一种透明质酸膜及其制备方法和应用与流程

2021-01-08 12:01:34|

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本发明属于透明质酸膜技术领域，具体涉及一种透明质酸膜及其制备方法和应用。

背景技术：

透明质酸(hyaluronicacid，简称ha)是细胞外基质的重要组成成分，广泛存在于人和动物体内。它是一种透明的多醣体，是由葡萄醛酸-n-乙酸氨基葡萄糖为双糖分子单位组成的直链高分子多醣，具有优异的生物相容性、生物可降解性、生物活性以及流变学特性，并且含有自由羧基和羟基，易于进行化学修饰，因而透明质酸是广泛使用的生物材料之一。

生物材料膜剂型，具有宏观尺寸、稳定的三维网络结构和良好的力学强度，适用于美容、创伤敷料、给药制剂、各种补片、防粘连膜、角膜以及组织工程支架、人造器官等方面应用。

但是，现有的透明质酸膜存在力学性能低的缺点，或采用有毒的交联剂，使透明质酸膜的应用受到了很大的限制。

cn105113054a公开了一种透明质酸衍生物交联纤维的制备方法，通过开环反应对透明质酸进行接枝改性，得到具有光聚合反应活性的透明质酸衍生物，然后加入光引发剂混溶后低温冷冻结晶，并在低温下进行光照交联聚合，再通过冷冻干燥除去溶剂，得到透明质酸衍生物交联纤维材料。通过该发明方法得到良好力学性能和机械强度的透明质酸衍生物交联纤维材料，制备过程中没有添加任何改变透明质酸特性的试剂，不会改变透明质酸作为天然高分子原有的一些优良性能，交联的透明质酸衍生物纤维材料可广泛应用于药物释放体系、伤口愈合材料、污水处理、重金属回收、膜分离、日用化工等各个领域。但是，该发明的制备方法只进行了一次光交联，制得的透明质酸衍生物交联纤维的力学性能有待进一步提高。

因此，开发一种安全无毒害、力学性能优异的透明质酸膜很有必要。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种透明质酸膜及其制备方法和应用，本发明的透明质酸膜，具有较好的力学性能，制得的冻干膜具有适宜的微观孔隙，最大拉伸应力为4.5mpa，杨氏模量为39.4mpa；制得的风干膜最大拉伸应力为145mpa，杨氏模量为3.8gpa，有效扩展了透明质酸膜的应用范围。

本发明的目的之一在于提供一种透明质酸膜的制备方法，为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一种透明质酸膜的制备方法，包括如下步骤：

1)在透明质酸衍生物m和透明质酸衍生物f的混合体系中，发生环加成反应，得到透明质酸前处理结合物；

2)在步骤1)得到的所述透明质酸前处理结合物中加入光引发剂，搅拌均匀并去除气泡后，在模具中流延成膜，经光照发生光交联反应，再经冻干或风干，得到所述透明质酸膜。

本发明的透明质酸膜，采用透明质酸衍生物m与透明质酸衍生物f发生环加成反应，在避免加入其他大分子链的情况下，在透明质酸中引入环结构，加入光引发剂后光照发生光交联反应，再经冻干/风干后，获得的透明质酸膜具有较好的拉伸力学性能，并具有不同的微观孔隙，有效扩展了透明质酸膜的应用范围。

需要说明的是，拉伸性能是利用透明质酸衍生物f上的共轭双烯结构因电子离域作为给电子体一定条件下可与透明质酸衍生物m上的烯基发生狄尔斯-阿尔德反应，形成六元杂环，杂环上新生成的不饱和双键在光引发剂和特定波长光照条件下可发生自由基聚合反应，从而得到双交联透明质酸材料。本发明中，双交联透明质酸材料在连接位点处形成的环结构，在受到外力刺激下，可通过单键的旋转吸收部分能量从而起到内部能量耗散的作用，并由于环的空间位阻作用，增强了膜材料对外力刺激的抗性，使其具有良好的拉伸性能。

步骤1)中，所述透明质酸前处理结合物，包括结构式如式1所示的改性透明质酸；

式1：

其中，式1中，r1为透明质酸高分子去除c6上羟基的残基部分；

r2、r3、r4和r6均独立地选自氢、取代或未取代烷基、取代或未取代羟基、取代或未取代羧基、取代或未取代氨基和取代或未取代磺酸基中的任意一种；

r5、r7和r9均独立地选自氧、硫、取代或未取代亚烷基中的任意一种；

r8为透明质酸高分子去除羧基的残基部分。

步骤1)中，所述透明质酸衍生物m的结构式如式2所示，所述透明质酸衍生物f的结构式如式3所示。

其中，式2为式3为

优选地，式2中，r1为透明质酸高分子去除c6上羟基的残基部分；r2、r3、r4独立地选自氢、取代或未取代烷基、取代或未取代羟基、取代或未取代羧基、取代或未取代氨基和取代或未取代磺酸基中的任一种。

优选地，式3中，r5为透明质酸高分子去除羧基的残基部分；r6、r10和r11独立地选自氧、硫、取代或未取代亚烷基中的任一种；r7、r8、r9、r12、r13、r14、r15和r16独立地选自氢、取代或未取代烷基、取代或未取代羟基、取代或未取代羧基、取代或未取代氨基和取代或未取代磺酸基中的任一种。

步骤1)中，所述透明质酸衍生物m与所述透明质酸衍生物f的体积比为(0.5～1.5):(0.5～1.5)；例如所述透明质酸衍生物m与所述透明质酸衍生物f的体积比为1:0.5、1:0.7、1:0.9、1:1.1、1:1.3或1:1.5、0.5:1、0.7:1、0.9:1、1.1:1、1.3:1或1.5:1等。

优选地，所述透明质酸衍生物m与所述透明质酸衍生物f在反应体系中的终质量浓度均为0.01～0.05g/ml；例如透明质酸衍生物m与透明质酸衍生物f在反应体系中的终浓度均可以为0.01g/ml、0.02g/ml、0.03g/ml、0.04g/ml或0.05g/ml。

优选地，所述环加成反应的时间为6～24h，例如环加成反应的时间为6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h或24h等；所述环加成反应的温度为20～70℃，例如环加成反应的温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃或70℃等。

需要说明的是，光引发剂的作用在于将制备得到的透明质酸前处理结合物制备为透明质酸膜时发挥作用。在进行透明质酸膜之前，对加入了光引发剂的透明质酸前处理结合物可进行避光处理。需要说明的是，光引发剂的加入可以在制备透明质酸前处理结合物之前，也可以在制备透明质酸前处理结合物后，无论何时加入，均属于本发明的保护范围。

步骤2)中，所述透明质酸衍生物m、所述透明质酸衍生物f与所述光引发剂的体积比为(8.5～9.5):(8.5～9.5):(1.5～2.5)。

优选地，所述光引发剂的质量浓度为0.01～0.10g/ml，例如光引发剂的质量浓度为0.01g/ml、0.02g/ml、0.03g/ml、0.04g/ml、0.05g/ml、0.06g/ml、0.07g/ml、0.08g/ml、0.09g/ml或0.1g/ml等。

优选地，所述光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐、2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮和1-羟基环己基苯基酮中的任意一种或至少两种的混合物。所述混合物典型但非限制的组合为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐、2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的混合物，苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐、1-羟基环己基苯基酮的混合物，2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮和1-羟基环己基苯基酮的混合物，苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐、2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮和1-羟基环己基苯基酮的混合物。

优选地，所述光照光交联反应所用的光源波长为360nm～450nm，例如光源波长为360nm、370nm、380nm、390nm、400nm、410nm、420nm、430nm、440nm或450nm等。

优选地，所述光照光交联反应的光照时间为30s～30min，例如光照的时间为30s、40s、50s、60s、1min、5min、10min、15min、20min、25min或30min等；光照的距离为1～30cm，例如光照的距离为1cm、2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、9cm、10cm、15cm、20cm、25cm或30cm等。

其中，步骤1)中，所述透明质酸衍生物m是采用2-甲基丙烯酸酐对透明质酸进行改性得到的。

优选地，所述改性的方法为：采用2-甲基丙烯酸酐溶液与透明质酸水溶液在0～8℃的条件下反应8～48h，得到所述透明质酸衍生物m；例如反应温度为0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃或8℃等，反应时间为8h、10h、12h、15h、16h、18h、20h、24h、26h、28h、30h、32h、35h、36h、38h、40h、42h、46h或48h等。

优选地，所述2-甲基丙烯酸酐溶液是2-甲基丙烯酸酐溶解在丙酮中配成的溶液；所述2-甲基丙烯酸酐与所述丙酮的体积比为1:(1～5)，例如所述2-甲基丙烯酸酐与所述丙酮的体积比为1:1、1:2、1:3、1:4或1:5等。

优选地，所述透明质酸水溶液由透明质酸与水混合配成；所述透明质酸水溶液的质量浓度为0.001～0.010g/ml，例如透明质酸水溶液的质量浓度为0.001g/ml、0.002g/ml、0.003g/ml、0.004g/ml、0.005g/ml、0.006g/ml、0.007g/ml、0.008g/ml、0.009g/ml或0.01g/ml等。

优选地，所述2-甲基丙烯酸酐溶液中的2-甲基丙烯酸酐与所述透明质酸水溶液中的透明质酸的重复单元的摩尔数比为(0.54～5.42):1，例如2-甲基丙烯酸酐与透明质酸的重复单元的摩尔数比为0.54:1、0.55:1、0.6:1、0.8:1、0.9:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.1:1、5.2:1、5.3:1、5.4:1或5.42等。

优选地，所述透明质酸衍生物m还经过透析处理和冷冻干燥处理。

优选地，所述透析处理为：采用去离子水或0.1m氯化钠溶液对透明质酸衍生物m透析3～7天，所述透析处理所用的透析袋的截留分子量为3500da。

其中，步骤1)中，所述透明质酸衍生物f是采用2-呋喃甲胺对透明质酸进行改性得到的。

优选地，所述改性的方法为：采用2-呋喃甲胺和羧基活化剂的混合物与透明质酸缓冲溶液在15～40℃的条件下反应8～72h，得到所述透明质酸衍生物f；例如反应的温度为15℃、16℃、18℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃等，反应时间为8h、10h、12h、15h、18h、20h、24h、25h、28h、30h、32h、36h、38h、40h、42h、46h、48h、50h、52h、56h、60h、64h、66h、68h、70h或72h等。

优选地，所述透明质酸缓冲溶液是将透明质酸加入80～120mm的2-(n-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中制得的，所述透明质酸缓冲溶液的质量浓度为0.001～0.01g/ml，例如所述透明质酸缓冲溶液的质量浓度为0.001g/ml、0.002g/ml、0.003g/ml、0.004g/ml、0.005g/ml、0.006g/ml、0.007g/ml、0.008g/ml、0.009g/ml或0.01g/ml等。

优选地，所述2-(n-吗啉)乙磺酸缓冲溶液是将2-(n-吗啉)乙磺酸溶于水中，ph值调至5.3～5.8制得的，例如ph值为5.3、5.4、5.5、5.6、5.7或5.8等。

优选地，所述2-呋喃甲胺与所述透明质酸缓冲溶液中透明质酸的重复单元的摩尔数比为(1～6):1，例如所述2-呋喃甲胺与所述透明质酸缓冲溶液中透明质酸的重复单元的摩尔数比为1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1或6:1等。

优选地，所述羧基活化剂与所述透明质酸缓冲溶液中透明质酸的重复单元的摩尔数比为(1～10):1，例如所述羧基活化剂与所述透明质酸缓冲溶液中透明质酸的重复单元的摩尔数比为1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1等。

优选地，所述羧基活化剂为4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐。

优选地，所述透明质酸衍生物f还经过透析处理和冷冻干燥处理。

优选地，所述透析处理为：采用去离子水或0.1m氯化钠溶液对透明质酸衍生物f透析3～7天，所述透析处理所用的透析袋的截留分子量为3500da。

步骤2)中，所述冻干的温度为-50～-20℃，例如冻干的温度为-50℃、-45℃、-40℃、-35℃、-30℃、-25℃或-20℃等。

优选地，所述风干的温度为20～80℃，例如风干的温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃或80℃等。

本发明的目的之二在于提供一种透明质酸膜，由目的之一所述的透明质酸膜的制备方法制备得到。

本发明的目的之三在于目的之二所述的透明质酸膜的应用，将所述透明质酸膜用于生物医疗材料或组织工程材料的制备。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的透明质酸膜，采用透明质酸衍生物m与透明质酸衍生物f发生环加成反应，在避免加入其他大分子链的情况下，在透明质酸中引入环结构，加入光引发剂后光照发生光交联反应，再经冻干/风干后，获得的透明质酸膜具有较好的拉伸力学性能，具体的，制得的透明质酸膜冻干膜具有均匀的、疏松多孔的微观孔隙，最大拉伸应力为4.5mpa，杨氏模量为39.4mpa；制得的透明质酸风干膜表面光滑平整，无明显的微观孔隙，最大拉伸应力为145mpa，杨氏模量为3.8gpa，有效扩展了透明质酸膜的应用范围。

附图说明

图1为本发明的实施例1制备的透明质酸膜冻干膜的sem图；

图2为本发明的实施例2制备的透明质酸膜风干膜的sem图；

图3为本发明的实施例1制备的透明质酸膜冻干膜力学性能测试结果图；

图4为本发明的实施例2制备的透明质酸膜风干膜的力学性能测试结果图；

图5为本发明的对比例5制备的单交联冻干膜的杨氏模量测试结果图；

图6为本发明的对比例5制备的单交联风干膜的杨氏模量测试结果图。

具体实施方式

下面结合附图1-6，并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

如无具体说明，本发明的实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

本实施例的透明质酸膜的制备方法，其包括以下步骤：

(1)透明质酸衍生物m的制备：

透明质酸水溶液：

由透明质酸与去离子水混合配成质量浓度为0.005g/ml的透明质酸水溶液。

2-甲基丙烯酸酐溶液：

每500μl2-甲基丙烯酸酐溶于2ml的丙酮溶液中配成。

透明质酸衍生物m：

将上述配制得到的2-甲基丙烯酸酐溶液与透明质酸水溶液混合，然后采用naoh溶液调整ph值至10，在4℃的条件下反应20h，反应结束后，反应体系依次经透析和冷冻干燥，得到透明质酸衍生物m，透明质酸衍生物m的结构式如下：

其中，透析为采用去离子水透析5天，透析所用的透析袋的截留分子量为3500da。

(2)透明质酸衍生物f的制备：

透明质酸缓冲溶液：

将2-(n-吗啉)乙磺酸颗粒溶于去离子水中，再用naoh和/或盐酸调ph值至5.5，定容配制成2-(n-吗啉)乙磺酸缓冲溶液，配制后冷藏于4℃的条件下24h后使用；

将透明质酸加入100mm2-(n-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中制得透明质酸缓冲溶液，透明质酸缓冲溶液的质量浓度为0.005g/ml。

透明质酸衍生物f：

在磁力搅拌的条件下，在透明质酸缓冲溶液中，加入用量为透明质酸重复单元数5倍的4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐，搅拌20min后，加入用量为透明质酸重复单元数2倍的2-呋喃甲胺，在20℃的条件下反应40h，反应结束后，依次经透析和冷冻干燥，得到透明质酸衍生物f，透明质酸衍生物f的结构式如下：

其中，透析为采用去离子水透析5天，透析所用的透析袋的截留分子量为3500da。

(3)透明质酸膜的制备：

将步骤(1)制备的透明质酸衍生物m、透明质酸衍生物f以及步骤(2)中的苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(光引发剂)按照体积比为9:9:2进行混合；其中透明质酸衍生物m的浓度为0.03g/ml，透明质酸衍生物f的浓度为0.03g/ml，光引发剂的浓度为0.005g/ml；

混合后，避光，除去气泡，然后置于37℃的水浴锅中，避光过夜反应，得到一步交联后的水凝胶结合物，在模具中流延成膜，再经光照，光照波长为360nm，光照时间为8min，光照距离为5cm，再经-20℃冻干，冻干时间为16小时，制备得到透明质酸膜，其sem图如图1所示。

由图1可以看出，制备得到的透明质酸膜具有均匀的、疏松多孔的微观形貌。

实施例2

本实施例的透明质酸膜的制备方法，其与实施例1提供的制备方法大致相同，区别在于透明质酸膜的制备方法的不同，为风干膜，风干条件为：温度20℃，风干时间10小时。

制备得到透明质酸膜，其sem图如图2所示。

由图2可以看出，制备得到的透明质酸膜表面光滑平整，无明显的微观孔隙。

实施例3

本实施例的透明质酸膜的制备方法，其与实施例1提供的制备方法大致相同，区别在于透明质酸膜的制备方法的不同，区别如下：

将透明质酸衍生物m、透明质酸衍生物f以及苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(光引发剂)按照体积比为9:9:2进行混合；其中透明质酸衍生物m的浓度为0.02g/ml，透明质酸衍生物f的浓度为0.02/ml，光引发剂的浓度为0.03g/ml。

实施例4

本实施例的透明质酸膜的制备方法，其与实施例1提供的制备方法大致相同，区别在于透明质酸膜的制备方法的不同，区别如下：

将透明质酸衍生物m、透明质酸衍生物f以及苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(光引发剂)按照体积比为5:5:2进行混合；其中透明质酸衍生物m的浓度为0.05g/ml，透明质酸衍生物f的浓度为0.05g/ml，光引发剂的浓度为0.008g/ml。

通过用instron力学测试机对冻干膜和风干膜样品进行拉伸测试，测试标准及条件如下：按标准拉伸测试方法制备好样品后进行测试，使用10n传感器，将拉伸样品固定在上下两端的夹具上，使其保持正常伸展状态，根据样品的大小设置好测试参数，测试曲线出现突变后，停止拉伸。

测试参数为：长为15mm，宽为5mm，高1mm，拉伸速率为0.5mm/min。

测试结果显示，随着材料浓度的提高，透明质酸膜的力学性能也随之增强，在实施例1和2所使用的浓度时达到最高，随后随着浓度的增加，力学强度降低。

实施例1制备的透明质酸冻干膜力学性能测试结果图如图3所示，由图3可以看出，制得的透明质酸冻干膜最大拉伸应力为4.5mpa，杨氏模量为39.4mpa。

实施例2制备的透明质酸膜风干膜的力学性能测试结果图如图4所示，由图4可以看出，透明质酸风干膜最大拉伸应力为145mpa，杨氏模量为3.8gpa。

对比例1