基于人角膜基质为载体的角膜内皮膜片的制作方法

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及基于人角膜基质为载体的角膜内皮膜片及其制造方法。

背景技术：

角膜病是世界上仅次于白内障的第二位致盲眼病。全世界4500万盲人中，有800万为角膜病致盲，且平均每年新增150-200万例因角膜溃疡和外伤致盲的患者。角膜移植是目前严重角膜病的主要治疗手段，虽然我国的角膜病致盲患者超过100万，但每年角膜移植术不足5000例，角膜供体的缺乏一直是并越来越成为角膜移植的重要制约因素。

其中很大一部分患者为角膜内皮失代偿引起的角膜内皮盲，目前治疗这种疾病最有效的方法是进行角膜内皮移植术，然而由于角膜供体匮乏，很多患者得不到相应的治疗，如果能够采用组织工程技术构建角膜内皮植片，将大大缓解这一问题。

技术实现要素：

为了构建建模内皮膜片，本发明提供基于人角膜基质为载体的角膜内皮膜片及其制造方法。为了实现本发明的目的，本发明拟采用如下的技术方案。

本发明一方面涉及基于人角膜基质为载体的角膜内皮膜片，所述作为载体的人角膜基质的平均厚度为20-100μm，优选为20-70μm；所述载体上具有阻隔水和促进细胞粘附的修饰层，在所述修饰层上面具接种有角膜内皮细胞。本发明通过采用平均厚度更薄的人角膜基质，由此能够将一个供体材料切削为几个薄片，既发挥了供体材料的最大价值，又能为内皮膜片的构建提供了很好的支架材料。

在本发明的一个优选实施方式中，所述载体上具有阻隔水和促进细胞粘附的层是指iv型胶原和层粘蛋白的修饰层。在将角膜基质直接放入培养基中，水份进入基质会使支架水肿，导致角膜内皮细胞附着不良，并且无法观察负载细胞状态及密度。为了解决这个问题，发明人创造性的将阻隔水进入基质的iv型胶原及利于细胞粘附的层粘蛋白(laminin)涂于基质表面，然后接种角膜内皮细胞。本发明通过将角膜内皮细胞成功的接种到基质上制备成可有效发挥功能的角膜内皮细胞植片。

在本发明的一个优选实施方式中，所述具有阻隔水和促进细胞粘附的修饰层厚度为1-5微米。

在本发明的一个优选实施方式中，由所述角膜内皮细胞形成的层的厚度为3-5微米。

在本发明的一个优选实施方式中，所述人角膜基质是通过准分子激光/角膜刀将一个供体材料的基质切削为3～5个薄片所得到的。

本发明另一方面还涉及上述基于人角膜基质为载体的角膜内皮膜片的制造方法，其包括如下步骤：

(1)通过准分子激光/角膜刀将一个供体材料的基质切削为3～5个薄片；

(2)在薄片表面加入阻隔水和促进细胞粘附的修饰层；

(3)在阻隔水和促进细胞粘附的修饰层表面培养人角膜内皮细胞。

在本发明的一个优选实施方式中，所述薄片在加入阻隔水和促进细胞粘附的修饰层之前进行杀菌消毒处理。

在本发明的一个优选实施方式中，在薄片表面加入阻隔水和促进细胞粘附的修饰层是指吸取iv型胶原及层粘蛋白溶液，滴于平铺的基质薄片表面，使得液体完全将基质薄片包裹，置于超净台内晾干，直至基质表面干燥。

有益效果

本发明以人角膜基质为组织工程角膜内皮膜片的支架材料，因为是角膜的天然组织，具有其他材料不可比拟的透氧性、透光性、生物相容性、生物稳定性和力学性能。本发明通过采用平均厚度更薄的人角膜基质，由此能够将一个供体材料切削为几个薄片，既发挥了供体材料的最大价值，又能为内皮膜片的构建提供了很好的支架材料。

附图说明

图1：激光切削所得基质薄片的照片；

图2：以基质为支架构建出的组织工程角膜内皮膜片(光镜图)；

图3：角膜内皮损伤模型的猫的眼睛照片；

图4：以基质为支架构建的组织工程角膜内皮膜片植入给角膜内皮损伤模型的猫，术后2周角膜恢复透明。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1

1)取捐献的人眼角膜作为供体材料，设置激光/角膜刀参数，将切削厚度设置为50μm，直径设置为8mm,然后将供体材料置于机器中，每次切出一个厚度为50μm的薄片(后称基质薄片)(图1)，将所得基质薄片收集起来，放置于无菌的ep管中，密封后放置于负80℃冰箱保存；

2)超净台内，将冷冻保存的基质薄片从ep管中取出，转移到无菌的离心管中；pbs冲洗基质薄片3次，每次5min；

3)将基质薄片转移到新的无菌离心管中，向管内缓缓加入细胞培养用的双抗(青霉素-链霉素混合液)，直至将基质薄片完全淹没，摇晃离心管1min；

4)将基质薄片转移到新的无菌离心管中，pbs冲洗基质薄片3次，每次5min；

5)将冲洗过的基质薄片转移到细胞培养皿中，用显微镊将基质薄片展平，使之完全平铺于细胞培养皿的皿底；

6)用移液枪吸取iv型胶原(0.1mg/ml)2μl、laminin溶液(0.5mg/ml)100μl，缓缓滴于平铺的基质薄片表面，使得液体完全将基质薄片包裹，置于超净台内晾干，直至基质表面干燥；

7)将人角膜内皮细胞悬液滴加在基质薄片上，置于37℃，5％co2的细胞培养箱中培养7天～10天至角膜内皮细胞融合后2～3天，构建出组织工程角膜内皮膜片(图2)。

8)以基质薄片为支架构建的组织工程角膜内皮膜片，通过移植给角膜内皮损伤模型的猫(图3)，术后2周后观察角膜，其恢复透明(图4)，与常规的角膜移植相比，本发明的角膜内皮膜片在移植效果上能够取得与传统角膜移植相似的效果，但本发明能够将一个供体材料切削为几个薄片供多个病人使用。

以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

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