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您当前的位置： 一种HER2+乳腺癌靶向蛋白复合纳米粒及其制备方法和应用与流程
2021-01-08 12:01:20|
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本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及一种her2+乳腺癌靶向蛋白复合纳米粒及其制备方法和应用。
背景技术：
2018-2020年世界癌症分析报告中指出，在全球范围内乳腺癌的发病率一直位居女性恶性肿瘤首位，是40-55岁女性的第一位死亡原因。目前，乳腺癌治疗主要是集中在手术治疗、化疗、放疗、内分泌治疗、分子靶向治疗等。虽然治疗方法已经比较完善，但由于乳腺癌存在异质性，其中20-30％乳腺癌高表达her2蛋白，治疗后存在不同程度的肿瘤耐药、复发、转移等问题。因此，找到合适的方法解决肿瘤耐药、转移等问题是当前研究的热点和所需攻克的难点。
her2阳性乳腺癌患者对内分泌治疗和标准化治疗的效果均不佳，预后较差，其存活率仅为her2阴性乳腺癌患者的一半。目前临床上针对her-2阳性患者的药物主要有曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、拉帕替尼等。包括nsabpb-31、ncctgn9831、hera、bcirg006、finher、pacs04等多项临床试验证实，辅助治疗蒽环紫杉类方案中，联合曲妥珠单抗可进一步降低患者的复发风险。而靶向治疗中抗体能够利用特异的靶抗原识别肿瘤细胞，因其靶向性好、具有较好的临床疗效，因此近年来靶向药物已成为生物制药领域的研究热点。然而,目前临床使用的抗体药物存在诸多不足，如完整的抗体分子由于其分子量大而穿透性差，难以穿过结缔组织而达到实体肿瘤部位；临床使用剂量大，生产成本高昂，而且大多数具有较强的副作用。运用在晚期乳腺癌患者中的曲妥珠单抗单独用药时对超过40％的患者用药后出现不良反应，约70％患者会产生耐药性(nielsenfc,hansenvo,
靶向给药系统能将药物运送到靶器官和靶细胞，使病变部位药物高度集中，最大限度提高治疗效果，被认为是最适宜的抗癌制剂，从而受到各国医学界的高度重视。针对乳腺癌靶向治疗出现了抗体介导的靶向、微载体介导的靶向、乳腺癌干细胞靶向等研究领域，为乳腺癌的治疗研究奠定了理论基础。靶向药物选择性杀伤依赖靶分子的肿瘤细胞，较细胞毒类药物更为安全高效。需要注意的是，肿瘤的存活并非依靠单一靶点，仅仅抑制一个靶点，肿瘤仍然可能转移复发，因此多靶点作用将是靶向药物的发展趋势。
tp53抑癌基因是所有癌症类型中最常见的突变基因，在所有乳腺癌中约占比30％。在正常情况下，细胞内的p53蛋白维持在很低的水平，在各种压力(如dna损伤、致癌基因激活等)下，p53蛋白经历翻译后修饰，导致其在细胞内的激活、稳定和积累。当肿瘤发生时，p53大量激活，诱导靶基因的上调或下调，进而出现细胞周期停止、dna修复、衰老或凋亡，因此以p53及其复合物为靶点，成为当下开发新的抗癌药物的研究热点。乳腺癌中p53基因的突变大多数发生在dna结合域，导致p53蛋白合成受阻，进一步引起细胞分裂周期的紊乱和细胞凋亡的失调，细胞转变成为永生状态。
基于智能癌症纳米医学的联合疗法。将纳米药物整合到多模式化疗方案中可减少副作用，改善患者依从性并改善生活质量；通过按比例分配多种药物，从而通过改善对药代动力学和药效相互作用的控制来促进协同药物作用；与经批准的抗癌药物共同治疗有助于增强血管和肿瘤微环境的递送效率，从而增强癌症纳米药物的积累，渗透和功效。局部组合：通过放射治疗、超声处理改变肿瘤微环境以增加血管灌注和通透，改善癌症纳米药物的积累，渗透，保留和功效；热疗可用于局部触发对温度敏感的脂质体的有效负载释放，从而导致药物增加。设计生成小型、高效和低毒的靶向药物已成为抗体药物研发的新趋势。
综上所述，如今传统癌症治疗手段在提高乳腺癌存活率以及降低患者不良预后方面仍具有一定的局限性。靶向治疗、光动力治疗和蛋白药物治疗作为新兴的治疗手段已成为乳腺癌治疗的选择。纳米胶束作为一种纳米载体可被开发用作蛋白药物的保护及靶向递送。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种her2+乳腺癌靶向蛋白复合纳米粒及其制备方法和应用。
本发明的第一个目的在于提供一种her2+乳腺癌靶向蛋白复合纳米粒。
本发明的第二个目的在于提供一种her2+乳腺癌靶向蛋白复合纳米粒的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供任一所述的制备方法制备得到的一种her2+乳腺癌靶向蛋白复合纳米粒。
本发明的第四个目的在于提供所述的her2+乳腺癌靶向蛋白复合纳米粒在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：
本发明中，通过利用异型双功能交联剂spdp在p53蛋白质分子的游离氨基上引入吡啶二硫基，再在dtt的作用下将吡啶二琉基还原成巯基，以形成二硫键的方式与雌激素受体的抗体anti-er交联；首先以光敏剂藻蓝蛋白和化疗药物紫杉醇为底物，化学催化合成一端亲水(藻蓝蛋白端)、一端疏水(紫杉醇端)的复合物，同时在藻蓝蛋白上修饰人表皮生长因子受体2的抗体anti-her2，合成ptc/pc/anti-her2；此后荷载经anti-er共价结合的外源p53蛋白，合成最终纳米蛋白复合物p53/anti-er@ptx/pc/anti-her2。通过静脉注射给药方式和anti-her2蛋白分子的靶向作用，将具有抑制乳腺癌细胞增殖作用效果的蛋白纳米复合物运送至肿瘤细胞内。通过提高乳腺癌细胞内凋亡相关蛋白的表达量来诱导乳腺癌细胞程序性死亡，从而达到高效抑制癌细胞生长的作用效果。实验证明本发明所述递药系统具有毒副作用低，对癌细胞生长具有明显的抑制效果，并且提出一种将药物分子与不同靶向蛋白分子交联来克服肿瘤异质性的药物合成理念，自主合成的蛋白纳米复合物是一种新型的多重靶向给药系统。
因此本发明要求保护一种her2+乳腺癌靶向蛋白复合纳米粒，所述靶向蛋白复合纳米粒为在ptx/pc/anti-her2胶束内部装载有蛋白复合物p53/anti-er的蛋白复合纳米粒；其中，蛋白复合物p53/anti-er为凋亡相关蛋白p53与雌激素受体的抗体anti-er以二硫键交联获得的蛋白复合物；
ptx/pc/anti-her2胶束为藻蓝蛋白pc与人表皮生长因子受体2的抗体anti-her2以酰胺键交联得到的蛋白复合物pc/anti-her2中的藻蓝蛋白pc再与紫杉醇ptx以酯键交联得到的蛋白复合物藻蓝蛋白/紫杉醇复合物/人表皮生长因子受体2的抗体ptx/pc/anti-her2自组装形成胶束ptx/pc/anti-her2。
紫杉醇(ptx)是应用最广泛的抗癌药物，被应用于治疗各种类型的恶性疾病。紫杉醇(ptx)是一类紫杉烷类药物，是一种影响微管稳定性的抗肿瘤药物，在众多癌症中应用广泛的化疗药物。在临床上已经广泛用于乳腺癌、卵巢癌和部分头颈癌和肺癌的治疗，目前应用紫杉醇治疗癌症的障碍不是紫杉醇有效性的问题，而是其毒性问题。ptx作为一种主要的抗癌化疗药物，其应用面临的全球性挑战是减少副作用和提高药物效率。在临床治疗过程中，病人出现耐药性也是主要的障碍，而联合用药是治疗耐药性的常用方法。目前已经上市多种紫杉醇药物，如泰素、紫杉醇注射液、紫杉醇微乳注射液、注射用紫杉醇聚合物胶束等。
藻蓝蛋白是一种从螺旋藻等藻类中提取的相对分子质量为30kda的生物活性化合物，呈空心齿缘盘状构象，其光敏特性可能与分子结构中开链的四吡咯化合物结构相关，具有抗肿瘤活性、安全无毒、无免疫原性的优点。藻蓝蛋白也可以清除受损的神经细胞自由基，避免dna氧化损伤，从而防止自由基引起的神经细胞凋亡。gantar用10％常规剂量的拓扑替康和藻蓝蛋白联合作用治疗前列腺癌(lncap),结果表明,两者联合用药的效果远远高于两者单独作用。藻蓝蛋白和拓扑替康联合使用激活了caspase9和caspase-3的表达活性,增加了氧自由基(ros)的表达水平，诱导肿瘤细胞的凋亡,并且降低了拓扑替康单独使用时的副作用。
本发明还要保护一种her2+乳腺癌靶向蛋白复合纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
s1.藻蓝蛋白pc与人表皮生长因子受体2的抗体anti-her2以酰胺键交联，得到亲水性的蛋白复合物pc/anti-her2；
s2.紫杉醇ptx与藻蓝蛋白pc以酯键交联，获得蛋白复合物藻蓝蛋白/紫杉醇复合物/人表皮生长因子受体2的抗体ptx/pc/anti-her2，自组装形成胶束ptx/pc/anti-her2；
s3.凋亡相关蛋白p53与雌激素受体的抗体anti-er以二硫键交联，获得蛋白复合物p53/anti-er；
s4.打散胶束ptx/pc/anti-her2，与蛋白复合物p53/anti-er混合，使蛋白复合物p53/anti-er装载到ptx/pc/anti-her2胶束内部，继而获得最终的纳米粒子p53/anti-er@ptx/pc/anti-her2。
本发明通过给予外源人源p53蛋白实现提高癌细胞内部p53蛋白的浓度，克服p53基因突变导致的促凋亡蛋白p53表达量下降等问题。p53蛋白浓度的提高能促进细胞凋亡通路其他作用蛋白的合成或阻滞细胞周期的进行，从而加快癌细胞凋亡的进程或抑制其细胞增殖。
优选地，步骤s1中，催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐nhs和n-羟基丁二酰亚胺edc催化藻蓝蛋白pc与人表皮生长因子受体2的抗体anti-her2以酰胺键交联。
更优选地，包括以下步骤：
s11.pbs缓冲液中edc、nhs和pc避光反应；
s12.之后反应液与her2抗体避光反应；
s13.冷冻干燥保存。
进一步优选地，步骤s11中，edc、nhs和pc的摩尔比为5～2：5～2：3～1。
更进一步优选地，步骤s11中，edc、nhs和pc的摩尔比为2：2：1。
进一步优选地，步骤s11中，避光反应30～60min。
更进一步优选地，步骤s11中，避光反应30min。
进一步优选地，步骤s12中，藻蓝蛋白与her2抗体的用量摩尔比为1：10～1:
更进一步优选地，步骤s12中，藻蓝蛋白与her2抗体的用量摩尔比为100：1。
进一步优选地，步骤s12中，0～37℃避光，磁力搅拌器500～3000rmp反应12～48h。
更进一步优选地，步骤s12中，4℃避光，磁力搅拌器1000rmp反应24h。
进一步优选地，步骤s13中，冷冻干燥，4℃保存。
优选地，步骤s2中，使用催化剂二环己基碳二亚胺/4-二甲氨基吡啶dcc和4-二甲氨基吡啶dmap催化紫杉醇ptx与藻蓝蛋白pc以酯键交联。
更优选地，包括以下步骤：
s21.蛋白复合物pc/anti-her2的dmso溶液与二环己基碳二亚胺dcc、4-二甲氨基吡啶dmap混合避光反应；
s22.再与紫杉醇混合反应，避光反应；
s23.冷冻干燥保存。
进一步优选地，步骤s21中，pc/anti-her2、dcc和dmap的摩尔比为5～1：3～1：3～1。
更进一步优选地，步骤s21中，pc/anti-her2、dcc的dmap的摩尔比为3：3：1。
进一步优选地，步骤s21中，避光反应30～60min。
更进一步优选地，步骤s21中，避光反应30min。
进一步优选地，pc/anti-her2：ptx的摩尔比为10～1:5～1。
更进一步优选地，步骤s22中，pc/anti-her2：ptx的摩尔比为1：3。
进一步优选地，步骤s21中，避光反应10～60min。
更进一步优选地，步骤s21中，避光反应30min。
进一步优选地，步骤s23中，磁力搅拌器1000～3000rmp，0～37℃避光反应12～48h。
更进一步优选地，步骤s23中，磁力搅拌器1800rmp，4℃避光反应24h。
优选地，步骤s3中，使用催化剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯spdp和二硫苏糖醇dtt化学催化凋亡相关蛋白p53与雌激素受体的抗体anti-er以二硫键交联。
本发明通过异种官能团交联剂spdp在p53蛋白和er抗体间形成二硫键，实现两种蛋白的交联。将与细胞凋亡路径密切相关的蛋白应用于靶向药物上，拓宽了靶向药物的设计思路。合成的蛋白粒子不仅能特异靶向her2阳性乳腺癌细胞，实现精准给药，而且交联形成的二硫键在细胞内易特异性降解，使作用蛋白得以释放，达到良好的治疗效果。
更优选地，包括以下步骤：
s31.spdp乙醇溶液与p53蛋白混合反应，浓缩；
s32.上一步的产物与dtt溶液反应，浓缩；
s33.spdp乙醇溶液与er抗体蛋白混合反应，浓缩；
s34.步骤s32的产物和步骤s33的产物室温混匀反应，浓缩。
进一步优选地，步骤s31中，spdp与p53蛋白的质量比为10～5:1。
更进一步优选地，步骤s31中，spdp与p53蛋白的质量比为8:1。
进一步优选地，步骤s31中，室温反应10～60min。
更进一步优选地，步骤s31中，室温反应30min。
进一步优选地，步骤s32中，dtt和p53蛋白用量的质量比为1000～100：10～1。
更进一步优选地，步骤s32中，dtt和p53蛋白用量的质量为500：1。
进一步优选地，步骤s32中，室温反应10～60min。
更进一步优选地，步骤s32中，室温反应30min。
进一步优选地，步骤s33中，spdp与er抗体蛋白的质量比为10～5:1。
更进一步优选地，步骤s33中，spdp与er抗体蛋白的质量比为8:1。
进一步优选地，步骤s33中，室温反应10～60min。
更进一步优选地，步骤s33中，室温反应30min。
进一步优选地，步骤s34中，p53蛋白和er抗体蛋白用量的摩尔比10～1:5
更进一步优选地，步骤s34中，p53蛋白和er抗体蛋白用量的摩尔比1:5。
进一步优选地，步骤s34中，室温反应10～60min
更进一步优选地，步骤s34中，室温反应30min。
进一步优选地，所述浓缩为使用peg20000作为透析液，0～37℃透析12～48h，中间换透析液1～5次。
更进一步优选地，所述浓缩为使用peg20000作为透析液，4℃透析24h，中间换透析液3次。
优选地，步骤s4中，超声打散胶束ptx/pc/anti-her2。
更优选地，包括以下步骤：
s41.胶束ptx/pc/anti-her2的pbs缓冲液溶液用声分散仪进行打散处理；
s42.上一步的产物与步骤s3的产物混合。
更进一步优选地，胶束ptx/pc/anti-her2的pbs缓冲液溶液中胶束ptx/pc/anti-her2的浓度为0.1～0.5μg/ml，打散后的胶束ptx/pc/anti-her2与步骤s3的产物混合，两针的体积比为5～1：5～1。
再进一步优选地，胶束ptx/pc/anti-her2的pbs缓冲液溶液中胶束ptx/pc/anti-her2的浓度为0.125μg/ml，打撒后的胶束ptx/pc/anti-her2与步骤s3的产物混合，两针的体积比为1：1。
更进一步优选地，超声分散仪的在50～200w打散5～30s。
再进一步优选地，超声分散仪的在100w打散20s。
更进一步优选地，室温震荡混合5～60min
再进一步优选地，室温震荡混合30min
以上任一所述的制备方法制备得到的一种her2+乳腺癌靶向蛋白复合纳米粒也属于本发明的保护范围。
所述her2+乳腺癌靶向蛋白复合纳米粒在制备治疗乳腺癌的药物中的应用也属于本发明的保护范围。
优选地，所述药物提高乳腺癌细胞内凋亡相关蛋白的表达量来诱导乳腺癌细胞程序性死亡，从而达到高效抑制癌细胞生长的作用效果。
优选地，所述药物针对于her2阳性乳腺癌患者。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过外源合成的p53蛋白连接er抗体，ptx/pc/anti-her2胶束荷载确保蛋白复合纳米粒的生物活性的条件下，靶向作用于her2阳性的乳腺癌细胞。合成的p53复合蛋白纳米粒子靶向进入her2阳性乳腺癌细胞后，增加乳腺癌细胞中与细胞凋亡过程密切相关的p53蛋白的浓度，克服了基因治疗中外源基因在癌细胞内表达量低的问题。同时，蛋白复合纳米粒能促进细胞凋亡通路其他蛋白的表达，促进癌细胞的凋亡，抑制异质性乳腺癌细胞的生长增殖，在一定程度上解决由于p53基因突变而导致的细胞癌变和转移等问题。另一方面，紫杉醇在杀伤癌细胞方面具有良好的效果，对于迅速分裂肿瘤细胞，紫杉醇冻结有丝分裂的纺锤体，从而使肿瘤细胞停止在g2期和m期，直至死亡；紫杉醇也作用于巨噬细胞上的肿瘤坏死因子(tnf)受体，促使释放白介素(il)-1、tnf-2等对肿瘤细胞起杀伤作用或者抑制肿瘤细胞的迁移。
本发明成功合成的p53复合蛋白纳米粒子能靶向进入her2阳性的乳腺癌细胞，增加乳腺癌细胞中与细胞凋亡过程密切相关的p53蛋白的浓度，改变因p53基因突变而导致的相关蛋白表达量过少的状况，并且克服了基因治疗中外源基因在癌细胞内表达量低的问题，在解决了由于p53基因突变而导致的细胞癌变和转移等问题。
附图说明
图1为p53/anti-er@ptx/pc/anti-her2蛋白纳米复合物合成示意图。
图2为ptx/pc/anti-her2临界胶束浓度(cmc)。
图3为ptx/pc/anti-her2胶束透射扫描图。
图4为动态光散射结果。
图5为ptx/pc核磁共振h谱分析结果。
图6为不同浓度p53纳米粒子作用于乳腺癌mcf7细胞效果检测。
图7为cck-8检测药物作用24h后的细胞活力。
图8为dapi染色与核靶向结果。
图9为纳米药物抑制sk-br-3细胞的迁移。
图10为小鼠体重变化。
图11为药物处理后肿瘤大小的变化。
图12为天然纳米胶束复合物体内抑制小鼠乳腺癌模型乳腺癌治疗效果分析。
图13为免疫组化检测肿瘤组织中ki67和bax表达情况：生理盐水对照组；p53组；ptx/pc组；p53/anti-er@ptx/pc/anti-her2组。
图14为小鼠治疗28天后血液常规指标检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
1、细胞株
人乳腺癌细胞(mcf-7细胞系)由中国科学院深圳先进技术研究院提供，经本实验室传代培养。
sk-br-3细胞系和4t1细胞系均由上海生物科学研究所细胞资源中心提供，经本实验室传代培养。
2、主要试剂、仪器
p53蛋白、藻蓝蛋白、紫杉醇、抗体her2、抗体er、spdp[n-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯]、dtt(二硫苏糖醇)、磷酸缓冲液pbs、dmso(二甲基亚砜)、dcc(二环己基碳二亚胺)、dmap(4-二甲氨基吡啶)，透析袋(500k、1000k)
胰酶、低糖dmem培养基均为gibcobrl公司产品；新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；96孔聚苯乙烯组织培养基板为美国corning康宁公司产品。
nikon显微镜，日本olympus公司光学倒置显微镜，sigma32184高速冷冻离心机，thermoco2培养箱，江苏省金坛市医疗仪器厂78-1磁力搅拌器，hv-85高压灭菌器，无菌操作台，广州科桥实验技术设备有限公司恒温水浴锅等。
实施例1ptx/pc/anti-her2@p53/anti-er蛋白纳米复合物的制备
1、使用催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/n-羟基丁二酰亚胺(nhs/edc)催化光敏剂藻蓝蛋白(pc)与人表皮生长因子受体2的抗体(anti-her2)以酰胺键交联，得到亲水性的蛋白复合物pc/anti-her2。
具体操作为：
按edc/nhs＝1，pc/edc＝1/2的摩尔比称取edc22.9mg(120μmol)、nhs13.8mg(120μmol)、pc35.16mg(60μmol)加入至10mlpbs缓冲液中，避光反应30min，活化藻蓝蛋白后缓慢滴入10μlher2抗体(0.6μmol)，在4℃、避光，磁力搅拌1000rmp条件下反应24h；冷冻干燥，放置4℃冰箱保存，为后续实验做准备。
2、随后使用催化剂二环己基碳二亚胺/4-二甲氨基吡啶(dcc/dmap)催化疏水性的化疗药物紫杉醇(ptx)与藻蓝蛋白(pc)以酯键交联，获得一端亲水、一端疏水的藻蓝蛋白/紫杉醇复合物ptx/pc/anti-her2，该复合物在临界浓度下可自组装形成胶束。
具体操作为：
称取pc/anti-her2固体58.64mg(9μmol)加入3mldmso中，使其充分溶解后加入dcc1.85mg(9μmol)、dmap0.37mg(3μmol)，避光室温下反应30min，藻蓝蛋白羧基活化后加入紫杉醇ptx25.59mg(30μmol)，在磁力搅拌器上(1800rmp)4℃避光反应24h，冷冻干燥，放置4℃冰箱保存，为后续实验做准备。
3、使用催化剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯/二硫苏糖醇(spdp/dtt)化学催化凋亡相关蛋白p53与雌激素受体的抗体(anti-er)以二硫键交联，获得蛋白复合物p53/anti-er。
具体操作为：
用无水乙醇溶解spdp，配制1mg/ml的spdp乙醇溶液，按spdp：蛋白为8∶1(m：m)的比例，将48μlspdp乙醇溶液和10μlp53蛋白(0.6mg/ml)，室温反应30min后置于pbs缓冲液4℃透析24h，中间换透析液3次，然后使用peg20000固体颗粒置于容器中，将透析袋置于peg20000固体颗粒中，利用peg20000固体颗粒吸水浓缩液体体积至1ml左右，加入3mldtt溶液(10mg/ml)，室温摇匀30min，在pbs缓冲液中4℃透析24h，透析完毕后备用；
用无水乙醇溶解spdp，得1mg/ml的spdp乙醇溶液，按spdp：蛋白为8∶1(m：m)的浓度比分别加入48μlspdp和10μler蛋白(0.6mg/ml)，室温反应30min后置于pbs缓冲液4℃透析24h，中间换透析液3次，使用peg20000浓缩体积至1ml左右；
将spdp处理后er抗体蛋白与spdp处理后p53蛋白混合(p53蛋白和er抗体蛋白用量的摩尔比1:5)，室温摇匀反应30min，然后使用peg20000固体颗粒置于容器中，将透析袋置于peg20000固体颗粒中，利用peg20000固体颗粒吸水浓缩液体体积至1ml左右，为后续实验做准备。
4、超声打散ptx/pc/anti-her2胶束，混入预先合成的蛋白复合物p53/anti-er，使p53/anti-er装载到ptx/pc/anti-her2胶束内部，继而获得最终的纳米粒子p53/anti-er@ptx/pc/anti-her2。
具体操作为：
用pbs缓冲液配制0.125μg/ml的ptx/pc/anti-her2胶束溶液1ml，超声分散仪100w20s进行打散处理后滴入1ml步骤3中浓缩后的p53/anti-er溶液，室温震荡30min，ptx/pc/anti-her2在疏水作用下将p53/anti-er包裹，继而获得最终的纳米粒子p53/anti-er@ptx/pc/anti-her2。
p53/anti-er@ptx/pc/anti-her2蛋白纳米复合物合成示意图如图1。
实施例2ptx/pc/anti-her2@p53/anti-er蛋白纳米复合物的表征
一、紫外全波段扫描
1、实验方法
通过紫外可见分光光度计，在190-900nm的波长范围内对样品进行扫描，可以获得样品在这个波长范围内的最大吸收波长。用p53蛋白为样品1，合成所得的蛋白复合物为样品2，然后以分散剂水为参比液，分别取适量的样品于比色皿中，在190-900nm的范围内进行光谱扫描检测。
具体的，配制浓度为1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml的ptx/pc溶液，震荡使其充分溶解，设置分光光度计(型号)波长为590nm，测不同浓度的ptx/pc胶束在590nm处的吸收值，每个浓度重复三次，
2、实验结果
结果如图2所示，经计算得到ptx/pc/anti-her2的cmc为0.125μg/ml。
二、扫描电镜检测
1、实验方法
合成蛋白纳米复合物，将样品体积到1ml后取出20μl，送样检测。称取ptx/pc/anti-her2粉末0.01g溶于pbs缓冲液中，充分溶解后1000r离心取其上清液100μ放置ep管中，透射电镜检测。
2、实验结果
结果如图3所示，观察到合成的ptx/pc/anti-her2胶束呈圆球状，均匀分散。
三、动态光散射检测粒径大小
1、实验方法
将少量的一定浓度ptx/pc和p53/anti-er@ptx/pc/anti-her2加入样品池中，用粒度仪(vector-33，德国bruker公司)表征，作图并分析其粒径大小与分布。
2、实验结果
动态光散射结果分析表明(图4)，大部分ptc/pc胶束粒径大小在100nm左右，加入p53/anti-er后自组装形成p53/anti-er@ptx/pc/anti-her2后粒径稍有增加，最终合成粒子的粒径在80-200nm附近。
四、核磁共振氢谱检测ptx/pc成功交联
1、实验方法
分别称取ptx、pc、ptx/pc粉末0.01g溶于二甲基亚砜-d6中，充分溶解后置于冰上，使用600mhz傅里叶变换核磁共振谱仪(brukeravanceneo，德国bruker)检测其化学位移。
2、实验结果
结果如图5所示，紫杉醇特有的苯环吸收峰在合成后的样品中显得十分明显，位移分别处于图中1-9，在ptx/pc核磁共振h谱中紫杉醇的苯环吸收峰出现重叠形成屏蔽作用，可能是ptx/pc形成的酯键和苯环形成ρ-π超共轭现象，使得苯环上的电子云密度增加；而在藻蓝蛋白的特征峰上，只出现在甲基上的a、b、c三种，在ptx/pc呈现出来。说明已经成功合成了ptx/pc。
实施例3体外抑制乳腺癌mcf7细胞生长实验
一、细胞培养
人乳腺癌细胞(mcf-7细胞系)由中国科学院大学深圳先进技术研究院提供；sk-br-3细胞系由上海生物科学研究所细胞资源中心提供提。细胞在培养瓶中培养至80％后，以1×104/孔的密度接种至96孔板上，培养12、24、36h，以进行后续实验。mcf-7细胞培养条件为：含10％新生牛血清的高糖dmem培养基，37℃，5.0％co2。sk-br-3细胞培养条件为：含10％新生牛血清的1640培养基，37℃，5.0％co2。
二、蛋白纳米复合物体外抑制mcf-7生长研究
(一)不同浓度p53纳米粒子作用于乳腺癌mcf7细胞效果检测
1、实验方法
制备细胞悬液106/ml，接种100μl到96孔板中，接种数量为10000/孔。37℃培养孵育4h，待细胞贴壁；换无血清的培养基，加入不同浓度的p53蛋白，作用4h；加入10μl的cck-8(加cck-8前，更换培养基)，酶联免疫反应，利用酶标仪(thermofishermk3)测定450nm吸光度。2、实验结果
结果如图6所示，细胞的半致死率是p53浓度＝400ng/μl，并且发现随着p53蛋白浓度的增加，细胞活力下降的十分缓慢，400ng/μl和800ng/μl细胞活力几乎没有差异，故我们最终选择p53浓度为400ng/μl。
(二)cck-8细胞增殖检测
1、实验方法
制备细胞悬液106/ml，接种100μl到96孔板中，接种数量为10000/孔。37℃培养孵育4h，待细胞贴壁；换无血清的培养基，加入一定浓度的合成复合蛋白纳米粒，作用4h；加入10μl的cck-8(加cck-8前，更换培养基)，酶联免疫反应，利用酶标仪(thermofishermk3)测定450nm吸光度。
样品检测：避光条件下，进行酶标仪检测并进行数据处理。
数据分析：细胞存活率＝[(as-ab)/(ac-ab)]×100％；细胞抑制率＝[(ac-as)/(ac-ab)]×100％(as＝实验孔细胞数；ab＝空白孔细胞数；ac＝对照孔细胞数)。以作用时间为横坐标，以细胞存活率及细胞抑制率为为纵坐标，绘制标准曲线。
2、实验结果
结果如图7所示，纳米粒子p53/anti-er@ptx/pc/anti-her2作用于mcf-7细胞系24h后的癌细胞细胞活力是对照组的40％，而sk-er-3组的处理组活力仅为对照组的25％，表明纳米粒子对于her2阳性的sk-br-3细胞系具有更强的杀伤效果。
(五)dapi染色观察细胞核形态及细胞核靶向亚细胞定位
1、实验方法
从培养箱中取出培养好的细胞，胰酶消化2min，加4ml培养液吹打细胞。取3ml细胞悬液加到离心管中，加11ml培养液，吹打细胞，使细胞悬浮均匀。用移液枪吸取100μl细胞悬液加到24孔板中，使细胞贴壁培养6h。取出培养好的细胞，吸去细胞废液，加pbs洗两遍，加入新鲜培养基。加入定量蛋白复合粒子，孵育4h,吸取废液，pbs洗两遍。加配置好的dapi染色液染色10min，吸取废液，pbs洗两遍。加入1mltbs透膜处理5min，pbs清洗3遍，加入1ml一抗anti-p53稀释液(1:100)，4℃过夜；预冷pbs清洗3遍，再加入fitc荧光标记的二抗稀释液(1:1000)，室温避光孵育1h。预冷pbs清洗3遍。加入100μldapi稀释液(1:1000)，室温下染色10min，预冷pbs清洗三遍，使用荧光显微镜拍照，ps处理图片。，使用荧光显微镜拍照，ps处理图片。
2、实验结果
结果如图8所示，dapi染色结果表明，与control组sk-br-3细胞的细胞核比较p53/anti-er@ptx/pc/anti-her2作用24h后sk-br-3细胞活力下降，形态发生明显改变，由长梭形变为球形，说明细胞正在发生凋亡；绿色荧光fitc标记的p53蛋白合成的纳米粒子p53/anti-er@ptx/pc/anti-her2荧光与mcf-7细胞核蓝色荧光重合，表明纳米粒子具有靶向mcf-7细胞核的效果。
(七)纳米药物抑制癌细胞迁移
1、实验方法
胰蛋白酶消化sk-br-3细胞，接种至6孔板，向每孔加入5×105个细胞，培养箱中过夜培养；待细胞贴壁后，用灭菌牙签在孔中划4-5条平行线，注意牙签垂直于孔壁；沿着孔壁注入pbs，润洗3遍，去除划下的细胞，注意动作轻缓；设置两组：①p53/anti-er@ptx/pc/anti-her2；②对照组；分别加入含的p53/anti-er@ptx/pc/anti-her2无血清的培养基及无血清培养基，分别处理24h和48h；置于显微镜下观察，拍照，使用imagej软件分析细胞间距。
2、实验结果
结果如图9所示，细胞迁移实验表明，p53/anti-er@ptx/pc/anti-her2处理sk-br-3乳腺癌细胞24h细胞间隙为原来的82％、48h后细胞间隙变为原来的80％，表明在药物处理下细胞几乎没有发生迁移，而对照组在经过24h后细胞间隙明显变窄，只有原来的50％，经过48h后仅为原来的30％，说明合成的药物对癌细胞的迁移有抑制作用。
实施例4体内抑制乳腺癌mcf7细胞生长实验
一、小鼠her2+与er+乳腺癌模型构建
准备40只5周龄健康雌性balb/c小鼠，购于广州中医药大学(三元里校区)实验动物中心，生产许可证号：scxk(粤)2018-0034，待饲养至体重达到15g左右，脱毛膏腹部乳腺部位脱毛处理；体外传代培养sk-br-3及mcf-7细胞，使用pbs制备sk-br-3及mcf-71:1细胞混合悬液，细胞数量调整为1×107/ml；其中32只随机随机分成4组(分别是a：空白对照组(生理盐水)；b：ptx/pc/anti-her2组；c：游离p53组；d：p53/anti-er@ptx/pc/anti-her2组)，每组8只，使用无菌注射器吸取细胞混合悬液，接种于小鼠下腹部乳腺脂肪垫，每只小鼠注射0.1ml；另外8只为normal组不做任何处理。所有老鼠均处于相同的饲养环境，给予充足的食物与水。从接种后的第二天开始，每天测量小鼠肿瘤长(a)和宽(b)，并利用公式v＝a×b2/2计算肿瘤体积；待中肿瘤体积达到80mm3左右时开展进一步研究。
二、蛋白纳米复合物体内抑制mcf-7生长研究
(一)给药期间小鼠体重的变化
1、实验方法
从给药后的第二天开始，每两天使用称量天平测量一次小鼠体重，每只小鼠每次测三次。
2、实验结果
图10中表示为sk-br-3乳腺癌细胞成功建模的balb/c小鼠在给药期间体重的变化，在27天给药的过程中每隔2天测量一次体重，结果表明每组小鼠体重变化不大，p53/anti-er@ptx/pc/anti-her2处理的小鼠体重并未发生减少，表明药物对小鼠的生长并无影响。
(二)给药处理后小鼠肿瘤体积的变化
1、实验方法
从给药后的第二天开始，每两天使用游标卡尺测量一次小鼠肿瘤长(a)和宽(b)，并利用公式v＝a×b2/2计算肿瘤体积，每只小鼠每次测三次。
2、实验结果
结果如图11所示，每隔2天测一次肿瘤大小，其中肿瘤体积v＝(长径*短径2)/2，游标卡尺测量肿瘤长径和短径，经过计算后得到图11所示数据，图11图表明，对照组小鼠的肿瘤体积呈直线增加，ptx/pc组与p53组的结果相近，表明二者对肿瘤的生长的抑制效果相近，而p53/anti-er@ptx/pc/anti-her2处理后小鼠肿瘤的体积受到明显的抑制，说明ptx/pc与p53联合使用对乳腺癌的治疗更为有效。
第27天时，将小鼠解剖后称量肿瘤的重量，给药治疗结束后，p53/anti-er@ptx/pc/anti-her2处理组的肿瘤体积最小，直经约为0.5cm，而对照组的肿瘤直径约为1.2cm。p53/anti-er@ptx/pc/anti-her2处理组的平均肿瘤质量最小，不到0.1g，而对照组小鼠的平均肿瘤质量接近0.7g，两者之间存在显著性差异。结合各组数据可知，p53蛋白对肿瘤增长具有抑制作用，这种抑制效果相继随着anti-er及ptx/pc胶束的包裹而不断增强，p53/anti-er@ptx/pc/anti-her2对肿瘤具有明显抑制效果。
(三)蛋白复合物抑制乳腺癌生长结果分析
1、实验方法
分别向实验组小鼠肿瘤原位注射等体积、等蛋白含量的p53蛋白、游离p53、p53/anti-er@ptx/pc/anti-her2，对照组注射等体积的生理盐水，每两天注射一次药物，每次给药量为12μg/kg(p53蛋白含量)，持续28天；每两天测量小鼠肿瘤体积与体重，治疗结束后处死小鼠，解剖肿瘤并测称重，使用graphpadprism8.0软件分析作图。
2、实验结果
原位给药治疗的28天中，小鼠体重变化各组小鼠体重接近，且皆呈增加趋势。在治疗过程中无明显的变化，但在不排除肿瘤重量的情况下，经分析可知control组小鼠相比正常组及药物治疗组体重有较明显的体重下降的情况。因此可表明随着乳腺癌肿瘤组织的增加，影响了小鼠的身体健康情况，带来一定的副作用。经药物治疗后具有改善小鼠健康状况的效果。
治疗28天过程中，p53/anti-er@ptx/pc/anti-her2处理组中小鼠肿瘤体积逐渐减小，而其余组中肿瘤体积都呈上升趋势，其中以对照组上升趋势最为明显，其次是ptx/pc组。p53蛋白与ptx/pc蛋白处理组的肿瘤增长也各自受到了一定的抑制，经anti-er和anti-her2抗体修饰后，增强纳米药物杀伤癌细胞的作用，主要是由于经ptx/pc胶束包裹受到有效保护的p53的作用与抗体修饰后的细胞膜与细胞核的靶向作用。
如图12所示，相比control组，p53/anti-er@ptx/pc/anti-her2处理组延长乳腺癌小鼠模型的存活率。
(四)小鼠肿瘤细胞死亡相关蛋白表达情况
1、实验方法
取各组小鼠，解剖取肿瘤、心、肝、脾、肺、肾。石蜡包埋，切片厚度3～4μm；烤片：将待做切片置于切片架上，于65℃恒温烤箱中烘烤20min；脱蜡：将切片放入盛有二甲苯的容器中浸泡2次，每次5min；水化：将切片一次放入100％、90％、85％、75％梯度酒精中，各2min；内源性阻断：将玻片置于盛有pbs的洗盒中，洗涤3次，每次5min；用滤纸擦干玻片上的液体，组化笔圈出样品；在样本上滴加h2o2进行内源性阻断，10-15min；将玻片置于pbs中洗涤3次，每次5min；破膜：在样品处滴加0.1％triton，破膜10min；将玻片置于pbs中洗涤3次，每次5min；抗原修复：配置柠檬酸钠修复液(a液11.5ml，b液88.5ml，混匀)；将玻片浸没于盛有修复液的洗盒中，放入盛有适量水的高压锅中，高压修复7-10min；封闭：待修复液冷却至室温，滴加山羊血清工作液，37℃湿盒封闭1h；一抗孵育：分别滴加配制好的bax、caspase3、bcl-2、ki-67单克隆抗体(1:400-800)在样本上，室温湿盒孵育2h或4℃过夜；使用pbs洗涤3次，每次5min；二抗孵育：滴加生物素标记山的二抗，室温湿盒中孵育1-2h；pbs洗涤3次，每次5min；滴加辣根过氧化物酶链霉亲和素hrp-sa(1:200-500)，湿盒中室温反应1h；pbs洗涤3次，每次5min；滴加dba显色液，反应2-10min；pbs洗涤3次，每次5min；滴加苏木精染色5-10s，使用pbs迅速洗去染料，放入盐酸乙醇中进行1-2s的分化，将样品浸泡于pbs中，返蓝1-2h；待样本颜色变成蓝色后，将玻片放入75％、80％、95％、100％梯度酒精进行脱水，各1min；将样品先后置于两瓶盛有二甲苯溶液的容器中透明处理，各2min；封片：待组织标本充分干燥后，将中性树脂滴加在样品上，盖上盖玻片；观察成像：待片子固定后，使用荧光倒置显微镜观察成像。
2、实验结果
图13为免疫组化检测纳米药物给药后小鼠肿瘤组织中ki67、bax、bcl2、caspase-3的表达情况。从结果中可以看出，激光与天然蛋白纳米胶束处理后的肿瘤组织中bax与caspase-3表达上调，ki67、bcl2表达水平有明显下调，表明纳米药物对肿瘤细胞的生长具有较好的抑制作用，促进细胞凋亡的同时，抑制了乳腺癌细胞的浸润能力。
(五)血常规检测治疗后小鼠指标检测
1、实验方法
纳米药物原位给药28天后，从尾静脉抽取各组小鼠静脉血，制备抗凝血(加入edta二钠)；取20μl抗凝血稀释液，使用血球计数仪检测血样中白细胞总数，以及各类白细胞(中性粒细胞(gr％)、淋巴细胞(ly％)、单核细胞(mo％))含量等系列血常规检测。
2、实验结果
如图14所示，为了量化纳米粒子的毒性，治疗28天后，进一步对normal，control以及天然复合胶束组进行了血常规检测。正常小鼠、给予生理盐水和p53/anti-er@ptx/pc/anti-her2的小鼠之间未发现明显变化。对纳米粒子治疗组的白细胞，血小板，红细胞数量的评估显示，引起炎症反应的白细胞、血小板等数目也在正常范围之内,表明p53/anti-er@ptx/pc/anti-her2的安全性和天然蛋白仿生纳米胶束靶向肿瘤细胞的效果较好。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
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