一种具有靶向荧光/磁共振双模态成像和光热治疗功能的复合纳米探针及其制备和应用的制作方法

本发明涉及纳米材料和生物医学技术领域，具体涉及一种具有靶向荧光/磁共振双模态成像和光热治疗功能的复合纳米探针及其制备和应用。

背景技术：

分子影像学是一门采用影像学技术手段无创性地对活体内参与生理或病理过程的分子进行可视化检测，活体状态下对分子、基因和细胞的变化进行定性和定量研究的科学。在各种影像技术中，磁共振成像(mri)是一种非侵入性的成像技术，其软组织分辨率和空间分辨率高，能够提供多序列、多参数及多方位成像，但其灵敏度比较低，荧光成像技术具有相当高的灵敏度，但其穿透力有限，因此把磁共振成像与荧光成像技术相结合，构建具有磁共振-荧光双模态成像功能的纳米分子影像探针，已经成为医学和材料领域的研究热点。

与手术和放化疗等传统肿瘤治疗方法相比，光热治疗是一种新兴的肿瘤治疗手段，具有适用范围广、非侵入、正常组织损伤小等优点，在药物释控、肿瘤治疗等领域展现出广阔的应用前景。光热治疗利用对近红外光有较强吸收的纳米材料，将照射到肿瘤区域的光能转化为热能，从而杀死肿瘤细胞。用于肿瘤光热治疗的纳米材料主要有金纳米材料、石墨烯、介孔碳纳米球、半导体纳米颗粒等，其中金纳米材料因其优良的生物相容性、独特的光学性能、易表面功能化和化学稳定性，是目前最受关注的光热治疗纳米材料之一。目前，棒状或者具有核壳结构的金纳米材料是被研究的比较多的一类光热治疗介导材料，与金纳米棒和金纳米壳层相比，金纳米双锥(aunbp)的近红外区吸收带半峰宽较窄，光热转换效率较高，且具有较好的稳定性，是比较理想的光热治疗介导材料。

为了更加广泛、准确地诊断和治疗癌症，发展双模态成像诊断引导的光热治疗纳米体系是非常有必要的，也成为了研究癌症诊断与治疗的新方向。但是，现有工艺方法制备的光热治疗纳米体系，其组分稳定性、一致性不好，生物相容性差，不能特异性识别肿瘤细胞，且制备方法复杂，无法满足研究和应用的需求。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种具有靶向荧光/磁共振双模态成像和光热治疗功能的复合纳米探针的制备方法。

本发明的目的之二是提供一种由上述的方法制备得到的具有靶向荧光/磁共振双模态成像和光热治疗功能的复合纳米探针，具有良好的稳定性、生物相容性，能够实现荧光成像、磁共振成像、光热治疗一体化。

本发明的目的之三是提供上述具有靶向荧光/磁共振双模态成像和光热治疗功能的复合纳米探针的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种具有靶向荧光/磁共振双模态成像和光热治疗功能的复合纳米探针的制备方法，包括以下步骤：

s1、aunbp的制备

首先制备金纳米晶种，将其加入到生长液中进行aunbp的生长，然后再对aunbp进行纯化，得到aunbp纳米颗粒；

s2、aunbp-gd2o3/au-dbsa纳米复合物的制备

首先向浓度为50mg/ml牛血清白蛋白(bsa)溶液中加入硼氢化钠(nabh4)，室温下搅拌1h，得到dbsa；将反应液置于60～70℃水浴中，继续搅拌20～60min，以去除过量的nabh4；将aunbp纳米颗粒分散在上述dbsa溶液中，超声分散混匀，在剧烈搅拌下依次加入四氯金酸溶液、硝酸钆溶液和氢氧化钠溶液，37℃下剧烈搅拌12h，得到aunbp-gd2o3/au-dbsa纳米复合物分散液，对分散液离心并除去上清液，洗涤沉淀，得到aunbp-gd2o3/au-dbsa纳米复合物；

s3、aunbp-gd2o3/au-dbsa表面修饰as1411适配体

将aunbp-gd2o3/au-dbsa纳米复合物分散于去离子水中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和as1411适配体，在摇篮床上摇15min，混匀后，放入37℃恒温水浴箱中反应2h；反应结束后，取出溶液离心，洗涤，得到aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411复合纳米探针。

优选的，步骤s1中，aunbp的制备的具体过程是：

s101、au纳米晶种的制备：将0.01m四氯金酸溶液和0.01m柠檬酸三钠溶液搅拌混匀，剧烈搅拌下快速加入新配制4℃预冷的0.01m硼氢化钠溶液，2min后停止搅拌，25℃水浴静置2h，得到au纳米晶种分散液；所述四氯金酸溶液、柠檬酸三钠溶液、硼氢化钠溶液的体积比为5：10：6；

s102、aunbp生长液的制备：取200ml0.1m十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶液于烧杯中，边搅拌边依次加入10ml0.01m四氯金酸溶液、2ml0.01m硝酸银溶液、4ml1m盐酸和1.6ml0.1m抗坏血酸溶液，搅拌混匀，然后在缓慢搅拌下加入1.5～1.8ml步骤1.1中的au纳米晶种分散液，继续搅拌10s后，25℃下静置12h；

s103、aunbp的纯化：对aunbp生长液进行离心，除去上清液，将离心沉淀分散在160ml0.08m十六烷基三甲基氯化铵(ctac)溶液中，超声使分散均匀，边搅拌边加入32ml0.01m硝酸银溶液和16ml0.1m抗坏血酸溶液，65℃恒温静置4h使aunbp表面生长ag纳米棒，然后自然冷却至室温；离心除去上清液，离心沉淀分散于160ml0.05mctab溶液中，室温静置12h，样品中有沉淀物析出，此沉淀物即为生长有ag纳米棒的aunbp；除去上部溶液，将沉淀物分散于100ml水中，缓慢搅拌下加入2.5ml氨水和2mlh2o2，室温下静置以对aunbp表面的ag纳米棒进行刻蚀；待ag纳米棒被完全刻蚀后即得到aunbp分散液；对分散液进行离心，除去上清液，收集沉淀，得到aunbp纳米颗粒。

优选的，步骤s2中，牛血清白蛋白与硼氢化钠的质量比为25～50：1；四氯金酸、硝酸钆、氢氧化钠的摩尔比为0.1：0.05：2。

优选的，步骤s3中，将aunbp-gd2o3/au-dbsa纳米复合物分散于去离子水中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐，混匀，37℃恒温活化15min，再加入n-羟基琥珀酰亚胺和as1411适配体。

优选的，步骤s3中，aunbp-gd2o3/au-dbsa纳米复合物、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐、n-羟基琥珀酰亚胺、as1411适配体的质量比为1～5：1：1：0.02～0.04。

同时，本发明还提供了由所述的制备方法得到的具有靶向荧光/磁共振双模态成像和光热治疗功能的复合纳米探针。

所述复合纳米探针中的aunbp纳米颗粒呈双锥体结构，其长度为65～75nm，宽度为22～28nm，gd2o3纳米颗粒的粒径为2～5nm，gd2o3纳米颗粒和au纳米簇通过bsa分子修饰在aunbp的表面。

进一步的，本发明还提供了上述具有靶向荧光/磁共振双模态成像和光热治疗功能的复合纳米探针在制备肿瘤诊断、成像以及光热治疗试剂中的应用。

优选的，所述肿瘤为乳腺癌。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明以aunbp纳米颗粒为前躯体，用巯基化的bsa修饰aunbp纳米颗粒的表面，并以之作为稳定剂在aunbp纳米颗粒表面修饰gd2o3纳米颗粒和au纳米簇，进一步将适配体as1411联结在aunbp-gd2o3/au-dbsa的表面，制备靶向性、诊疗一体化的aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411复合纳米探针。

(2)本发明的aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411复合纳米探针具有较好的生物相容性和荧光稳定性，同时具有荧光/磁共振双模态成像功能，可以靶向性地进入肿瘤细胞，对肿瘤细胞进行标记和示踪，有助于肿瘤的早期诊断；

(3)本发明的aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411复合纳米探针具有优良的光热稳定性，对mda-mb-231乳腺癌细胞的光热治疗杀伤效果明显，可以用作光热治疗的介导材料，在光热治疗试剂中具有一定的应用潜力；

(4)本发明制备方法简便，条件温和，且产率高，适于规模化生产。

附图说明

图1为aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411靶向复合纳米探针的制备过程示意图；

图2a为aunbp纳米颗粒的tem照片；

图2b为aunbp-gd2o3/au-dbsa纳米复合物的tem照片；

图3a为aunbp-gd2o3/au-dbsa纳米复合物的haadf-stem图；

图3b为aunbp-gd2o3/au-dbsa纳米复合物中au元素的mapping图；

图3c为aunbp-gd2o3/au-dbsa纳米复合物中gd元素的mapping图；

图4为as1411(a)、bsa(b)、aunbp(c)、aunbp-gd2o3/au-dbsa(d)和aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411(e)样品的uv-vis吸收光谱；

图5为aunbp(a)、bsa(b)、as1411(c)、aunbp-gd2o3/au-dbsa(d)和aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411(e)样品的傅里叶变换红外光谱(ftir)；

图6为aunbp、aunbp-gd2o3/au-dbsa和aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411的zeta电位图；

图7为aunbp(a)、aunbp-gd2o3/au-dbsa(b)和aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411(c)样品的荧光光谱，激发波长为488nm；

图8为aunbp-gd2o3/au-dbsa和aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411的荧光强度随ph值的变化曲线；

图9为不同浓度的aunbp-gd2o3/au-dbsa样品的t1加权图像(t1wi)和t1map图；

图10为aunbp-gd2o3/au-dbsa和gd-dtpa的t1弛豫率拟合曲线；

图11为aunbp-gd2o3/au-dbsa的光热性能。(a)不同浓度的aunbp-gd2o3/au-dbsa在808nm的红外激光(1w/cm²)照射下的升温曲线；(b)不同浓度的aunbp-gd2o3/au-dbsa在808nm的红外激光(1w/cm²)照射下的热像图；(c)浓度为10mg/l的aunbp-gd2o3/au-dbsa分散液在不同功率的红外激光照射下的升温曲线；(d)浓度为10mg/l的aunbp-gd2o3/au-dbsa分散液在红外激光(1w/cm²)照射下的稳定性曲线；

图12为aunbp-gd2o3/au-dbsa不同浓度组的mda-mb-231细胞和hsf细胞存活率图；

图13为hsf和mda-mb-231细胞对aunbp-gd2o3/au-dbsa和aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411摄入的激光共聚焦显微照片，标尺为20μm；

图14为mda-mb-231和hsf细胞分别与pbs缓冲液、aunbp-gd2o3/au-dbsa分散液和aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411分散液共孵育后的t1wi图和t1map图；

图15为mda-mb-231细胞的活/死细胞染色的激光共聚焦显微照片。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

本发明首先采用种子生长法制备得到金纳米双锥aunbp分散液，并对aunbp进行纯化，得到纯净的aunbp纳米颗粒；然后用硼氢化钠将bsa分子中的双硫键还原成与金纳米颗粒表面有较强配位作用的巯基，得到变性的bsa(denaturedbsa，dbsa)，并将其修饰于aunbp的表面；再以aunbp表面的dbsa作为稳定剂制备gd2o3纳米颗粒和金纳米簇，得到具有荧光/磁共振双模态成像和光热治疗功能的纳米复合物aunbp-gd2o3/au-dbsa。偶联靶向识别分子as1411适配体形成靶向纳米探针aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411，制备过程如图1所示。具体实施过程如下：

s1.aunbp的制备

首先制备au纳米晶种，将其加入到生长液中进行aunbp的生长，然后再对aunbp进行纯化，具体制备过程如下：

s101.au纳米晶种的制备。取9.625ml水于烧瓶中，边搅拌边依次加入125μl0.01mhaucl4溶液和250μl0.01m柠檬酸三钠溶液，搅拌混匀，剧烈搅拌下快速加入150μl0.01mnabh4溶液(新配制，4℃预冷)，2min后停止搅拌，25℃水浴静置2h。

s102.aunbp生长液的制备。取200ml0.1mctab溶液于烧杯中，边搅拌边依次加入10ml0.01mhaucl4、2ml0.01magno3、4ml1mhcl和1.6ml0.1m抗坏血酸溶液，搅拌混匀，然后在缓慢搅拌下加入1.6ml步骤(1)中的au纳米晶种分散液，继续搅拌10s后，25℃下静置12h。

s103.aunbp的纯化。对aunbp生长液进行离心(8000rpm×15min)，除去上清液，将离心沉淀分散在160ml0.08mctac溶液中，超声使分散均匀，边搅拌边加入32ml0.01magno3溶液和16ml0.1m抗坏血酸溶液，65℃恒温静置4h使aunbp表面生长ag纳米棒，然后自然冷却至室温。离心(7000rpm×15min)，除去上清液，离心沉淀分散于160ml0.05mctab溶液中，室温静置12h，样品中有沉淀物析出，此沉淀物即为生长有ag纳米棒的aunbp。除去上部溶液，将沉淀物分散于100ml水中，缓慢搅拌下加入2.5ml氨水和2mlh2o2，室温下静置以对aunbp表面的ag纳米棒进行刻蚀。在静置过程中检测溶液的uv-vis吸收光谱并观测其颜色的变化，待ag纳米棒被完全刻蚀后即得到aunbp分散液。对分散液进行离心(7000rpm×15min)，除去上清液，离心沉淀分散在50ml去离子水中，4℃保存备用。

s2.aunbp-gd2o3/au-dbsa纳米复合物的制备

取250mgbsa加入到5ml水中，搅拌混匀。然后向内加入6.3mgnabh4，室温下搅拌1h，bsa分子中的双硫键被还原成与au纳米颗粒表面有较强配位作用的巯基，得到dbsa。将反应液置于70℃水浴中，继续搅拌30min，以去除过量的nabh4。取8ml4℃保存的aunbp分散液，离心(7000rpm×15min)，除去上清液，将离心沉淀分散在上述dbsa溶液中，超声分散混匀，在剧烈搅拌下依次加入4ml0.025mhaucl4、1ml0.05mgd(no3)3和1ml2mnaoh溶液，37℃下剧烈搅拌12h，即可得到aunbp-gd2o3/au-dbsa纳米复合物分散液，对分散液离心(12000rpm×15min)并除去上清液，离心沉淀用去离子水洗涤3遍，然后分散于8ml去离子水中，4℃保存备用。

s3.aunbp-gd2o3/au-dbsa表面修饰as1411适配体

取6mlaunbp-gd2o3/au-dbsa纳米复合物溶液，加入2mgedc，混匀，放入37℃恒温水浴箱中活化15min。再加入2mgnhs和10μlas1411适配体，在摇篮床上摇15min，混匀后，放入37℃恒温水浴箱中反应2h。反应结束后，取出溶液离心(7000rpm×15min)，去离子水洗涤2次，分散在去离子水中备用。

对制备的材料进行表征与性能测试，结果如下：

(1)材料的表征

图2(a)为aunbp的tem照片，可见，aunbp颗粒呈双锥体结构，分散性好、尺寸均一，其长度约为66.6±1.9nm，宽度约为24.9±2.4nm。图2(b)为aunbp-gd2o3/au-dbsa的tem照片，可见，aunbp颗粒表面包绕一层膜状物，膜内含有颗粒状的gd2o3和au纳米簇，gd2o3纳米颗粒的粒径为2～5nm。

图3(a)为aunbp-gd2o3/au-dbsa的haadf-stem图，表明gd2o3/au纳米颗粒修饰在aunbp的表面；图3(b)和图3(c)分别为aunbp-gd2o3/au-dbsa中au和gd元素的mapping图，同样表明gd2o3/au纳米颗粒已修饰在aunbp的表面。

图4为as1411、bsa、aunbp、aunbp-gd2o3/au-dbsa和aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411样品的uv-vis吸收光谱。可见，aunbp样品在805nm处有较强的吸收峰；当aunbp纳米颗粒表面修饰有gd2o3/au-dbsa后，其805nm处的吸收峰红移了27nm，但在808nm处仍具有较强的吸收，表明所制备的aunbp-gd2o3/au-dbsa样品对波长为808nm附近的近红外光具有较好的光热转换效率；另外，aunbp-gd2o3/au-dbsa样品在275nm处有一小峰，为bsa的吸收峰，表明bsa已包裹在aunbp颗粒表面上，使其具有较好的生物相容性。与aunbp-gd2o3/au-dbsa相比，aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411的吸收光谱在254nm处有一吸收峰，为as411的吸收峰，表明as1411已修饰在aunbp-gd2o3/au-dbsa纳米颗粒表面，从而使其具有靶向功能。

图5为aunbp、bsa、as1411、aunbp-gd2o3/au-dbsa和aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411样品的傅里叶变换红外光谱(ftir)。从曲线a可以看出，2920cm^-1和2850cm^-1处的峰来自aunbp表面的ctab分子中的c-h键的伸缩振动；从曲线b和曲线d可以看出，aunbp-gd2o3/au-dbsa的ftir光谱和和bsa相似，表明gd2o3/au通过bsa分子连接到aunbp颗粒的表面；从曲线e可以看出，aunbp-gd2o3/au-dbsa的ftir光谱在1050cm^-1处有一吸收峰，为as1411分子(曲线c)中o-p键的伸缩振动吸收峰，表明as1411已经修饰到aunbp-gd2o3/au-dbsa的表面。

图6为aunbp、aunbp-gd2o3/au-dbsa和aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411的zeta电位图。aunbp纳米颗粒的zeta电位为+31.2mv，当aunbp表面修饰上gd2o3/au-dbsa后，所得aunbp-gd2o3/au-dbsa的zeta电位变为-23.5mv，当在aunbp-gd2o3/au-dbsa表面连接上带负电的as1411分子后，其zeta电位变为-38.7mv。

(2)材料的荧光性质

图7为aunbp、aunbp-gd2o3/au-dbsa和aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411样品的荧光光谱，其激发波长均为488nm。可见，aunbp没有荧光发射峰；aunbp-gd2o3/au-dbsa和aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411由于表面au纳米簇的存在，分别在645nm和650nm处有一荧光发射峰，因此均可以发出红色的荧光。通常情况下，当au纳米簇与aunbp同时存在时，由于au纳米簇与aunbp之间的荧光共振能量转移作用会猝灭au纳米簇的荧光。由aunbp的uv-vis吸收光谱(图4)可知，aunbp在650nm左右的吸收很弱，因此aunbp对au纳米簇的荧光猝灭作用较弱；而且，在aunbp-gd2o3/au-dbsa的制备过程中首先将dbsa修饰在aunbp颗粒的表面，然后以aunbp表面的dbsa为配位剂合成gd2o3纳米颗粒和au纳米簇，使得au纳米簇与aunbp颗粒表面保持一定的距离，aunbp的局域表面等离子共振而产生的电场对au纳米簇的荧光具有增强作用，因此所制备的aunbp-gd2o3/au-dbsa和aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411样品同时具有光热转换和荧光成像的功能。

图8给出了aunbp-gd2o3/au-dbsa和aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411的荧光强度随ph值的变化情况。可见ph值在5～9的范围内变化时，二者的荧光强度均变化较小，表明二者均有较好的荧光稳定性。

(3)材料的磁共振性能表征

aunbp-gd2o3/au-dbsa样品中由于gd2o3纳米颗粒的存在使其具有磁共振成像的功能。首先将aunbp-gd2o3/au-dbsa样品配置成gd的浓度分别为0，0.09mm，0.22mm，0.31mm，0.63mm，1.26mm，1.89mm，2.53mm和3.16mm的溶液，用3.0tgediscoverymr系统测试其t1弛豫时间，然后根据不同浓度样品的平均t1弛豫时间，计算出aunbp-gd2o3/au-dbsa的t1弛豫率。

图9为不同浓度的aunbp-gd2o3/au-dbsa样品的t1加权图像(t1wi)和t1map图。可见，随着gd浓度的降低，t1wi信号逐渐减低，t1map伪彩图由橙红色逐渐变为深蓝色。

图10为aunbp-gd2o3/au-dbsa和gd-dtpa的t1弛豫率拟合曲线。aunbp-gd2o3/au-dbsa的t1弛豫率为6.75s^-1mm^-1，约为临床使用的t1对比剂gd-dtpa(t1弛豫率为4.45s^-1mm^-1)的1.5倍。

(4)材料的光热性能

将aunbp-gd2o3/au-dbsa样品配制程浓度分别为0mg/ml，2mg/l，5mg/l，10mg/l和20mg/l的分散液，分别取0.5ml分散液在近红外激光(808nm，1w/cm²)下照射10min，通过热像仪监测其升温曲线和热像图，其升温曲线和热像图分别如图11(a)和图11(b)所示。可见，不同浓度aunbp-gd2o3/au-dbsa的温度随照射时间的延长、浓度的升高而升高，2mg/l，5mg/l，10mg/l和20mg/l的分散液经过10min的照射，温度分别升高了19.9℃，30.3℃，35.8℃和39.9℃(分散液的起始温度为27℃)。图11(c)为浓度为10mg/l的aunbp-gd2o3/au-dbsa分散液在不同功率的808nm近红外激光照射下的升温曲线，可见，在较低的功率下，经过10min的照射，分散液的温度即可到达45℃以上，文献报道在45℃以上保持5min即可杀死肿瘤细胞，因此aunbp-gd2o3/au-dbsa是优良的肿瘤光热治疗材料。另外，从图11(d)可知，aunbp-gd2o3-bsa样品具有优良的光热稳定性，经过4个循环的测试，其光热性能几乎没有变化。

实施例2

为进一步验证aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411靶向纳米探针在肿瘤诊疗方面的应用，进行体外细胞实验。其中，人乳腺癌细胞(mda-mb-231)、人皮肤成纤维细胞(hsf)均购自中国科学院上海细胞库。

1.细胞毒性测试

用cck8法评价aunbp-gd2o3/au-dbsa对人乳腺癌细胞(mda-mb-231)和人皮肤成纤维细胞(hsf)的毒性作用。取对数生长期的mda-mb-231细胞和hsf细胞分别接种于两个96孔培养板中，接种浓度约为0.5×10⁵个/ml，放入37℃、5％co2培养箱中孵育24h。在倒置显微镜下观察细胞快要长满培养孔时，弃去旧的培养液，用灭菌后的pbs溶液冲洗2遍，将96孔板分成6组(6孔/组)，每组中分别加入浓度为0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml和500μg/ml)的aunbp-gd2o3/au-dbsa混合物培养液，各孔的混合物培养液的总体积均为100μl。再放入37℃、5％co2培养箱中孵育24h，弃去旧的培养液，用灭菌后的pbs溶液冲洗2遍，各孔均加入100μlcck-8溶液，继续在培养箱中孵育4h后。用多功能酶标仪在450nm波长处，测量每个孔的吸光度(od)值。

图12为aunbp-gd2o3/au-dbsa不同浓度组的mda-mb-231细胞和hsf细胞存活率图。可见，当aunbp-gd2o3/au-dbsa浓度在0～500μg/ml范围内时，mda-mb-231细胞和hsf细胞与不同浓度aunbp-gd2o3/au-dbsa共同孵育，两种细胞存活率均在85％以上。即使aunbp-gd2o3/au-dbsa达到500μg/ml时，共孵育24h后，mda-mb-231细胞和hsf细胞的存活率仍分别为88.2％和89％，表明aunbp-gd2o3/au-dbsa具有较好的生物相容性。

2.细胞的荧光成像

用mda-mb-231细胞和hsf细胞研究aunbp-gd2o3/au-dbsa和aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411的细胞摄入和荧光成像。细胞接种在lab-tek8腔室培养玻片上，接种浓度为2×10⁴个/孔，孵育过夜，分别50μg/mlaunbp-gd2o3/au-dbsa和aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411纳米材料分散液处理2h后用dapi进行细胞核染色，然后用pbs缓冲液清洗2遍除去未被摄入的纳米材料和死细胞，用激光共聚焦显微镜下观察。

图13为hsf细胞和mda-mb-231细胞分别对aunbp-gd2o3/au-dbsa和aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411摄入的激光共聚焦显微照片。可见，与aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411共孵育后，hsf细胞在蓝色细胞核的周围仅呈现微弱的红色荧光，表明as1411适配体与hsf细胞的亲和力较弱，因此没有增强hsf细胞对材料的摄入；mda-mb-231细胞和aunbp-gd2o3/au-dbsa共孵育后呈现较弱的红色荧光信号，然而当其与aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411纳米复合物共孵育后，红色荧光信号显著增强，表明as1411适配体可以显著增强mda-mb-231细胞对纳米材料的摄入，因此aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411纳米复合物可以作为靶向荧光探针对mda-mb-231细胞进行标记和示踪。

3.细胞的磁共振成像

将mda-mb-231细胞和hsf细胞用胰酶消解后加入培养基，制成细胞悬液加入到细胞孔中(6孔/组，共2组)，每孔加入500μl细胞悬液(约20000个细胞)，在培养箱中培养24h，当细胞生长至占镜下视野的80％-90％左右时，吸出培养基，用pbs冲洗3遍，在2组培养孔中分别加1ml50μg/ml的aunbp-gd2o3/au-dbsa和aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411分散液，在培养箱中培养2h，吸出培养孔中液体，用pbs冲洗3遍，0.25％胰蛋白酶消解离心后，将得到的细胞分散于1％的琼脂糖凝胶中，用3.0t750wdiscoverymri系统测量各组的t1加权图和t1map图。

图14为mda-mb-231和hsf细胞分别与pbs缓冲液、aunbp-gd2o3/au-dbsa分散液和aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411分散液共孵育后的t1wi图和t1map图。t1wi图像显示，hsf细胞aunbp-gd2o3/au-dbsa共孵育后，其t1wi图像的亮度较其与pbs共孵育仅有较弱的增强，另外，as1411适配体并没有使磁共振信号有显著增强，表明as1411适配体对hsf细胞没有靶向功能。mda-mb-231细胞与aunbp-gd2o3/au-dbsa共孵育后，其t1wi信号较其与pbs缓冲液共孵育后仅有较弱的增强，而当mda-mb-231细胞与aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411共同孵育后，其t1wi信号显著增强，说明在本实验条件下乳腺癌靶向分子探针aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411成功实现了对mda-mb-231乳腺癌细胞的靶向磁共振成像。

4.4体外光热治疗性能

mda-mb-231细胞在ф35mm的培养皿中培养24h，然后与aunbp-gd2o3/au-dbsa和aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411纳米复合物分散液(20μg/ml)共孵育4h，然后用pbs缓冲液清洗除去未被摄入的纳米复合物，用808nm的近红外激光(2w/cm²)照射5min后，细胞用钙黄素am(calceinam)和碘化丙啶(pi)染色，用激光共聚焦显微镜进行观察。

图15为mda-mb-231细胞的活/死细胞染色的激光共聚焦显微照片。可见，控制组的mda-mb-231细胞保持较好的生长状态，经808nm的近红外激光照射5min后仍呈像明亮的绿色荧光，表明808nm的近红外光对mda-mb-231细胞的损伤很小；然而与aunbp-gd2o3/au-dbsa共孵育后，在808nm的近红外激光照射下，发红色荧光的细胞大量增加，只有少量细胞呈绿色，表明多数的细胞已被aunbp-gd2o3/au-dbsa的光热作用杀死；当mda-mb-231细胞与aunbp-gd2o3/au-dbsa-as1411共孵育后，808nm的近红外激光照射后mda-mb-231细胞几乎被完全杀死，表明as1411适配体可通过提高细胞对纳米复合材料的摄入量显著提高材料对mda-mb-231乳腺癌细胞的光热治疗杀伤效果。

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