一种利用丰年虾无节幼体进行生物急性毒性实验的方法与流程

本发明涉及环境毒理学技术领域，具体是涉及一种利用丰年虾无节幼体进行生物急性毒性实验的方法。

背景技术：

在环境问题日益突出的今天，生态毒理学研究对于生态系统健康发展与生态系统服务功能的提升至关重要。水生生态毒理学作为生态毒理学研究重点领域之一，正逐渐成为科研人员的兴趣所向。水生生态毒理学主要研究环境中的有毒有害物质对水生生物的毒性效应及其对生态系统的影响。动物毒性实验通过测定污染物在短期或长期内对生物所产生的毒性作用来为环境污染物及污染程度提供重要的评价指标。

作为生态毒理学研究中常用的实验动物，卤虫属动物已被广泛应用于污染物暴露、环境因子干扰、食物链传递和生态风险评价等方面。卤虫具有2种生殖方式，卵胎生和卵生。其中，卵生方式又有2种卵产生，非滞育卵和滞育卵。滞育卵可长期保存，可做为实验材料进行毒理学研究。且卤虫对极端条件具有很强的适应性，可以在其他生命形式不能生存的环境下存活。由于其较强的环境适应能力可作为生态毒理学研究的代表性浮游动物，因此用于动物毒性实验较为合适。通过对丰年虾无节幼体进行生物急性毒性实验，同时辅以溶剂的对照实验，综合考虑实验用水的理化条件，可得出可靠的数据，并可以作为海水水质基准值的推导的数据来源之一。

本发明的目的在于针对现有实验方法中的不足，充分考虑我国海洋水生态系统特征，根据不同物种不同污染物质予以差异性的规定和调整，提供一种针对性强、精准高效的利用丰年虾无节幼体进行生物急性毒性实验方法。

技术实现要素：

针对现有实验方法中的不足，充分考虑我国海洋水生态系统特征，根据不同物种不同污染物质予以差异性的规定和调整，提供一种针对性强、精准高效的利用丰年虾无节幼体进行生物急性毒性实验方法。依据该方法得到的急性毒性实验数据更具科学性和可靠性，更适用于后续海水水生生物水质基准值的推导。

一种利用丰年虾无节幼体进行生物急性毒性实验方法，包括以下步骤：

(1)丰年虾孵化和喂养：收集自来水曝气一天脱氯，加入海水盐配制人工海水，选择冻干的丰年虾卵孵化24h，间断曝气12h，孵化过程中加入10ml高温灭活小球藻并持续24h光照，孵化结束后将丰年虾的肠道排空一天后进行急性毒性实验。所述孵化缸水的温度为26℃，水量20l，缸内设有一根加热棒、一台增氧机、一台过滤器和led光照灯，以保证丰年虾的基本孵化和生存条件。；

(2)急性毒性实验：

a.配制毒性物质溶液，大多有机污染物几乎不溶解于海水，根据不同污染物选择合适的助溶剂，配制较高浓度的毒性物质溶液，用于后续实验操作；

b.配制人工海水，中国近海海水密度约为1.020，按照自来水和海水盐为1∶0.145的质量比配制人工海水，用于后续实验操作；

c.设置7个实验组，其中一个溶剂对照组、一个空白对照组，都设有3个平行，实验组1～5是不同浓度的毒性物质实验组，溶剂对照组是助溶剂实验组，空白组是人工海水实验组，6个实验组和空白组除水质不同外，其余条件均相同。急性毒性实验的毒性物质浓度根据预实验浓度及实验效果确定；

d.对每个培养板投入20条步骤(1)中的丰年虾无节幼体进行急性毒性实验，急性毒性实验期间，每天记录丰年虾无节幼体死亡情况。在实验过程中，对丰年虾无节幼体进行应激刺激，10s内无应激反应则判断为死亡，以丰年虾无节幼体的死亡情况作为毒性评价的指标。

(3)分析计算：分析丰年虾无节幼体的死亡情况，根据各次记录的死亡数计算平均死亡率，根据回归方程求出毒性物质的半数致死浓度(lc50)及95％置信区间，再计算出安全浓度。所述的安全浓度的计算方法具体为：将实验组1～5和助溶剂实验组以及空白对照组的丰年虾无节幼体的死亡情况进行对比，根据各次记录的死亡数计算平均死亡率，再转换成概率单位，计算出试验液浓度对数，求出概率单位与试验液浓度对数的回归方程。求出毒性物质的半数致死浓度(lc50)及95％置信区间，再用经验公式96hlc50×0.1计算出安全浓度。

本发明的优点：

1.优先选用生态毒理学代表性浮游动物，丰年虾在我国近海海水中广泛分布，可以很好的表征水体毒性强度；

2.所述急性毒性实验设有7组实验，每组实验设有3个平行组，多个平行有利于排除异常数据和偶然误差；

3.本实验方法思维严谨，所选丰年虾冻干虾卵便于保存和运输，所选丰年虾无节幼体体积小，对毒性物质的敏感度高，对毒性效应的反映有更好的精确性和代表性，结果会更加准确、可信，能够得到更为可靠的用于海水水生生物水质基准值推导的急性毒性数据。

附图说明

图1是本发明的实验流程图；

具体实施方式

本发明涉及环境毒理学技术领域，具体是涉及一种利用丰年虾无节幼体进行生物急性毒性实验的方法。该方法适用于我国海洋地区大部分有机污染物如重金属、芳香烃、多溴联苯醚等。

下面通过具体的实施例萘对本发明进行进一步的描述。

以下实施例可以使本专业技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

本实施例萘为例，利用丰年虾无节幼体进行萘的急性毒性实验。具体步骤如下：

1.丰年虾孵化和喂养

收集自来水曝气一天脱氯，加入海水盐配制20l人工海水，选择冻干的1g丰年虾卵孵化24h，间断曝气12h，孵化过程中加入10ml高温灭活小球藻并持续24h光照，孵化结束后将丰年虾的肠道排空一天后进行急性毒性实验。所述孵化缸水的温度为26℃，水量20l，缸内设有一根加热棒、一台增氧机、一台过滤器和led光照灯，以保证丰年虾的基本孵化和生存条件；

2.急性毒性实验

(1)配制萘的乙醇溶液，称取0.1g萘，用无水乙醇溶解，定容至100ml，配制成浓度为1g/l的母液，按照浓度梯度稀释成1μg/l浓度溶液；

(2)配制人工海水，按照水和海水盐为1∶0.145的质量比配制人工海水，在20l自来水中加入725g海水盐，得到20l人工海水；

(3)设置6个实验组1个空白对照组，每个实验组设有3个平行，实验组1～5是浓度分别为1.0μg/l、0.8μg/l、0.6μg/l、0.4μg/l、0.2μg/l的萘实验组，实验组6是助溶剂乙醇实验组，空白组是人工海水实验组，6个实验组和空白组除水质不同外，其余条件均相同，实验组和空白组加入人工海水后，实验组1～5各取10ml1μg/l浓度的萘溶液，并分别加入0ml、2.5ml、6.67ml、15ml、40ml人工海水，稀释后的溶液各取1ml放入12孔培养板中；

(4)向每个实验组溶液中投入15-20条丰年虾无节幼体进行急性毒性实验，急性毒性实验期间，保持24h光照，温度控制在25℃，每天记录丰年虾无节幼体死亡情况，每天记录水质指标。24h后，对丰年虾无节幼体进行应激刺激，10s内无应激反应则判断为死亡，以丰年虾无节幼体的死亡情况作为毒性评价的指标；

3.分析计算

分析7个实验组丰年虾无节幼体的死亡情况，将实验组1～5和助溶剂实验组以及空白对照组的丰年虾无节幼体的死亡情况进行对比，根据各次记录的死亡数计算平均死亡率，再转换成概率单位，计算出试验液浓度对数，求出概率单位与试验液浓度对数的回归方程。求出毒性物质的半数致死浓度(lc50)及95％置信区间。再用经验公式96hlc50×0.1计算出安全浓度。

熟悉本技术领域的人员应理解，目前毒性实验方案各有不同，以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；凡是依本发明作等效变化与修改，都被本发明的专利范围所涵盖。

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