedd、lvesd和lvpwd显著升高，ef％以及fs％均显著下降；与dmso+ab组相比，高车前素+ab组小鼠lvedd、lvesd和lvpwd均明显降低，同时，ef％以及fs％显著增加，表明高车前素能够显著抑制心肌肥厚，抑制心肌重构，并且改善小鼠心功能，抑制心力衰竭。

三、小鼠心脏大小和重量

1、实验方法

心功能超声评价完成后，取小鼠心脏和肺脏随后称质量，计算心脏重量与小鼠体重比值(heartweight/bodyweight,hw/bw)和心脏重量与胫骨长度比值(heartweight/tibiallength,hw/tl)，以及肺脏重量与小鼠体重比值(lungweight/bodyweight,lw/bw)和肺脏重量与胫骨长度比值(lungweight/tibiallength,lw/tl)。

2、实验结果

术后4周，超声检测完毕后剂收取小鼠心脏，称重并在白光下拍摄各各组小鼠心脏大体图像。如图3a和表1所示，与dmso+sham组相比，ab组小鼠心脏明显增大，肺脏明显充血变大，检测hw/bw(心重/体重比)、hw/tl(心重/胫骨长度比)、lw/bw(肺重/体重比)和lw/tl(肺重/胫骨长度比)显著增加。高车前素+ab组hw/bw、hw/tl、lw/bw和lw/tl值较dmso+ab组明显降低，并且肉眼可见心脏和肺脏显著减小。提示高车前素干预能显著减轻压力过负荷诱导的小鼠心肌肥厚，同时减轻肺水肿，改善心力衰竭。

表1高车前素对心肌肥厚和心力衰竭的抑制作用：

表1显示，体内实验中，高车前素抑制主动脉缩窄术诱导的心力衰竭。在手术前一天至手术后4周腹腔注射高车前素。检测四个组心重/体重比(hw/bw)、心重/胫骨长度比(hw/tl)、肺重/体重比(hw/bw)、肺重/胫骨长度比(hw/tl)。*p<0.05vscorrespondingshamgroup,#p<0.05vsdmso+abgroup。

四、小鼠心肌组织病理形态

1、实验方法

心脏称重后，部分心脏于中部垂直于心脏长轴横切，石蜡包埋。石蜡切片脱蜡至水，按照试剂盒说明，进行h&e和wga染色，以检测心脏的组织结构和心肌细胞肥厚的程度。

2、实验结果

结果如图3a、b和3c所示与dmso+sham组相比，dmso+ab组小鼠心室腔明显增大，心肌细胞明显增大。而上述指标在高车前素干预后，高车前素+ab组较dmso+ab组相比，心室腔和心肌细胞横截面积明显缩小，心肌肥厚得到明显改善。

实施例2高车前素对线粒体功能的影响

一、小鼠心脏线粒体形态

1、实验方法

术后4周，取一小块新鲜小鼠心脏组织修剪成1mm×1mm×3mm的立方体并浸入4％多聚甲醛和2.5％戊二醛的0.1m甲酸钠溶液中进行固定。使用超薄切片机将样品切成70nm切片，并用柠檬酸铅染色。使用tecnaig2spirittwin透射电子显微镜进行检测小鼠心脏切片的线粒体。分别在5800×和6,2500×的放大倍数下进行拍摄，每个心脏切片拍摄约20张。使用imagej软件测量单个线粒体的面积和纵横比。

2、实验结果

结果如图4a示，dmso+ab组中出现了结构异常的线粒体，线粒体变小变圆且排列紊乱，表现为线粒体纵横比比值减小和线粒体面积减小，并失去原有的线性排列。而高车前素+ab组与dmso+ab组相比，线粒体形态变异明显较轻，表现为线粒体纵横比比值增大和线粒体面积增大(图4a、b和4c)，结果有统计学显著性，说明高车前素维持了心肌肥厚小鼠正常线粒体形态。

二、小鼠心脏组织atp水平变化

1、实验方法

术后4周，收取新鲜心脏组织标本，根据试剂盒说明，利用荧光素酶法通过化学发光仪(luminometer)测定每孔相对光单位(relativelightunit，rlu)值，从而计算出相应的atp浓度。

2、实验结果

如图5所示，与dmso+sham组相比，dmso+ab组小鼠心脏组织atp水平明显降低，而高车前素+ab组小鼠心脏组织atp水平较dmso+ab组显著上调。

三、小鼠心脏氧化应激水平

1、实验方法

术后4周，收取新鲜心脏组织标本，于中部垂直于心脏长轴横切，oct包埋。自心底向心尖以5μm厚度切片。按照试剂盒说明，进行dhe染色评价心脏组织中超氧阴离子水平。dhe荧光强度与细胞内ros的水平呈正相关。利用荧光显微镜拍摄荧光图像(激发波长488nm，发射波长525nm)。并使用imagej分析各组心脏冰冻切片荧光强度。

2、实验结果

采用dhe荧光探针检测发现，如图6所示，与dmso+sham组相比，dmso+ab组小鼠心脏的dhe荧光明显升高，高车前素处理后，高车前素+ab组较dmso+ab组心脏组织中ros水平显著抑制，表现为dhe荧光强度显著减弱。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

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