一种赖氨酸改性的药物载体及其制备方法与流程

【技术领域】

本发明涉及一种赖氨酸改性的药物载体及其制备方法，所述的赖氨酸改性的药物载体为羧甲基壳聚糖接枝β-环糊精后经赖氨酸修饰制备的纳米水凝胶，同时公开了其制备方法。

背景技术：

药物载体能够提高药物的利用率、安全性和时效性，能够减少给药频率，改善药物的不良气味，提高给药剂量准确性和对靶向组织及器官的准确释药，因此受到人们的广泛关注。纳米技术的发展推动了药物载体的研究，纳米级药物载体的研究与应用在医药领域做出了巨大贡献。

水凝胶是由高分子的三维网状和水组成的多元体系，是一种具有网状交联结构的亲水聚合物，在水中只溶胀而不溶解，是自然界中普遍存在的一种物质形态。纳米凝胶是指由交联聚合物网络构成的纳米尺寸的水凝胶。纳米凝胶具有反应性强、载药简单、载药能力强、物理稳定性高、设计通用性强、包封药物稳定性好、进行抗炎抗菌抗癌药物控释等优点。

纳米水凝胶有以下特点：(1)纳米水凝胶的粒径通常在10-600nm，粒径小，比表面积大；(2)表面含有许多功能基团可偶联有特定作用的组分，能产生外部环境刺激响应性；(3)与人体组织类似，生物相容性好，在体内容易降解；(4)内部有不同程度的交联结构，可以溶于水形成稳定性良好的胶束。

制备纳米水凝胶的材料主要有天然高分子材料，如多脂类、生物多糖类、多肽蛋白质等。众所周知，糖类、脂类、蛋白质是人体不可或缺的三种营养物质，运用这些生物高分子制备纳米水凝胶更加能保证药物载体的安全性，提高纳米水凝胶的生物相容性和降解能力，也不会产生细胞毒性。

壳聚糖(chitosan，简称cs)，数量仅次于纤维素，分子中有活泼的羟基和氨基，具有较强的化学反应能力，但难溶于水。羧甲基壳聚糖(cmcs)是一种水溶性壳聚糖衍生物，是在碱的存在下用氯乙酸与壳聚糖反应而得到，具有稳定的性质和抗菌抗感染，降脂和防治动脉硬化等药理作用。

环糊精(cyclodextrin，简称cd)，由6-12个d-型吡喃葡萄糖通过α-1，4糖苷键首尾相连而成，其形状表现为圆锥状筒形。β-环糊精(β-cd)是由7个吡喃葡萄糖形成，锥腔外存在大量羟基而呈亲水性，锥腔内表面糖苷键上的氧原子被c3和c5上氢原子所覆盖，表现出疏水性，β-环糊精的这一结构和特性表现出了其载药的优势。但是，环糊精自身很难形成水凝胶，必须进行改性后结合其他高分子进而形成水凝胶。

本团队在前期研究中已经获得了若干项研究成果，其中已获授权的技术方案分别为中国专利cn107383393和中国专利cn109044963的技术方案，其效果已经得到了验证，但是经过进一步负载和释药实验后发现，上述两种纳米凝胶还存在ph值不稳定，以至于载药和释药过程存在同样的不稳定，进一步研究后发现主要问题在于水凝胶改性时，所采用的改性基团较为单一，在其基础上进一步改性从而提高稳定性的前景不明朗，为此需要针对其基础结构进行适当的改进同时选择更优的改性基团，来解决上述问题。

在纳米水凝胶研究领域，带有氨基酸的纳米水凝胶形式的药物载体鲜有报道。氨基酸是人体合成蛋白质供机体运转不可缺失的物质，氨基酸分子有两种官能团，氨基和羧基。纳米水凝胶拥有了氨基和羧基，可以在不同的ph环境中形成不同的离子键实现ph的调控。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种赖氨酸改性的药物载体，该药物载体生物相容性好、体系稳定、载药率高、药物缓控性好且降解率高。

针对背景技术中提到的现有技术中β-环糊精与壳聚糖制备的水凝胶改性基团单一，功能性活性位点少，我们首先对水凝胶的基础结构进行了对应的改进，将羟丙基壳聚糖替换为羧甲基壳聚糖，从而为整体结构上增加一个羧基，从而在不影响整体结构性能的前提下，增加了整个结构的活性位点，并且在该位点处引入了新的改性基团；同时，由于羧甲基壳聚糖较之羟丙基壳聚糖，具有ph敏感性的优点，将其替换到水凝胶的整体结构后，使得制备的纳米水凝胶具有ph敏感性，较之现有纳米水凝胶的在载药率和释药率中有明显提高；

经过发明人大量实验和验证后发现，在将羟丙基壳聚糖替换为羧甲基壳聚糖的前提下，从众多备选的改性物质中，我们优选了赖氨酸进行改性，由于赖氨酸分子结构上带有两个氨基和一个羧基，在改性时引入上述基础结构后单元分子基团增加了一个氨基和一个羧基。

经过这种改进，我们明确现有技术之所以存在ph不稳定的情况，主要原因在于，其自带的氨基在聚合过程中有一定的损失，且其位于聚合物的主链中，造成其对外界ph的感应较差，有一定的延迟性；而本申请的结构中引入了一个新的氨基，且该氨基位于聚合物的支链上，羧基与该氨基同样位于支链上，两个基团分布更加均匀，使得空间位阻大大减小，从而从根本上提高了其对环境ph的敏感性。

在上述发明构思的基础下，我们进一步提供了所述的赖氨酸改性羧甲基壳聚糖纳米水凝胶(lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶)，其结构式如下：

通过上述结构式可以看到，改性羧甲基壳聚糖的赖氨酸位于聚合物支链上，且其羧基和氨基对称分布，n＝25～35。

本发明的另一目的是提供lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶的制备方法：

(1)suc-β-cd的制备

琥珀酸酐(suc)改性β-cd的制备，具体步骤为：取500ml的三口烧瓶置于智能温控双频超声波反应器，调节超声仪器频率为30khz、40khz。量取250mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)加入三口烧瓶，设定温度70-95℃，缓慢加入一定质量的纯化β-cd，加入一定质量的琥珀酸酐(与β-cd按不同摩尔比称取)，设定不同反应时间。反应结束，将反应液倒入至1000ml烧杯，冷却至室温。向烧杯中加入三氯甲烷得到大量白色絮状沉淀物，使用真空泵抽滤得到白色固体。用大量丙酮洗涤3次，取洗涤过的固体，放入真空干燥箱中干燥。即得琥珀酸酐改性β-cd(suc-β-cd)。β-cd(suc-β-cd)的制备机理如下：

(2)cmc-g-suc-β-cd共聚物的制备

取一支洁净的250ml三口烧瓶，于恒温反应槽中，反应槽温度设定37℃。向烧瓶中加入100mlnacl溶液，称量步骤(1)得到的suc-β-cd于烧杯中，加入一定质量活化剂。活化一段时间后，加入一定质量的cmc，37℃下反应。反应完成后，把反应溶液转移到分子截留量为5000da的透析袋中中于500ml超纯水中透析72h，每隔8h置换一次超纯水；透析完成后，保留少量溶液进行表征测试。将透析袋的液体转移至玻璃培养皿，冷冻干燥24h，得到冻干的cmc-g-suc-β-cd。cmc-g-suc-β-cd共聚物的制备机理如下：

其中edc/nhs缩合反应制备共聚物原理如下：

(3)lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶的制备

取一支洁净的250ml三口烧瓶，放置于恒温反应槽，温度设定37℃。向烧瓶中加入100mlnacl溶液，称取一定质量步骤(2)得到的cmc-g-β-cd于上述250ml烧杯中，加入一定质量活化剂，活化反应25min后，加入一定质量的赖氨酸，37℃下反应一段时间。反应完成，把溶液转移到分子截留量为5000da的透析袋中透析72h，过8h置换一次超纯水。透析完成，将透析袋的液体转移至玻璃培养皿，使用真空冷冻干燥箱，冷冻干燥24h。得到冻干的lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶，其制备机理如下：

进过进一步优化后，对应的技术方案参数如下：

步骤(1)中的反应温度为80℃，超声反应时间控制在6h；

步骤(1)中β-cd与琥珀酸酐的摩尔比为1:1；

步骤(2)中nacl溶液浓度为0.1mol·l^-1；

步骤(2)suc-β-cd的质量为2.4636g；

步骤(2)suc-β-cd和cmcs的质量比为1:2；

步骤(2)中活化剂为edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)与nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)连用，间隔时间30min；edc与nhs的摩尔比为1:1；suc-β-cd与活化剂edc的摩尔比为1:1；

步骤(2)反应时间为12h；

步骤(3)nacl溶液浓度为0.1mol·l^-1；

步骤(3)cmc-g-β-cd质量为2.0000g；

步骤(3)cmc-g-β-cd和赖氨酸的质量比为5:1；

步骤(3)中活化剂为edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)与nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)连用，间隔时间30min；edc与nhs的摩尔比为1:1；赖氨酸与活化剂edc的摩尔比为1:1；

在该质量比下，赖氨酸的改性效果最好，制备的纳米水凝胶的ph敏感性最好。

步骤(3)反应时间为10h；

步骤(3)对制得的纳米水凝胶的加入甘露醇冻干保护剂，之后再进行冷冻干燥，甘露醇浓度7％，甘露醇溶液与透析液的比例2:3。

经过上述优化后，最终获得的技术方案如下：

(1)suc-β-cd的制备

取500ml的三口烧瓶置于智能温控双频超声波反应器，调节超声仪器频率为40khz，量取250mln,n-二甲基甲酰胺加入三口烧瓶，设定温度80℃，缓慢加入22.7000g纯化β-cd，加入2.0014g的琥珀酸酐，设定反应时间6h；反应结束，将反应液倒入至1000ml烧杯，冷却至室温，向烧杯中加入三氯甲烷得到大量白色絮状沉淀物，使用真空泵抽滤得到白色固体，用300ml丙酮分3次洗涤，取洗涤过的固体，放入真空干燥箱中，在反应时设定的相应温度下干燥12h；

(2)cmc-g-suc-β-cd共聚物的制备

取洁净的250ml三口烧瓶，于恒温反应槽中，反应槽温度设定37℃；向烧瓶中加入100mlnacl溶液，称量步骤(1)得到的改性β-cd2.4636g于上述250ml烧杯中，加入0.3834g的edc，用以活化琥珀酸酐改性的β-cd上的羧基，30min后，加入0.2302g的nhs，反应25min后，加入4.9272g的cmc，37℃下反应12h；反应完成后，把反应溶液转移到分子截留量为5000da的透析袋中于500ml超纯水中透析72h，每隔8h置换一次超纯水；透析完成后，将透析袋的液体转移至玻璃培养皿，冷冻干燥24h，得到冻干的cmc-g-suc-β-cd；

(3)lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶的制备

取洁净的250ml三口烧瓶，放置于恒温反应槽，温度设定37℃；向烧瓶中加入100mlnacl溶液，称取步骤2得到的cmc-g-β-cd2.0000g于上述250ml烧杯中，加入0.3834g的edc，30min后，加入0.2302gnhs，反应25min后，加入0.4000g的赖氨酸，37℃下反应10h；反应完成，把溶液转移到分子截留量为5000da的透析袋中于500ml超纯水中透析72h，每隔8h置换一次超纯水；透析完成，将透析袋的液体转移至玻璃培养皿，使用真空冷冻干燥箱，冷冻干燥24h；得到冻干的lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶。

由于我们采用了赖氨酸改性,与中国专利cn107383393相比，在改性步骤中反应时间缩短为10h，避免了现有技术中使用超声蠕动泵所必要的过长的反应时间，在保证现有技术优势的同时，极大的简化了制备步骤，并在现有技术的基础上增加了更多的功能性特点。此外，反应温度调整为37℃，更加贴合人体温度，保证了药物载体在实际应用时不会因为环境温度差异对载体本身造成破坏和降解。由于赖氨酸是人体必需氨基酸，所制备的纳米水凝胶在体内降解后对身体无任何伤害，反而能够补充人体所需赖氨酸。

通过上述方法获得的赖氨酸改性羧甲基壳聚糖纳米水凝胶，是一种性能更加优异的药物载体，其性能结果如下：

制得的纳米水凝胶形貌为圆球状，尺寸大小相对均匀，原料特有的空腔结构适合载药；纳米水凝胶的粒径会随环境ph环境的变化而改变，在ph值为7.0时粒径最小，为140.1nm，具有ph敏感性；体外模拟降解容易且时间较短；载药和释药率较之发明人的在先申请和其他现有技术有所提高；经体外细胞实验验证载体本身对正常细胞无细胞毒性。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

(1)本发明用琥珀酸苷对β-环糊精进行改性增加了可修饰的羧基，再通过羧基与氨基反应接枝壳聚糖，在此基础上选择具有双氨基单羧基的人体氨基酸进行改性，以共价键为桥梁将不同原料接枝在一起，增加分布均匀对称性强的氨基及羧基使制得的水凝胶能对特定ph敏感，原料都取自天然物质，生物相容性高。

(2)本发明制备的纳米水凝胶稳定性好，粒径分布均匀，大小均一，分散性好，安全无毒副作用，并能充分利用空腔负载疏水性药物，在降低用药频率的基础上有效提高生物利用度，利用水凝胶特有的溶胀性释药机制，实现缓释，达到长效给药的目的。

(3)本发明制备的赖氨酸改性羧甲基壳聚糖纳米水凝胶药物载体，不仅适用于盐酸小檗碱，还适用于其他疏水性药物，应用前景广泛。

【附图说明】

图1是suc-β-cd和β-cd的傅里叶红外光谱对比图；

图2是cmc-g-suc-β-cd与lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶的傅里叶红外光谱对比图；

图3是cmc-g-suc-β-cd与lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶的透射电镜对比图，(a)cmc-g-suc-β-cd，(b)lyc-cmc-g-β-cd；

图4是lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶的原子力电镜图；

图5是lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶在不同ph值下的(a)粒径变化图及(b)zeta电位值；

图6是lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶体外降解曲线图；

图7是lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶对盐酸小檗碱的累计释放曲线图；

图8是lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶的细胞毒性实验结果图。

【具体实施方式】

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而非用于限定本发明的范围。

实施例1

lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶的制备方法，具体步骤如下：

(1)suc-β-cd的制备

取500ml的三口烧瓶置于智能温控双频超声波反应器，调节超声仪器频率为40khz，量取250mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)加入三口烧瓶，设定温度80℃，缓慢加入22.7000g(20mmol)纯化β-cd，称取2.0014g(20mmol)的琥珀酸酐，设定反应时间6h。反应结束，将反应液倒入至1000ml烧杯，冷却至室温。向烧杯中加入三氯甲烷得到大量白色絮状沉淀物，使用真空泵抽滤得到白色固体。用300ml丙酮分3次洗涤，取洗涤过的固体，放入真空干燥箱中，在反应时设定的相应温度下干燥12h。

(2)cmc-g-suc-β-cd共聚物的制备

取一支洁净的250ml三口烧瓶，于恒温反应槽中，反应槽温度设定37℃。向烧瓶中加入100mlnacl溶液，称量步骤1得到的改性β-cd2.4636g于上述烧杯中，加入0.3835g的edc，用以活化琥珀酸酐改性的β-cd上的羧基，30min后，加入0.2301g的nhs(确定edc和nhs的摩尔比为1:1)，反应25min后，加入4.9272g的cmc，37℃下反应12h。反应完成后，把反应溶液转移到分子截留量为5000da的透析袋中于500ml超纯水中透析72h，每隔8h置换一次超纯水。透析完成后，将透析袋的液体转移至玻璃培养皿，冷冻干燥24h，得到冻干的cmc-g-suc-β-cd。

(3)lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶的制备

取一支洁净的250ml三口烧瓶，放置于恒温反应槽，温度设定37℃。向烧瓶中加入100mlnacl溶液，称取步骤2得到的cmc-g-β-cd2.0000g于250ml烧杯中加入0.3834g的edc，30min后，加入0.2302gnhs，反应25min后，加入0.4000g的赖氨酸，37℃下反应10h。反应完成，把溶液转移到分子截留量为5000da的透析袋中于500ml超纯水中透析72h，每隔8h置换一次超纯水。透析完成，将透析袋的液体转移至玻璃培养皿，使用真空冷冻干燥箱，冷冻干燥24h。得到冻干的lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶。

上述获得的所述的赖氨酸改性羧甲基壳聚糖纳米水凝胶，其结构式如下：

n＝25～35。

实施例2

lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶的制备方法，具体步骤如下：

(1)suc-β-cd的制备

取500ml的三口烧瓶置于智能温控双频超声波反应器，调节超声仪器频率为40khz，量取250mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)加入三口烧瓶，设定温度80℃，缓慢加入22.7000g(20mmol)纯化β-cd，称取2.0014g(20mmol)的琥珀酸酐，设定反应时间6h。反应结束，将反应液倒入至1000ml烧杯，冷却至室温。向烧杯中加入三氯甲烷得到大量白色絮状沉淀物，使用真空泵抽滤得到白色固体。用400ml丙酮分3次洗涤，取洗涤过的固体，放入真空干燥箱中，在反应时设定的相应温度下干燥12h。

(2)cmc-g-suc-β-cd共聚物的制备

取一支洁净的250ml三口烧瓶，于恒温反应槽中，反应槽温度设定37℃。向烧瓶中加入nacl溶液，称量步骤1得到的改性β-cd2.4636g于250ml烧杯中，加入4.9272g的cmc，37℃下反应12h。反应完成后，把反应溶液转移到分子截留量为5000da的透析袋中透析72h，每隔8h置换一次纯净水。透析完成后，保留少量溶液进行表征测试。将透析袋的液体转移至玻璃培养皿，冷冻干燥24h，得到冻干的cmc-g-suc-β-cd。

(3)lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶的制备

取一支洁净的250ml三口烧瓶，放置于恒温反应槽，温度设定37℃。向烧瓶中加入100mlnacl溶液，称取步骤2得到的cmc-g-β-cd2.0000g于250ml烧杯中，加入0.4000g的赖氨酸，37℃下反应10h。反应完成，把溶液转移到分子截留量为5000da的透析袋中透析72h，过8h置换一次超纯水。透析完成，将透析袋的液体转移至玻璃培养皿，使用真空冷冻干燥箱，冷冻干燥24h。得到冻干的lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶。

实施例3

lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶的制备方法，具体步骤如下：

(1)suc-β-cd的制备

取500ml的三口烧瓶置于智能温控双频超声波反应器，调节超声仪器频率为40khz，量取250mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)加入三口烧瓶，设定温度70℃，缓慢加入22.7000g(20mmol)纯化β-cd，称取2.0014g(20mmol)的琥珀酸酐，设定反应时间5h。反应结束，将反应液倒入至1000ml烧杯，冷却至室温。向烧杯中加入三氯甲烷得到大量白色絮状沉淀物，使用真空泵抽滤得到白色固体。用500ml丙酮分3次洗涤，取洗涤过的固体，放入真空干燥箱中。在反应时设定的相应温度下干燥12h，即得琥珀酸酐改性β-cd。

(2)cmc-g-suc-β-cd共聚物的制备

取一支洁净的250ml三口烧瓶，于恒温反应槽中，反应槽温度设定37℃。向烧瓶中加入nacl溶液(100ml0.1mol·l-1)，称量步骤1得到的改性β-cd2.4636g于250ml烧杯中，加入0.3835g的edc，用以活化琥珀酸酐改性的β-cd上的羧基，30min后，加入0.2302g的nhs(确定edc和nhs的摩尔比为1:1)，反应25min后，加入4.9272g的cmc，37℃下反应6h。反应完成后，把反应溶液转移到分子截留量为5000da的透析袋中透析72h，每隔8h置换一次纯净水。透析完成后，保留少量溶液进行表征测试。将透析袋的液体转移至玻璃培养皿，冷冻干燥24h，得到冻干的cmc-g-suc-β-cd。

(3)lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶的制备

取一支洁净的250ml三口烧瓶，放置于恒温反应槽，温度设定37℃。向烧瓶中加入100mlnacl溶液，称取步骤2得到的cmc-g-β-cd2.0000g于250ml烧杯中，加入0.3834g的edc，30min后，加入0.2302gnhs，反应25min后，加入0.4000g的赖氨酸，37℃下反应5h。反应完成，把溶液转移到分子截留量为5000da的透析袋中透析72h，过8h置换一次超纯水。透析完成，将透析袋的液体转移至玻璃培养皿，使用真空冷冻干燥箱，冷冻干燥24h。得到冻干的lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶。

实验例

lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶的表征及性能研究

针对实施例1，我们通过下述分析手段来表征产物的结构性质。我们做了suc-β-cd和β-cd的傅里叶红外光谱测试，图1为suc-β-cd和β-cd的傅里叶红外光谱对比图，3380cm^-1处是o-h的伸缩振动吸收峰，2916cm^-1处是c-h键的伸缩振动吸收峰。α-型糖苷键的特征吸收在1013cm^-1左右，说明β-cd是以α-1,4糖苷键连接的。比较两图可知，suc-β-cd的傅里叶红外光谱图比β-cd的傅里叶红外光谱图多出在1732cm^-1处的特征峰，对应c＝o，这说明在β-cd上引入了羧基，能够判断成功用琥珀酸酐改性β-cd。

对cmc和cmc-g-suc-β-cd进行gpc测试，采用重均分子量(mw)来表示个样品的分子重量，cmc的分子量为41327da，共聚物为46587da，差值为5260da，为接枝的suc-β-cd重量，能够判断cmc-g-suc-β-cd成功接枝，cmc和cmc-g-suc-β-cd的gpc的相关分子量如下：

对cmc-g-suc-β-cd与lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶进行傅里叶红外光谱的测试，图2为cmc-g-suc-β-cd与lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶的傅里叶红外光谱对比图，cmc-g-suc-β-cd的傅里叶红外光谱图比lyc-cmc-g-β-cd的傅里叶红外光谱图少了在1700cm^-1处的特征峰，1610cm^-1处的特征峰也有所加强，这说明在lyc-cmc-g-β-cd上接入新的酰胺键，能够判断成功用赖氨酸接枝cmc-g-suc-β-cd。

对cmc-g-suc-β-cd与lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶进行透视电镜测试和原子力电镜测试，图3(a)中可以看到存在一些圆形的球状粒子，图3(b)有了很大程度的改善，这归功于赖氨酸中氨基和羧基的引入，改善了纳米水凝胶的表面性质，此外在冻干过程中加入了7％甘露醇冻干保护剂也起到了作用。图4表明共聚物的尺寸分布在140-160nm范围内，尺寸足够小且均匀分布的，比表面积大，可以实现较高的载药效率。

分析lyc-cmc-g-β-cd不同ph值下的粒径变化，图5(a)为lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶在不同ph值下的粒径变化图，不同ph值下的粒径差别较大，表明制备的纳米水凝胶有ph敏感性，粒径最小为140.1nm，此时ph值为7.0，(b)为lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶在不同ph值下的zeta电位值变化，等电点在ph6.5-7.5之间，此时纳米水凝胶不带电荷，内部没有电荷排斥力，粒径最小，与粒径测试分析中最小粒径在ph值7.0附近结论一致。

对lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶进行体外模拟降解实验。图6为lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶体外降解曲线，模拟人体环境配置ph7.4的pbs缓冲溶液，将定量的lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶溶于缓冲溶液中，通过分子截留量为30000da的透析袋透析，在特定时间间隔下取透析袋中溶液进行冷冻干燥，称量剩余质量，图6标示出纳米水凝胶在不同时间间隔下的剩余质量百分比，可见lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶在12天可以实现85％以上降解。

选择疏水性药物盐酸小檗碱为模型药物，用lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶进行载药，模拟盐酸小檗碱的水溶液标准曲线y＝0.1102x+0.0485(r²＝0.99801)，计算lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶对盐酸小檗碱的包封率为51.13％，载药率为29.03％。研究了盐酸小檗碱0-48h的累计释药量，图7为lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶对盐酸小檗碱的累计释放曲线，盐酸小檗碱的累积释放量达40.2％，结果表明lyc-cmc-g-β-cd水凝胶对盐酸小檗碱有明显的缓释作用，适用于24小时内的药物应用。

对lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶进行细胞毒性检测，选择人内皮细胞为正常细胞实验对象，通过mtt法测定其对正常细胞的毒性。将复苏的人内皮细胞在dmem高糖培养基(5％双抗和10％胎牛血清)中培养(co2培养箱，37℃)，使用磷酸缓冲盐溶液(pbs)清洗培养基，加入适量胰蛋白酶，在co2培养箱中消化60s。加入适量培养基并用胶头滴管将贴壁细胞吹起悬浮。在显微镜下对细胞进行直接计数，通过计算以及补充dmem培养基，将细胞的密度控制为5×10⁴个/ml。取200μl的细胞液加入96孔细胞培养板中，将96孔板继续放入co2培养箱培养24h，培养箱温度设置37℃。后取出96孔板，pbs清洗后每孔加入实施例1制得的lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶，设置5个浓度梯度，进行3次平行试验，设置两组对照组。浓度梯度设置：50、100、150、200、250μg/ml。于co2培养箱中培养48h后，加入0.5％mtt试剂。在o2培养箱中继续培养4h，取出，将96孔板中的混合溶液倒出后，向每个小孔中加入200μl二甲基亚砜。37℃恒温振荡器中震荡10min，利用酶标仪测量490nm处每个孔对应样品的吸光值，计算其细胞存活率，根据细胞存活率判断是否具有细胞毒性。

图8为纳米水凝胶的细胞毒性mtt实验结果，细胞存活率均高于85％，通过mtt实验表明制备的纳米水凝胶对正常细胞没有毒性，由于赖氨酸的加入，纳米水凝胶降解后有益于细胞的生长。通过性能实验，可以判定lyc-cmc-g-β-cd纳米水凝胶适合作为药物载体，能够进行药物的负载和人体环境下的缓释，实现治疗相应疾病的作用。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除