一种基于船状DNA折纸的纳米载药系统的制作方法

本发明属于药物载送领域，更具体地，涉及一种基于船状dna折纸的纳米载药系统，相应得到的基于船状dna折纸结构的药物载送方案，能够利用dna折纸结构装载药物，并将其靶向输送至肿瘤细胞处，从而起到精准杀死或抑制肿瘤细胞的作用。
背景技术：
：2006年美国科学家paulw.k.rothemund在nature杂志上以独立作者身份发表论文《foldingdnatocreatenanoscaleshapesandpatterns》，被视为dna折纸术的开篇之作。rothemund使用一条改良自m13噬菌体核酸，环状的单链dna分子做为骨架链，通过挑选环状dna的特定位点，设计200余短链dna(称为订书针链)，依靠碱基互补杂交，将环状的单链dna分子特定位点链接在一起，从而将环状dna分子折叠成任意形状的纳米结构。同时，rothemund将指定位点的订书针链延长至纳米结构之外，再通过互补杂交，将具有二级结构的dna分子排布在折纸结构表面，证明了dna折纸结构的空间编址能力。如图1所示。只要能够在生物分子上连接dna分子，便可以利用dna杂交，将其装配到折纸表面，与之互补配对的订书针链伸出位点上。利用dna折纸这一特性，研究人员将能够抑制肿瘤细胞生长的生物分子和靶向识别肿瘤细胞的核酸适配体排布在dna折纸表面，由此形成了基于dna折纸结构的药物装载、靶向运输的技术。在naturebiotechnology期刊发表的论文《adnananorobotfunctionsasacancertherapeuticinresponsetoamoleculartriggerinvivo》中，报道了一种使用可变构dna折纸结构的载药策略。该文献将凝血酶蛋白和dna分子连接，通过互补配对将凝血酶装载在rothemund发明的长方形折纸上面。通过设计，利用dna杂交将长方形折纸卷成筒状结构，并将凝血酶包裹其中，确保凝血酶在被释放之前不会影响正常血管，即不会攻击机体正常的部位。值得注意的是，触发折纸结构卷曲的dna分子由部分互补的dna双链组成(y型结构dna)，双链的其中一条由核酸适配体as1411构成，该适配体能够特异性识别核仁素，并与之结合形成g四聚体，同时双链解旋，长方形dna折纸得以展开。而活跃增殖的肿瘤血管内皮细胞表面，会选择性表达核仁素蛋白，于是该文献中报道的载药装置能够特异性识别肿瘤位置，并在肿瘤相关的血管暴露凝血酶，后者能够在血液中辅助血小板和纤维蛋白，快速形成血栓阻塞肿瘤血管，以剥夺肿瘤的营养和氧气，并引发大量肿瘤细胞死亡。为了增强载药系统的靶向性，研究人员还在折纸两端排布了单独的核酸适配体as1411。如图2所示。上述治疗肿瘤的方法利用了dna材料天然的生物相容性和低毒性，将凝血酶分子靶向运输至肿瘤相关血管，有效的抑制了肿瘤细胞的生长。凝血酶选择型闭塞血管的方法也被认为是具有吸引力的肿瘤治疗方式。首先，血管闭塞可在肿瘤血管中快速诱导血栓形成，之后数小时内发挥其作用，并降低耐药性发展的风险。再者，因为所有实体瘤供血血管都基本相同，血管闭塞被认为是一种可用于多种类型癌症的策略。该方法也是第一个将dna折纸载药系统运用到哺乳动物体内的实例，在小鼠和巴马小型猪静脉注射实验中，都取得了治疗效果。该技术仍然有一些缺点：第一，折纸变构机制较为复杂，在卷曲折纸包裹药物时，具有一定随机性，如图3所示，有一定概率会将凝血酶暴露在外表面，如图3所示，且这种副产物难以剔除，导致有效产率降低，且暴露的凝血酶会攻击正常部位的血管；第二，单层折纸被认为是缺乏刚性的，装载和保护药物的能力有限；第三，凝血酶在到达肿瘤位置时未被释放，仍然排布在dna折纸表面，折纸结构形成的空间位阻，可能会影响疗效。技术实现要素：针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种基于船状dna折纸的纳米载药系统，其中通过对dna折纸纳米载药系统关键的形状设计和细节结构组成进行改进，使用一条m13环形单链经订书针链结合构成船状dna折纸主体，并将凝血酶固定在船状凹槽部位，同时在船状dna折纸主体的两端设置用于靶向识别核仁素的靶向适配体，能够解决①纳米结构变构复杂、装载药物时存在错误率，②药物载体刚性不足、对药物的保护效果欠佳，③药物未完全释放等缺陷、可能影响疗效等技术问题。为实现上述目的，按照本发明，提供了一种基于船状dna折纸的纳米载药系统，其特征在于，包括船状dna折纸主体(101)，位于该船状dna折纸主体(101)凹槽部位且伸出的捕捉链(102)，位于该船状dna折纸主体(101)凹槽部位的凝血酶(103)，位于该船状dna折纸主体(101)两端且伸出的靶向链(105)，以及固定在所述靶向链(105)上用于靶向识别核仁素的靶向适配体(106)；其中，所述凝血酶(103)表面修饰有连接链(104)，所述连接链(104)用于与所述捕捉链(102)相结合，所述捕捉链(102)同样能够用于靶向识别核仁素；所述船状dna折纸主体(101)是由一条m13环形单链经订书针链结合而构成的。作为本发明的进一步优选，所述船状dna折纸主体(101)由34股双螺旋构成，两端形成由这34股双螺旋按蜂巢型堆叠方式形成的截面，凹槽部位则是由其中堆叠的6股双螺旋部分空缺形成的；所述船状dna折纸主体(101)的长度为76nm，所述凹槽部位的长度为30nm。作为本发明的进一步优选，所述用于靶向识别核仁素的靶向适配体(106)为核酸适配体as1411。作为本发明的进一步优选，任意一个船状dna折纸的纳米载药系统中共有8个靶向链(105)，其中在所述船状dna折纸主体(101)两端分别设置有4个靶向链(105)，这8个靶向链(105)均用于与所述靶向适配体(106)相结合。作为本发明的进一步优选，任意一个凝血酶(103)表面修饰有2条所述连接链(104)。作为本发明的进一步优选，所述连接链(104)的核苷酸序列如seqidno.200所示。作为本发明的进一步优选，任意一个船状dna折纸的纳米载药系统中，所述凝血酶(103)的数量不超过3个。作为本发明的进一步优选，任意一个船状dna折纸的纳米载药系统中，所述凝血酶(103)的数量为3个。作为本发明的进一步优选，任意一个船状dna折纸的纳米载药系统中共有6个捕捉链(102)，每2个捕捉链(102)用于配合与一个所述凝血酶(103)相结合。通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，由于使用船状dna折纸主体，利用这一特殊的船状形状设计，同时配合将凝血酶固定在船状凹槽部位，在船状dna折纸主体的两端设置用于靶向识别核仁素的靶向适配体，通过这一原创的船状dna折纸结构，具有三维立体结构，能够有效提升dna折纸载体的刚性，保证在药物靶向释放前得到更好的保护；合理设计装配位点和装配方式，利用船状折纸的凹槽部分保护药物，无需dna纳米结构折叠、卷曲等变构操作，保证转载正确率；设计适配体识别释放机制，既能识别核仁素，又能够释放凝血酶，保证凝血酶在指定位置充分发挥效果，具有非常大的潜在应用价值。本发明通过设计制备原创船型纳米结构，巧妙利用核酸适配体(如as1411)和肿瘤选择性表达的核仁素结合的特点，设计得到的药物载送控释系统既能靶向识别肿瘤细胞，又能在肿瘤相关血管附近释放凝血酶。本发明优选使用特定核苷酸序列的捕捉链和靶向链，它们一方面参与构成dna折纸结构，另一部分序列伸出到折纸结构表面，通过互补配对杂交，固定带有dna序列的凝血酶thrombin和核酸适配体。并且，针对用于固定核酸适配体的靶向链，核酸适配体序列并不参与与伸出靶向链的杂交，而是通过延长部分与靶向链杂交固定。本发明还通过对船状dna折纸进行尺寸结构上的优选设计，能够有效确保载药效果。船状折纸作为药物载体，凹槽部分的空间大小是非常重要的参数。凹槽设计的越大，单个折纸能够载送的药物数量越多，但过大凹槽会对折纸的稳定性产生不利的影响。因此，综合考虑船状折纸承载能力和折纸结构的稳定性要求，本发明优选将船状折纸尺寸参数设置如下：船状dna折纸主体由34股双螺旋构成，两端形成由这34股双螺旋按蜂巢型堆叠方式形成的截面，凹槽部位则是由其中堆叠的6股双螺旋(即一组蜂巢结构)部分空缺形成的，其中，船状dna折纸主体的长度为76nm，凹槽部位的长度为30nm(在dna折纸结构中，考虑分子间斥力等因素，每个双螺旋按照直径2.25nm。每个螺距平均包含10.5个碱基对，即螺距3.57nm。34股双螺旋按蜂巢型堆叠形成的船状dna折纸长76nm，截面18nm×12nm；凹槽部分长30nm，截面近似边长4.5nm的正六边形)。附图说明图1是现有技术示意图。图2是现有技术示意图。图3是现有技术分析示意图。图4是本发明的原创船状dna折纸，装载凝血酶和核酸适配体as1411后的整体结构示意图。图5是载药系统靶向识别肿瘤细胞选择性表达的核仁素，并释放凝血酶的示意图。图6是本发明中船状dna折纸设计图中的双螺旋排布侧面示意图。图中，34、35是预留的位置，用于表示捕捉链的伸出部分及其位置。图7是本发明中船状dna折纸设计图中的序列排布示意图。图中，最上方的编号为dna双螺旋的编号，并与图6编号对应。其中4、5、6、7、16、17号双螺旋是凹槽部分所在位置。下方主图部分，纵向线段表示dna，横向线段表示dna之间的连接关系。34、35号预留位置对应捕捉链。图8是制备本发明中船状dna折纸的tem表征结果。图4中各附图标记的含义如下：101为船状dna折纸主体，102为捕捉链，103为凝血酶，104为连接链，105为靶向链，106为靶向适配体。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。总体来说，本发明中基于船状dna折纸的纳米载药系统，可以按以下步骤设计并制备：首先，设计制备船状dna折纸结构。合理排布骨架链，使之能够形成船型三维构象；可以设计特定位点订书针链，固定骨架链；在船状折纸凹槽部位设计伸出核酸适配体(如as1411)的位点，用于杂交带有与之部分互补的dna分子的凝血酶，并能够在核仁素的触发下释放凝血酶；在船状折纸的两端设计订书针链的伸出，通过dna链杂交的方法连接核酸适配体(如as1411)，用于提高靶向性。可以将设计好的骨架链序列和订书针序列，按照1:10的比例在1×tae/mg2+溶液中混合，通过pcr变温反应得到dna折纸结构。pcr变温反应的具体要求，可以如表1所示。表1：pcr变温反应温度控制程序temperature[℃]duration[min]85565-61560-516050-382037-251025forever其次，凝血酶装载方式设计。借鉴
背景技术：
中的方法连接凝血酶和dna分子，即使用sulfo-smcc交联剂连接凝血酶分子和dna；凝血酶蛋白上连接的dna分子与凹槽内伸出的核酸适配体序列部分互补，形成y形dna双链，如附图4所示；考虑凝血酶蛋白分子量(～37kda)和空间位阻，在每个船状折纸凹槽部分优选设计3个凝血酶蛋白；为了将凝血酶固定的更靠近凹槽内部从而对其形成更好的保护，同时充分裸露y形dna双链，便于核仁素与核酸适配体as1411结合释放凝血酶，本发明采取了附图4所示的链杂交方式。通过对凝血酶蛋白分子量和dna折纸形貌特点的综合考虑，将圆柱形折纸的外侧6股双螺旋镂空(如附图4所示)；设计凝血酶捕捉位点时，考虑空间位阻因素，凝血酶之间预留约5nm的空隙；利用链杂交捕捉凝血酶时，可将凝血酶连接dna的根部，与捕捉链从dna折纸伸出的根部对齐，用以将凝血酶更好的隐藏在凹糟之中。最后，为了提升载药装置的靶向性，在船状dna折纸两端设计伸出订书针链(也即靶向链105)，用于固定核酸适配体as1411。值得注意的是，适配体序列并不参与与伸出订书针链的杂交，而是通过延长部分与订书针链杂交固定，如附图4所示。另外，针对每个船状折纸结构，可以在凹槽部位优选固定3个凝血酶分子，在折纸两端各固定4个as1411，共固定8个核酸适配体as1411。之所以在船状dna折纸主体两端共优选设置8个靶向链，主要是考虑到，一方面折纸结构能够较好的负载这8个靶向链，另一方面设置8个靶向链也能较好的实现靶向作用。以下为具体实施例：实施例1图4和图5分别展示了本发明专利载药系统装载凝血酶和释放凝血酶两个阶段的示意图。如图4所示，载药系统由以下部件组成：船状dna折纸主体101、折纸凹槽部位伸出的骨架链——捕捉链102、被装载的药物凝血酶103、修饰在凝血酶103上用于结合捕捉链102的连接链104、在折纸主体两端伸出的骨架链——靶向链105、固定在靶向链105上用于靶向识别核仁素的靶向适配体106。原创船型dna折纸结构在cadnano软件上完成，设计界面如图6、图7所示。首先根据折纸结构的几何构象设计侧面dna分子双螺旋排布。接着在展开图设计界面排布骨架链。根据展开图和侧面图的对应关系，预留凹槽部分。由于制备dna折纸时，采用的骨架链实体为m13环形单链，因此整个骨架链需要设计成一个完整的闭环。骨架链的排布和侧面双螺旋排布确定了整个dna折纸的形状。之后利用软件自动填充订书针链，并对获得的订书针链进行修改，包括结构边缘部分延长伸出(用于减弱分子间堆叠键，避免折纸间不期望的连接)和过长或过短订书针链的修改。以上设计保证了船状dna折纸的基本形状，完成之后即可挑选位点，设计添加具有特殊作用的骨架链。综合考虑凝血酶的尺寸和船型折纸凹槽部位的空间，优选地确定每个dna折纸设计3处固定凝血酶的位点，每处位点设计2个伸出骨架链用于提高捕捉凝血酶的几率，此处伸出的骨架链，即图4中的捕捉链。在捕捉链伸出的具体位点选择上，需要考虑dna双螺旋的空间构想，保证捕捉链伸出到凹槽之外。在折纸两端的合适位置伸出骨架链，即可构成图4中的靶向链。在完成折纸设计之后，即可输出dna序列。在骨架链上选定一处标记头尾，5’端开始填充m13序列，cadnano软件可自动获得骨架链的序列。需要注意的是，折纸结构边缘伸出的普通骨架链填充为胸腺嘧啶t；具有特殊作用的伸出骨架链，伸出部分需要单独设计。其中，捕捉链可以参考
背景技术：
文献中的设计方案；靶向链可以通过nupack软件设计，具体如表2.1至表2.3所示。表2.1船状dna折纸普通订书针链表22船状dna折纸伸出订书针链表2.3其他序列m13从德国tilibitnanosystems购买，其余所有的dna序列由生工生物工程股份有限公司合成。合成dna链需要进行溶解处理。首先对分装dna的试管离心，设定转速8000rpm，时间3min。之后在试管中按照订单推荐体积添加去离子水。涡旋震荡3min后使用低速离心机将溶液汇集至管底。使用超微量分光光度计nanodrop2000测试每条dna链的浓度。在dna链浓度测试完毕后，需要将订书针链混合。按照上一步测试的dna链浓度，按照等物质的量混合普通订书针链；按照1.5倍物质的量的比例混合特殊用途订书针链(包括捕捉链和靶向链)。由此构成订书针链混合液。取浓度500nm的m13链2μl，订书针链混合液10μl，靶向适配体链15pmol，混合在1×tae溶液(含2价镁离子，ph＝8.0)中，并构成100μl溶液体系置于小号ep管(容积200ul)中。使用pcr仪器，从95℃开始退火至室温，所采用的具体流程可以如表1所示。经过pcr退火后，需要对dna折纸进行提纯操作。本实验采用超速离心管分离目标产物和过量的订书针链。使用1×tae缓冲液将含有100k滤膜的超速离心管(mwco,amicon,millipore)润湿，接着将待提纯的折纸样品添加至离心管中，用1×tae将离心管填充至满容积(500ul)，使用离心机以12000rpm的速度离心，使样品通过滤膜，将多余的dna链过滤掉，剩下纯净的dna折纸结构。离心过程可以重复5遍。提纯后的dna折纸结构可做tem图像表征。首先取普通碳支持膜(中镜科仪)做为样品支撑网，对其进行等离子清洗：将碳膜放置在玻璃板表面，将玻璃板插入等离子清洗仪的真空腔，关闭盖子气孔，盖在真空腔取样口。打开抽真空开关，对真空腔抽真空1.5min。再将等离子清洗仪打开，调节至低档位即可。等离子清洗30秒之后，将进气孔缓缓打开，使空气缓慢进入真空腔，避免剧烈的空气流动将碳膜吹跑。在取出玻璃板后，将清洗好的铜网移至分析滤纸待用。接着，一手持尖嘴钳，将碳膜轻轻按在滤纸上，一手持移液枪，将2μl待测折纸样品滴到铜网表面，用枪头轻微波动溶液滴，辅助其被滤纸吸收，同时通过碳膜，将目标结构留在碳膜里。最后，如需对dna染色，则取2μl醋酸双氧铀(中镜科仪)，同样品滴样方法相同，滴入碳膜。滴好样品的铜网静置30分钟后即可用于电子显微镜的观测。凝血酶与dna连接的方式参考
背景技术：
，具体做法为：使用sulfo-smcc交联剂连接凝血酶103和连接链104；通过测量260nm和280nm处的吸光度来估算纯化的dna-凝血酶的浓度和dna标记率。据文献估计，dna与凝血酶的标记之比为2.5±0.8。dna标记的凝血酶与dna折纸结构的连接大约需要60—100min。图8为本实施例中船状dna折纸的tem表征结果，从图8可知，船状dna折纸形貌特征与设计基本一致，凹槽部分清晰可见，尺寸大小与设计一致。本发明所采用的试剂均为市售试剂。本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3 

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