CD4突变蛋白及其使用方法与流程

相关申请的交叉引用

本专利申请要求美国临时专利申请号62/645,903(于2018年3月21日提交)的优先权的权益。优先权申请的全部公开内容通过引用以其整体并出于所有目的并入本文。

政府支持声明

本发明在由美国国立卫生研究院(thenationalinstitutesofhealth)授予的授权号ai091476、ai129868和ai126623的政府支持下完成。政府在本发明中具有一定的权利。

本发明一般性地涉及蛋白质(包括cd4)及其在hiv治疗中的用途。

背景技术：

来源于cd4(即在允许的宿主cd4⁺t细胞上表达的人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，hiv)的跨膜受体)的多肽可用于抑制hiv感染。这样的cd4来源多肽可通过与病毒颗粒结合来进行调解以阻断或“中和”hiv感染，从而阻碍对允许的宿主细胞上的cd4的识别。可溶性形式的cd4(scd4)在19世纪80年代最初作为抑制hiv感染的方法提出(hussey，r.e.etal.(1988)nature，331(6151)：78-81；deen，k.c.etal.(1988)nature，331(6151)：82-4；smith，d.h.etal.(1987)science，238(4834)：1704-7；fisher，r.a.etal.(1988)nature，331(6151)：76-8；watanabe，m.etal.(1989)nature，337(6204)：267-70；traunecker，a.etal.(1988)nature，331(6151)：84-6)。然而，scd4在血浆中的短半衰期减弱了对其用作治疗hiv感染的重组蛋白治疗药物的热情(watanabeetal.(1989)，同上；schooley，r.t.etal.(1990)ann.intern.med.，112(4)：247-53)。此外，从患者直接分离的相当比例的hiv毒株(即，主要分离株)对通过scd4的中和具有抗性(ashkenazi，a.etal.(1991)proc.natl.acad.sci.usa，88(16)：7056-60；daar，e.s.etal.(1990)proc.natl.acad.sci.usa，87(17)：6574-8；o′brien，w.a.etal.(1992)j.virol.，66(5)：3125-30)。

通过添加免疫球蛋白(ig)可结晶片段(fc)已进行对scd4半衰期的早先改进(capon，d.j.etal.(1989)nature，337(6207)：525-31；chamow，s.m.etal.(1992)int.j.cancersuppl.，7：69-72；bym，r.a.etal.(1990)nature，344(6267)：667-70)。包含免疫球蛋白fc的scd4形式被称为cd4-ig。尽管采用这种方法，但人cd4-ig的半衰期仍低于常规抗体的期望的半衰期(hodges，t.l.etal.(1991)antimicrob.agentschemother.，35(12)：2580-6；kahn，j.o.etal.(1990)ann.intern.med.，112(4)：254-61；chamow，s.m.etal.(1994)bioconjug.chem.，5(2)：133-40)。cd4-ig的次优药动学特性限制了其在治疗环境中的效用。

尽管迄今为止已经取得了一些进展，但是仍然持续需要用于治疗和管理hiv和aids的新且有效的治疗。

发明概述

本发明部分地基于对包含人cd4结构域1和cd4结构域2二者(cd4d1d2)的蛋白质的发现，所述蛋白质具有比包含天然存在的人cd4d1d2的蛋白质更高的稳定性和/或活性。在某些实施方案中，与包含天然存在的人cd4d1d2的蛋白质相比，所述蛋白质表现出更高的聚集温度(例如，如在热扫描测定中通过动态光散射(dynamiclightscattering，dls)测量的)，和/或更长的血浆半衰期。此外，预期本文中所述的蛋白质可适合于在人对象中治疗hiv。

在一个方面中，本发明提供了包含人cd4结构域1和结构域2(cd4d1d2)突变蛋白的蛋白质，其中所述cd4d1d2突变蛋白与野生型人cd4d1d2(seqidno：1)具有至少90％同一性，并且包含：

a.不带电荷氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中碱性氨基酸的至少一个替换；

b.酸性氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中碱性氨基酸的至少一个替换；

c.酸性氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中不带电荷氨基酸的至少一个替换；或

d.比所替代氨基酸体积更大的疏水性氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中甘氨酸或具有隐蔽疏水性侧链的氨基酸的至少一个替换；

其中所述替换是在非人灵长类cd4d1d2中与野生型人cd4d1d2(seqidno：1)不相同的位置。

在另一个方面中，本发明提供了包含cd4d1d2突变蛋白的蛋白质，其中所述cd4d1d2突变蛋白与野生型人cd4d1d2(seqidno：1)具有至少90％同一性，并且包含对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置处的至少一个替换：k1、k2、v4、l5、g6、k7、k8、d10、t11、v12、l14、t15、t17、a18、s19、q20、k21、k22、s23、i24、q25、h27、n30、n32、i34、k35、i36、l37、n39、g41、s42、l44、k46、p48、k50、l51、n52、d53、a55、d56、r58、r59、s60、l61、q64、g65、n66、f67、p68、l69、i70、i7l、k72、k73、l74、k75、i76、e77、d80、t81、v86、e87、d88、q89、e91、v93、q94、l95、l96、v97、f98、g99、t101、a102、n103、s104、d105、h107、l108、q110、s113、l114、l116、t117、l118、s120、p121、p122、g123、s124、s125、v128、q129、c130、r131、s132、p133、r134、g135、n137、i138、q139、g140、g141、k142、t143、l144、s145、v146、s147、l149、e150、l151、q152、d153、g155、t156、w157、t158、t160、v161、l162、q163、n164、q165、k166、k167、v168、e169、f170、k171、i172、d173、i174、v175、v176或a178。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含非人灵长类cd4d1d2中对应位置的氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中氨基酸的至少一个替换。例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含例如非人灵长类cd4d1d2中对应位置的氨基酸对对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置的至少一个替换：k1、k2、v4、g6、k7、d10、t11、v12、t15、t17、a18、s19、q20、k21、k22、s23、i24、q25、h27、n30、n32、i34、k35、n39、g41、s42、l44、k46、p48、k50、l51、n52、d53、a55、d56、r58、r59、s60、l61、q64、g65、n66、p68、l69、i70、k72、k73、l74、k75、i76、e77、d80、t81、e87、d88、q89、e91、q94、l96、g99、t101、a102、n103、s104、d105、h107、l108、q110、s113、t117、s120、p122、g123、s124、s125、v128、q129、c130、r131、s132、r134、g135、n137、i138、q139、g140、g141、k142、t143、l144、s145、v146、s147、e150、l151、q152、d153、t156、w157、t158、t160、v161、l162、q163、n164、q165、k166、k167、v168、e169、f170、k171、i172、d173、i174、v175或a178。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含猿(ape)、旧世界猴(oldworldmonkey)、或新世界猴(newworldmonkey)cd4d1d2中对应位置的氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中氨基酸的至少一个替换。例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含例如猿、旧世界猴、或新世界猴cd4d1d2中对应位置的氨基酸对对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置的至少一个替换：k1、k2、k7、d10、t11、t15、t17、a18、s19、q20、k21、k22、s23、i24、q25、h27、n30、n32、i34、n39、g41、s42、l44、k46、p48、n52、d53、a55、r59、l61、q64、g65、n66、p68、l69、i70、k72、k73、l74、k75、i76、d80、e87、d88、q89、q94、l96、a102、n103、s104、q110、s113、t117、s120、s124、q129、r131、r134、n137、q139、g140、g141、k142、t143、l144、s145、v146、s147、e150、l151、q152、t156、w157、t158、t160、v161、l162、n164、q165、k166、k167、v168、k171、d173、i174或v175。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含猿或旧世界猴cd4d1d2中对应位置的氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中氨基酸的至少一个替换。例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含例如猿或旧世界猴cd4d1d2中对应位置的氨基酸对对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置的至少一个替换：k2、d10、t15、t17、s19、q20、k21、k22、s23、i24、q25、n30、n32、i34、n39、p48、n52、d53、a55、r59、g65、n66、p68、l69、d80、e87、d88、q89、q94、q110、t117、s120、s124、q129、r134、g140、k142、l144、s147、l151、t156、w157、t160、v161、l162、n164、k166或k167。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含猿cd4d1d2中对应位置的氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中氨基酸的至少一个替换。例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含例如猿cd4d1d2中对应位置的氨基酸对对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置的至少一个替换：k1、t15、t17、q20、i34、n52、d53、a55、r59、g65、p68、e87、d88、t117、s120、r134、g140、s147、w157、t160、n164或k166。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含旧世界猴cd4d1d2中对应位置的氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中氨基酸的至少一个替换。例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含例如旧世界猴cd4d1d2中对应位置的氨基酸对对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置的至少一个替换：k2、d10、t15、t17、s19、q20、k21、k22、s23、i24、q25、n30、n32、i34、n39、p48、n52、a55、r59、n66、p68、l69、d80、d88、q89、q94、q110、s124、q129、r134、g140、k142、l144、s147、l151、t156、t160、v161、l162、n164、k166或k167。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含比所替代氨基酸的体积(例如侧链体积)更大的疏水性氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中甘氨酸或疏水性氨基酸的至少一个替换。例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含例如比所替代氨基酸体积更大的疏水性氨基酸对对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置的氨基酸的至少一个替换：l5、g6、v12、l14、a18、i24、i36、l37、l44、l51、a55、g65、f67、p68、l69、v93、g99、i71、l74、v86、v93、l95、l96、v97、f98、a102、l108、l114、l116、l118、p121、v128、p133、i138、g141、l144、v146、l149、g155、v161、v168、f170、i172、i174或v176。在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含例如比所替代氨基酸体积更大的疏水性氨基酸对对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置的氨基酸的至少一个替换：g6、a55、l116、v128、v146、v168或v176。在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含例如比所替代氨基酸体积更大的疏水性氨基酸对对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置的氨基酸的至少一个替换：g6、i24、l44、l51、a55、l69、g99、a102、v128、g141、v146、v161和v168。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含导致蛋白质的净正电荷降低的至少一个替换。例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含不带电荷氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中碱性氨基酸的至少一个替换或者酸性氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中碱性氨基酸的至少一个替换。例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含例如g、a、s、t、n、q、h或y对对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置的氨基酸的至少一个替换：k1、k2、k7、k21、k22、k35、k46、k50、r58、r59、k72、k75、r131、r134、k142、k166、k167或k171。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含酸性氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中不带电荷氨基酸的至少一个替换。例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含例如d或e对对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置的氨基酸的至少一个替换：v4、t11、t15、t17、s19、q20、s23、q25、h27、n30、n32、i34、s42、p48、n52、s60、l61、q64、n66、i70、i76、t81、q89、q94、t101、n103、s104、h107、q110、s113、t117、s120、p122、g123、s124、s125、q129、g135、n137、q139、g140、t143、s145、s147、l151、q152、t156、t158、t160、l162、q163、n164、q165、v175或a178。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含cd4d1结构域中的至少一个替换，例如，一个或更多个本文中所述的替换，以及cd4d2结构域中的至少一个替换，例如，一个或更多个本文中所述的替换。在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个替换。在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白与野生型人cd4d1d2(seqidno：1)具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白在野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中具有表面暴露侧链的氨基酸位置处包含少于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个替换。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置的至少一个替换：k2、g6、k8、t15、t17、k21、s23、a55、i70、k72、k75、q94、l96、q110、l116、v128、r134、k142、v146、n164、k166、k167、v168或v176。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置的至少一个替换：k1、k2、l5、g6、k7、k8、t15、t17、k21、k22、s23、a55、i70、k72、k75、q94、l96、g99、a102、q110、r134、k142、n164、k166、k167或k171。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置的至少一个替换：g6、s23、a55、k72、k75、q94、l96、q110、l116、v128、r134、v146、n164、k167、v168或v176。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置的至少一个替换：l5、k8、s23、a55、k75、q94、l96、q110、r134、n164或k167。例如，cd4d1d2突变蛋白可包含对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置的至少一个替换：g6、s23、a55、k72、k75、q94、l96、q110、v128、r134、v146、n164、k167或v168；对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置的至少一个替换：l5、s23、a55、l96、r134、n164或k167；对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置的至少一个替换：k72、k75、q94、q110、l116、v128、r134、v146、n164、k167、v168或v176；对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置的至少一个替换：s23、a55、r134、n164或k167；或者对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置的至少一个替换：s23、a55、r134、n164或k167；对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置的至少一个替换：a55、r134、n164或k167。在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置的至少一个替换：g6、s23、a55、v128、v146或v168；对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置的至少一个替换：k2、k7、k8、t17、i70、k72、q94、q110、r134、k142、n164或k167。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下位置处的替换：a55和k72；a55和k75；a55和q94；a55和q110；a55和l116；a55和v128；a55和r134；a55和v146；a55和n164；a55和k167；a55和v168；s23和k72；s23和k75；s23和q94；s23和q110；s23和l116；s23和v128；s23和r134；s23和v146；s23和n164；s23和k167；s23和v168；g6和k72；g6和k75；g6和q94；g6和q110；g6和l116；g6和v128；g6和r134；g6和v146；g6和n164；g6和k167；g6和v168；k72和k75；k72和q94；k72和q110；k72和l116；k72和v128；k72和r134；k72和v146；k72和n164；k72和k167；k72和v168；k75和94；k75和q110；k75和l116；k75和v128；k75和r134；k75和v146；k75和n164；k75和k167；k75和v168；q94和q110；q94和l116；q94和v128；q94和r134；q94和v146；q94和n164；q94和k167；q94和v168；q110和l116；q110和v128；q110和r134；q110和v146；q110和n164；q110和k167；q110和v168；l116和v128；l116和r134；l116和v146；l116和n164；l116和k167；l116和v168；v128和r134；v128和v146；v128和n164；v128和k167；v128和v168；v146和n164；v146和k167；v146和v168；或n164和k167。在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白以下位置处的替换：s23、a55和k72；s23、a55和k75；s23、a55和q94；s23、a55和q110；s23、a55和l116；s23、a55和v128；s23、a55和r134；s23、a55和v146；s23、a55和n164；s23、a55和k167；s23、a55和v168；g6、s23和k72；g6、s23和k75；g6、s23和q94；g6、s23和q110；g6、s23和l116；g6、s23和v128；g6、s23和r134；g6、s23和v146；g6、s23和n164；g6、s23和k167；g6、s23和v168；g6、a55和k72；g6、a55和k75；g6、a55和q94；g6、a55和q110；g6、a55和l116；g6、a55和v128；g6、a55和r134；g6、a55和v146；g6、a55和n164；g6、a55和k167；g6、a55和v168；g6、s23、a55和k72；g6、s23、a55和k75；g6、s23、a55和q94；g6、s23、a55和q110；g6、s23、a55和l116；g6、s23、a55和v128；g6、s23、a55和r134；g6、s23、a55和v146；g6、s23、a55和nl64；g6、s23、a55和k167；或g6、s23、a55和v168。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下位置处的替换：r134、n164和k167；k72、r134和k167；k75、r134和k167；q94、r134和k167；q110、r134和k167；q94、q110和r134；q94、q110和n164；q94、q110和167；q94、q110、r134和k167；k72、k75和r134；k72、k75和n164；k72、k75和k167；k72、k75、r134和k167；v128、v168和r134；v128、v168和n164；v128、v168和k167；v128、v168和v146；v128、v168和l116；v128、v168和k72；v128、v168和k75；v128、v168和q94；v128、v168和q110；v146、r134和k167；v146、r134和n164；r134、k142、n164和k167；i70、r134、n164和k167；k72、r134、n164和k167；q94、r134、n164和k167；q110、r134、n164和k167；q94、q110、r134和k167；q94、q110、r134、n164和k167；k72、q94、q110、r134、n164和k167；k75、q94、q110、r134、n164和k167；k72、k75、q94、q110、r134、n164和k167；v128、v168、r134和k72；v128、v168、r134和k75；v128、v168、r134和q94；v128、v168、r134和q110；v128、v168、r134和l116；v128、v168、r134和v146；v128、v168、r134和n164；v128、v168、r134和k167；v128、v168、v146和k72；v128、v168、v146和k75；v128、v168、v146和q94；v128、v168、v146和q110；v128、v168、v146和n164；或v128、v168、v146和k167。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下位置处的替换：g6、a55、v128和v168；g6、a55、v146和v168；g6、a55、v128和v146；g6、a55、v128、v146和v168；g6、s23、a55、v128和v168；g6、s23、a55、v128、v146和v168；g6、s23、a55、v128、r134、v146和v168；a55、v128、v168和k72；a55、v128、v168和k75；a55、v128、v168和q94；a55、v128、v168和q110；a55、v128、v168和l116；a55、v128、v168和r134；a55、v128、v168和v146；a55、v128、v168和k167；s23、v128、v168和k72；s23、v128、v168和k75；s23、v128、v168和q94；s23、v128、v168和q110；s23、v128、v168和l116；s23、v128、v168和r134；s23、v128、v168和v146；s23、v128、v168和k167；s23、a55、r134和k167；s23、a55、r134、n164和k167；s23、a55、k72、r134和k167；s23、a55、k75、r134和k167；s23、a55、q94、r134和k167；s23、a55、l96、r134和k167；s23、a55、q110、r134和k167；s23、k72、k75、r134和k167；s23、k72、k75、r134、n164和k167；s23、a55、k72、k75、r134和k167；s23、a55、k72、k75、r134、n164和k167；s23、a55、k72、k75、l96、r134、n164和k167；s23、a55、k72、k75、q94、r134、n164和k167；s23、a55、k72、k75、q110、r134、n164和k167；s23、a55、k72、k75、q94、q110、r134、n164和k167；s23、a55、k72、k75、q94、l96、q110、r134、n164和k167；g6、s23、a55、k72、k75、q94、q110、r134和k167；s23、a55、k72、k75、q94、q110、v128、r134和k167；s23、a55、k72、k75、q94、q110、r134、v146和k167；s23、a55、k72、k75、q94、q110、r134、k167、v168；s23、a55、k72、k75、q94、q110、v128、r134、k167、v168；s23、a55、k72、k75、q94、q110、v128、r134、v146、k167、v168；s23、a55、k72、k75、q94、q110、v128、r134、n164、k167、v168；s23、a55、k72、k75、q94、q110、v128、r134、v146、n164、k167、v168；g6、s23、a55、k72、k75、q94、q110、v128、r134和k167；g6、s23、a55、k72、k75、q94、q110、r134、v146和k167；g6、s23、a55、k72、k75、q94、q110、r134、k167、v168；g6、s23、a55、k72、k75、q94、q110、v128、r134、k167、v168；g6、s23、a55、k72、k75、q94、q110、v128、r134、v146、k167、v168；g6、s23、a55、k72、k75、q94、q110、v128、r134、n164、k167、v168；g6、s23、a55、k72、k75、q94、q110、v128、r134、v146、n164、k167、v168；g6、s23、a55、k72、v128和v168；g6、s23、a55、k75、v128和v168；g6、s23、a55、q94、v128和v168；g6、s23、a55、q110、v128和v168；g6、s23、a55、v128、n164和v168；g6、s23、a55、v128、k167和v168；a55、r134、n164和k167；l5、s23、a55、l96和r134；l5、s23、a55、l96和n164；l5、s23、a55、l96和k167；s23、a55、r134、n164和k167；g6、s23、a55、r134、n164和k167；s23、a55、l96、r134、n164和k167；l5、s23、a55、r134、n164和k167；或l5、s23、a55、l96、r134、n164和k167。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下位置处的替换：a55、r134、n164和k167；s23、a55、r134、n164和k167；l5、s23、a55、l96、r134、n164和k167；a55、v128和v168；s23、a55、v128和v168；g6、s23、a55、v128和v168；g6、s23、a55、v128、v146和v168；s23、a55、k72、k75、q94、q110、r134和k167；g6、s23、a55、k72、k75、q94、q110、r134和k167；s23、a55、k72、k75、q94、l96、q110、r134和k167；s23、a55、k72、k75、q94、q110、r134、n164和k167；s23、a55、k72、k75、r134和k167；或s23、a55、k72、k75、v128、r134、k167和v168。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下位置处的替换：r134和k167；r134和n164；n164和k167；a55和r134；a55和n164；a55和k167；s23和r134；s23和n164；s23和k167；k72和k75；k75和r134；k75和n164；k75和k167；k75和q94；k75和q110；s23和k75；a55和k75；q94和q110；s23和a55；l5和s23；k2和n164；k2和k167；k7和k8；k7和a55；k8和n164；k8和k167；k8和a55；t17和n164；t17和k167；i70和n164；i70和k167；a55和i70；a55和k72；k72和n164；k72和k167；q94和n164；q94和k167；q110和n164；q110和k167；k142和k167；r134、n164和k167；a55、r134和n164；a55、r134和k167；a55、n164和k167；a55、k7和k8；s23、r134和n164；s23、r134和k167；s23、n164和k167；s23、a55和r134；s23、a55和n164；s23、a55和k167；k75、r134和n164；k75、r134和k167；k75、n164和k167；k75、q94和q110；a55、k75和r134；l5、a55和l96；a55、r134、n164和k167；a55、k75、r134和k167；l5、s23、a55和l96；r134、k142、n164和k167；k7、r134、n164和k167；k8、r134、n164和k167；k72、r134、n164和k167；k75、r134、n164和k167；t17、r134、n164和k167；170、r134、n164和k167；q94、r134、n164和k167；q110、r134、n164和k167；q94、q110、r134和n164；s23、a55、r134、n164和k167；q94、q110、r134、n164和k167；q94、q110、r134、k142和k167；q94、q110、k142、n164和k167；k7、k8、r134、n164和k167。s23、a55、l96、r134、n164和k167；k75、094、q110、r134、n164和k167；或k72、k75、q94、q110、r134、n164和k167。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下位置处的替换：r134和k167；r134和n164；n164和k167；q94和q110；k2和n164；k2和k167；k7和k8；k8和n164；k8和k167；t17和n164；t17和k167；i70和n164；i70和k167；k72和n164；k72和k167；k75和r134；k75和n164；k75和k167；k75和q94；k75和q110；q94和n164；q94和k167；q110和n164；q110和k167；k142和k167；r134、n164和k167；k75、q94和q110；k7、r134、n164和k167；k8、r134、n164和k167；t17、r134、n164和k167；r134、k142、n164和k167；i70、r134、n164和k167；k72、r134、n164和k167；q94、r134、n164和k167；q110、r134、n164和k167；q94、q110、r134和n164；q94、q110、r134、n164和k167；q94、q110、r134、k142和k167；q94、q110、k142、n164和k167；k75、q94、q110、r134、n164和k167；k72、k75、q94、q110、r134、n164和k167；或k7、k8、r134、n164和k167。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下位置处的替换：r134、n164和k167；a55、r134和n164；a55、r134和k167；a55、n164和k167；l5、a55和l96；a55、r134、n164和k167；l5、s23、a55和l96；s23、a55、r134、n164和k167；s23、a55、l96、r134、n164和k167；l5、s23、a55、r134、n164和k167；或l5、s23、a55、l96、r134、n164和k167。在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下位置处的替换：l5、a55和l96；a55、r134、n164和k167；s23、a55、r134、n164和k167；或l5、s23、a55、l96、r134、n164和k167。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下位置处的替换：r134和k167；r134和n164；n164和k167；a55和r134；a55和n164；a55和k167；s23和r134；s23和n164；s23和k167；k72和k75；k75和r134；k75和n164；k75和k167；k75和q94；k75和q110；s23和k75；a55和k75；q94和q110；s23和a55；l5和s23；k2和n164；k2和k167；k7和k8；k7和a55；k8和n164；k8和k167；k8和a55；t17和n164；t17和k167；i70和n164；i70和k167；a55和i70；a55和k72；k72和n164；k72和k167；q94和n164；q94和k167；q110和n164；q110和k167；k142和k167；r134、n164和k167；a55、r134和n164；a55、r134和k167；a55、n164和k167；a55、k7和k8；s23、r134和n164；s23、r134和k167；s23、n164和k167；s23、a55和r134；s23、a55和n164；s23、a55和k167；k75、r134和n164；k75、r134和k167；k75、n164和k167；k75、q94和q110；a55、k75和r134；l5、a55和l96；a55、r134、n164和k167；a55、k75、r134和k167；l5、s23、a55和l96；r134、k142、n164和k167；k7、r134、n164和k167；k8、r134、n164和k167；k72、r134、n164和k167；k75、r134、n164和k167；t17、r134、n164和k167；i70、r134、n164和k167；q94、r134、n164和k167；q110、r134、n164和k167；q94、q110、r134和n164；s23、a55、r134、n164和kl67；q94、q110、r134、n164和k167；q94、q110、r134、k142和k167；q94、q110、k142、n164和k167；k7、k8、r134、n164和k167；s23、a55、l96、r134、n164和k167；k75、q94、q110、r134、n164和k167；或k72、k75、q94、q110、r134、n164和k167。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下位置处的替换：r134和k167；r134和n164；n164和k167；q94和q110；k2和n164；k2和k167；k7和k8；k8和n164；k8和k167；t17和n164；t17和k167；i70和n164；i70和k167；k72和n164；k72和k167；k75和r134；k75和n164；k75和k167；k75和q94；k75和q110；q94和n164；q94和k167；q110和n164；q110和k167；k142和k167；r134、n164和k167；k75、q94和q110；k7、r134、n164和k167；k8、r134、n164和k167；t17、r134、n164和k167；r134、k142、n164和k167；i70、r134、n164和k167；k72、r134、n164和k167；q94、r134、n164和k167；q110、r134、n164和k167；q94、q110、r134和n164；q94、q110、r134、n164和k167；q94、q110、r134、k142和k167；q94、q110、k142、n164和k167；k75、q94、q110、r134、n164和k167；k72、k75、q94、q110、r134、n164和k167；或k7、k8、r134、n164和k167。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下位置处的替换：r134、n164和k167；a55、r134和n164；a55、r134和k167；a55、n164和k167；l5、a55和l96；a55、r134、n164和k167；l5、s23、a55和l96；s23、a55、r134、n164和k167；s23、a55、l96、r134、n164和k167；l5、s23、a55、r134、n164和k167；或l5、s23、a55、l96、r134、n164和k167。在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下位置处的替换：l5、a55和l96；a55、r134、n164和k167；s23、a55、r134、n164和k167；或l5、s23、a55、l96、r134、n164和k167。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含不带电荷氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中的碱性氨基酸；酸性氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中的碱性氨基酸；或者酸性氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中不带电荷氨基酸的至少一个替换。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含比所替代氨基酸体积更大的疏水性氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中甘氨酸或疏水性氨基酸的至少一个替换。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含非人灵长类cd4d1d2中对应位置的氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中氨基酸的至少一个替换。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含猿、旧世界猴或新世界猴cd4d1d2中对应位置的氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中氨基酸的至少一个替换。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含猿或旧世界猴cd4d1d2中对应位置的氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中氨基酸的至少一个替换。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含猿cd4d1d2中对应位置的氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中氨基酸的至少一个替换。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含旧世界猴cd4d1d2中对应位置的氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中氨基酸的至少一个替换。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下中的至少一个：n(k1n)对k1的替换；e(k2e)、n(k2n)或t(k2t)对k2的替换；y(l5y)、i(l5i)、e(l5e)、w(l5w)、v(l5v)、f(l5f)或t(l5t)对l5的替换；e(k7e)对k7的替换；e(k8e)对k8的替换；n(t15n)或e(t15e)对t15的替换；n(t17n)或e(t17e)对t17的替换；n(s23n)、t(s23t)、k(s23k)、y(s23y)或a(s23a)对s23的替换；v(a55v)、i(a55i)、p(a55p)、l(a55l)、m(a55m)、f(a55f)、y(a55y)、w(a55w)或t(a55t)对a55的替换；e(i70e)、l(i70l)或v(i70v)对i70的替换；s(k72s)对k72的替换；e(k75e)或q(k75q)对k75的替换；e(q94e)对q94的替换；v(l96v)、q(l96q)、t(l96t)、i(l96i)或y(l96y)对l96的替换；e(q110e)或h(q110h)对q110的替换；f(l116f)或w(l116w)对l116的替换；i(v128i)或l(v128l)对v128的替换；g(r134g)或t(r134t)对r134的替换；r(k142r)、g(k142g)或s(k142s)对k142的替换；i(v146i)、l(v146l)、f(v146f)或w(v146w)对v146的替换；d(n164d)、h(n164h)、r(n164r)或e(n164e)对n164的替换；t(k167t)、r(k167r)或l(k167l)对k167的替换；i(v168i)或l(v168l)对v168的替换；以及i(v176i)对v176的替换。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下替换中的至少一个：k2e、k7e、k8e、t17n、t17e、a55v、i70e、k72s、k75e、q94e、q110e、r134g、k142r、n164d和k167t替换。例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下替换：k2e和n164d；k2e和k167t；k7e和k8e；k8e和n164d；k8e和k167t；t17n和n164d；t17n和k167t；t17e和n164d；t17n和k167t；i70e和n164d；i70e和k167t；k72s和n164d；k72s和k167t；q94e和q110e；q94e和n164d；q94e和k167t；q110e和n164d；q110e和k167t；r134g和n164d；r134g和k167t；k142r和k167t；n164d和k167t；r134g、n164d和k167t；k2e、r134g、n164d和k167t；k8e、r134g、n164d和k167t；t17n、r134g、n164d和k167t；t17e、r134g、n164d和k167t；a55v、r134g、n164d和k167t；i70e、r134g、n164d和k167t；k72s、r134g、n164d和k167t；k75e、q94e和q110e；或k72s、k75e、q94e、q110e、r134g、n164d和k167t。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下替换中的至少一个：l5y、k8e、s23n、a55v、k75e、q94e、l96v、q110e、r134g、n164d和k167t替换；以下替换中的至少一个：l5y、s23n、a55v、l96v、r134g、n164d和k167t替换；以下替换中的至少一个：s23n、a55v、r134g、n164d和k167t替换；或者以下替换中的至少一个：a55v、r134g、n164d和k167t替换。例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下替换：a55v；l5y、a55v和l96v；a55v、r134g、n164d和k167t；s23n、a55v、r134g、n164d和k167t；l5y、a55v、l96v、r134g、n164d和k167t；或l5y、s23n、a55v、l96v、r134g、n164d和k167t。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下替换中的至少一个：g6a、s23n、a55v、k72s、k75e、k75q、q94e、q110e、v128l、r134g、v146i、n164d、k167t和v168l替换。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下替换中的至少一个：k72s、k75e、k75q、q94e、q110e、v128l、r134g、v146i、n164d、k167t和v168l替换。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下替换中的至少一个：k72s、k75e、k75q、q94e、q110e、r134g、n164d和k167t替换。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下替换中的至少一个：l116f、v128l、v146i和v168l替换。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下替换：a55v和k72s；a55v和k75e；a55v和k75q；a55v和q94e；a55v和q110e；a55v和l116f；a55v和v128l；a55v和r134g；a55v和v146i；a55v和n164d；a55v和k167t；a55v和v168l；s23n和k72s；s23n和k75e；s23n和k75q；s23n和q94e；s23n和q110e；s23n和l116f；s23n和v128i；s23n和r134g；s23n和v146i；s23n和n164d；s23n和k167t；s23n和v168l；g6a和k72s；g6a和k75e；g6a和k75q；g6a和q94e；g6a和q110e；g6a和l116f；g6a和v128l；g6a和r134g；g6a和v146i；g6a和n164d；g6a和k167t；g6a和v168l；k72s和k75e；k72s和k75q；k72s和q94e；k72s和q110e；k72s和l116f；k72s和v128l；k72s和r134g；k72s和v146i；k72s和n164d；k72s和k167t；k72s和v168l；k75e和q94e；k75e和q110e；k75e和l116f；k75e和v128l；k75e和r134g；k75e和v146i；k75e和n164d；k75e和k167t；k75e和v168l；k75q和q94e；k75q和q110e；k75q和l116f；k75q和v128l；k75q和r134g；k75q和v146i；k75q和n164d；k75q和k167t；k75q和v168l；q94e和q110e；q94e和l116f；q94e和v128l；q94e和r134g；q94e和v146i；q94e和n164d；q94e和k167t；q94e和v168l；q110e和l116f；q110e和v128l；q110e和r134g；q110e和v146i；q110e和n164d；q110e和k167t；q110e和v168l；l116f和v128l；l116f和r134g；l116f和v146i；l116f和n164d；l116f和k167t；l116f和v168l；v128l和r134g；v128l和v146i；v128l和n164d；v128l和k167t；v128l和v168l；v146i和n164d；v146i和k167t；v146i和v168l；或n164d和k167t。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含a55v替换。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含s23n替换。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含l5y、a55v和l96v替换。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含a55v、r134g、n164d和k167t替换。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含s23n、a55v、r134g、n164d和k167t替换。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含l5y、a55v、l96v、r134g、n164d和k167t替换。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含l5y、s23n、a55v、l96v、r134g、n164d和k167t替换。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含q40a替换。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下的氨基酸序列：seqidno：8、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22、seqidno：24、seqidno：26、seqidno：28、seqidno：30、seqidno：32、seqidno：36、seqidno：38、seqidno：40、seqidno：42或seqidno：44，或者与以下具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列：seqidno：8、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22、seqidno：24、seqidno：26、seqidno：28、seqidno：30、seqidno：32、seqidno：36、seqidno：38、seqidno：40、seqidno：42或seqidno：44。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含含有seqidno：46的氨基酸序列的前导序列，其由seqidno：47的核苷酸序列编码。在某些实施方案中，该前导序列与seqidno：46具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白不包含野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中接触gp120的氨基酸残基的替换。例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白不包含对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置处的替换：n32、k35、l44、k46或r59。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白不包含在野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中形成盐桥的氨基酸残基的替换。例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白不包含对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置处的替换：k1、k2、k50、d56、r58、r59、k72、e77、e91、r131、d153、k167、e169或k171。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白不包含对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的f98的位置处的替换，例如cd4d1d2突变蛋白不包含缬氨酸(f98v)对f98的替换。在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白不包含对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的i76的位置处的替换，例如cd4d1d2突变蛋白不包含脯氨酸(i76p)对i76的替换。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含使蛋白质的聚集温度提高的至少一个氨基酸替换，例如一个或更多个本文中所述的替换，所述聚集温度如通过动态光散射(dls)测量的。在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含使用于cd4⁺ccr5⁺细胞系的hiv感染的所述蛋白质的ic50降低的至少一个氨基酸替换，例如，一个或更多个本文中所述的替换。

在某些实施方案中，蛋白质具有至少60℃的聚集温度，所述聚集温度如通过动态光散射(dls)测量的，或比包含野生型人cd4d1d2的对应蛋白质的聚集温度高至少7℃的聚集温度，所述聚集温度如通过动态光散射(dls)测量的。在某些实施方案中，所述蛋白质的血浆半衰期为至少12小时、24小时、1天、1.5天、2天、2.5天、3天、3.5天、4天、4.5天、5天、5.5天、6天、6.5天、7天、7.5天、8天、8.5天、9天、9.5天或10天。在某些实施方案中，所述蛋白质的血浆半衰期为至少12小时。在某些实施方案中，所述蛋白质的血浆半衰期为至少3天。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含使所述蛋白质的解链温度提高的至少一个氨基酸替换，所述解链温度如通过染料嵌入测定测量的。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含使所表达的cd4d1d2突变蛋白的量提高的至少一个氨基酸替换。

在某些实施方案中，所述蛋白质还包含灵长类慢病毒包膜糖蛋白结合部分。所述结合部分可例如包含至少一个硫代酪氨酸(sulfotyrosine)，和/或包含seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6、或seqidno：7的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述蛋白质还包含免疫球蛋白fc结构域。在某些实施方案中，fc结构域是人igg1或igg2fc结构域，例如igg1fc结构域。在某些实施方案中，fc结构域包含c220处的替换或缺失。在某些实施方案中，fc结构域包含以下替换中的至少一个：m252y、s254t、t256e、m428l、h433k、n434s和n434f替换。例如，fc结构域可包含m252y、s254t和t256e替换，或m428l和n434s替换。

在某些实施方案中，所述蛋白质与天然存在的野生型非人灵长类蛋白质不相同。在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白与野生型非人灵长类蛋白质的对应部分不相同。

在某些实施方案中，所述蛋白质不包含cd4结构域3(d3)和/或结构域4(d4)区域，例如人cd4d3和/或d4区域。

在另一个方面中，本发明提供了包含编码任何前述蛋白质之核苷酸序列的分离的核酸。在另一个方面中，本发明提供了包含任何前述核酸的表达载体。在某些实施方案中，表达载体是病毒载体，例如腺相关病毒(adeno-associatedvirus，aav)载体。在另一个方面中，本发明提供了包含任何前述表达载体的宿主细胞。在另一个方面中，本发明提供了包含任何前述蛋白质或任何前述表达载体的药物组合物。

在另一个方面中，本发明提供了在有此需要的对象中治疗hiv感染的方法。该方法包括向对象施用有效量的任何前述蛋白质、任何前述表达载体或任何前述药物组合物。

本发明的这些以及其他方面和特征描述于以下详细描述和所附权利要求书中。

附图简述

参考以下附图可更完全地理解本发明。

图1示出了具有野生型人cd4d1d2或野生型恒河猴(rhesus)cd4d1d2的ecd4-ig蛋白的热扫描测定结果。示出了具有野生型人cd4d1d2的ecd4-igg1或具有野生型恒河猴(rhesusmacaque)cd4d1d2的ecd4-igg1的颗粒半径根据温度变化的图示于图1a中。示出了具有野生型人cd4d1d2的ecd4-igg2或具有恒河猴cd4d1d2的ecd4-igg2的半径根据温度变化的图示于图1b中。通过动态光散射(dls)测量聚集，其中递增的颗粒半径(以纳米(nm)表示)指示蛋白质聚集。基于野生型人cd4d1d2的ecd4-ig蛋白的50％聚集温度为51℃(igg1)和53℃(igg2)。基于野生型恒河猴cd4d1d2的ecd4-ig的聚集温度为62℃(igg1)和67℃(igg2)。

图2是示出了具有或不具有ccr5模拟硫肽(sulfopeptide)“mim2”的cd4-ig蛋白的聚集温度的图。受试的每种蛋白质均具有与人igg1fc融合的野生型人cd4d1d2，并且除存在或不存在硫肽之外均相同。

图3是示出了灵长类cd4d1d2氨基酸序列的相关性的系统树。将人cd4d1d2序列与另一些猿的cd4d1d2序列归在一起。与其进化关系一致，原猴(prosimian)、新世界猴和旧世界猴的cd4d1d2序列各自形成独特的组。

图4是灵长类cd4d1d2氨基酸序列(seqidno：1和48至90)的序列比对。对猿(分别为seqidno：1和48至54)、旧世界猴(分别为seqidno：55至76)、新世界猴(分别为seqidno：77至86)以及原猴cd4d1d2(分别为seqidno：87至90)的氨基酸序列进行比对。与人cd4d1d2(seqidno：1)不相同的位置以粗体指示。该编号对应于人cd4d1d2。因此，在原猴中f43之前的两个氨基酸插入缺失在此处被视为缺失，同时编号跳过该插入缺失。cd4前蛋白上存在的信号肽未示出或未包含在编号中。x指示其中当前没有可用数据的位置。示出了对第1至58位(图4a)、第59至118位(图4b)和第119至178位(图4c)氨基酸的比对。cd4结构域1(d1)对应于第1至98位氨基酸，而cd4结构域2(d2)对应于第99至178位氨基酸。

图5是使cd4结构域2疏水内核稳定的某些突变的经计算机生成的可视表示。为了使cd4的内部更好地可视化，开发了允许对蛋白质数据库(proteindatabank，pdb)结构进行虚拟层析成像分区(virtualtomographicsectioning)和编辑的工具。使用该计算工具来分析用cd4d1和d2的疏水内核内的较大的疏水性氨基酸对甘氨酸或隐蔽疏水性氨基酸的替换。该图示出了两个空间填充突变，其用比所替代疏水性氨基酸体积更大的疏水性氨基酸替代隐蔽疏水性氨基酸。此处示出的是人cd4晶体结构3cd4的2d截面，其中在位置128建模有野生型v128(图5a)或替换v128l(图5b)。注意，v128l替换如何填充由l100、l144、v161和f170界定的疏水袋。此处还示出了同一cd4晶体结构的2d截面，揭示了v168周围的由l5、k7、v161和f170界定的空间(图5c)，以及主要填充该疏水袋的替换v168l(图5d)。碳原子以灰色示出，氧原子以白色示出，而氮原子以黑色示出。

图6是示出了在人与nhpcd4d1d2之间不同的一个或更多个位置处具有替换的ecd4-ig变体的50％聚集温度的一系列图。使用dls热扫描测定，测量具有和不具有所示氨基酸替换的ecd4-ig的聚集温度。“背景”指示其中测试替换的突变背景(即，是否在存在一个或更多个另外的替换的ecd4-ig变体中评价所述替换)。在多于一种突变背景中评价数个替换。将多个替换以列表指示，其中每个替换用反斜线分隔。每个图的x轴指示ecd4-ig变体是否具有所示的替换或在替换位置处的野生型氨基酸残基(“野生型”)。指示了ecd4-ig蛋白(igg1或igg2)中fc结构域的同种型。带有黑色空心或实心符号的黑线指示igg1，而带有灰色空心或实心符号的灰线指示igg2。

图7是示出了具有所示替换组合的ecd4-ig变体的50％聚集温度的一系列图。使用dls热扫描测定，测量具有和不具有所示氨基酸替换的ecd4-ig的聚集温度。“背景”指示其中测试了替换的突变背景(即，是否在存在一个或更多个另外的替换的ecd4-ig变体中评价所述替换)。在多于一种突变背景中评价数个替换。将多个替换以列表指示，其中每个替换用反斜线分隔。每个图的x轴指示ecd4-ig变体是否具有所示的替换或在替换位置处的野生型氨基酸残基(“野生型”)。指示了ecd4-ig蛋白(igg1或igg2)中fc结构域的同种型。黑线和黑色空心或实心符号指示igg1，而灰线和灰色空心或实心符号指示igg2。

图8是示出了具有多于两个替换的所示组合的ecd4-ig变体的50％聚集温度的一系列图。使用dls热扫描测定，测量具有和不具有所示氨基酸替换的ecd4-ig的聚集温度。“背景”指示其中测试了替换的突变背景(即，是否在存在一个或更多个另外的替换的ecd4-ig变体中评价所述替换)。在多于一种突变背景中评价数个替换。将多个替换以列表指示，其中每个替换用反斜线分隔。每个图的x轴指示ecd4-ig变体是否具有所示的替换或在替换位置处的野生型氨基酸残基(“野生型”)。指示了ecd4-ig蛋白(igg1或igg2)中fc结构域的同种型。

图9是示出了具有所示替换的ecd4-ig变体的50％聚集温度的一系列图。使用dls热扫描测定，测量具有和不具有所示氨基酸替换的ecd4-ig的聚集温度。“背景”指示其中测试了替换的突变背景(即，是否在存在一个或更多个另外的替换的ecd4-ig变体中评价所述替换)。将多个替换以列表指示，其中每个替换用反斜线分隔。每个图的x轴指示ecd4-ig变体是否具有所示的替换或在替换位置处的野生型氨基酸残基(“野生型”)。

图10是示出了具有所示替换组合的ecd4-ig变体的50％聚集温度的一系列图。使用dls热扫描测定，测量具有和不具有所示氨基酸替换的ecd4-ig的聚集温度。“背景”指示其中测试了替换的突变背景(即，是否在存在一个或更多个另外的替换的ecd4-ig变体中评价所述替换)。在多于一种突变背景中评价数个替换。将多个替换以列表指示，其中每个替换用反斜线分隔。每个图的x轴指示ecd4-ig变体是否具有所示的替换或在替换位置处的野生型氨基酸残基(“野生型”)。

图11是示出了具有所示的替换或其组合的ecd4-ig变体的dls热扫描测定的主要数据的线图。y轴示出了通过dls检测的物质的平均半径，同时该测定沿x轴扫描温度(示出了50至75℃)。

图12是示出了具有所示替换组合的如通过dls热扫描测定测量的ecd4-ig变体的50％聚集温度的条形图。聚集温度从最高到最低排序。具有野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的对照蛋白以黑色示出，而具有替换的变体以灰色示出。给出了具有铰链中的c220s替换、igg1fc结构域和作为硫肽的mim2或mim6的ecd4-ig变体的数据。

图13是示出了syproorange染料嵌入测定的结果的条形图。示出了如通过所述测定测量的ecd4-ig变体的50％解链温度。解链温度从最高到最低排序。具有野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的对照蛋白以黑色示出，而具有替换的变体以灰色示出。给出了具有铰链中的c220s替换、igg1fc结构域和作为硫肽的mim2或mim6的ecd4-ig变体的数据。

图14是示出了appliedbiosystemsproteinthermalshift染料嵌入测定的结果的条形图。示出了如通过所述测定测量的ecd4-ig变体的50％解链温度。解链温度从最高到最低排列。具有野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的对照蛋白以黑色示出，而具有替换的变体以灰色示出。“黑猩猩(chimp)”指示具有来自黑猩猩(chimpanzee)cd4的cd4d1d2序列的其他方面相同的ecd4-ig蛋白。给出了具有铰链中的c220s替换、igg1fc结构域和作为硫肽的mim2或mim6的ecd4-ig变体的数据。

图15是示出了包含氨基酸替换组合的cd4突变蛋白的染料嵌入热扫描测定的结果的一系列条形图。在syproorange染料嵌入测定中包含mim6硫肽的ecd4-ig蛋白的50％解链温度示于图15a至c中。在appliedbiosystemsproteinthermalshift测定中缺少硫肽的cd4-ig蛋白的50％解链温度示于图15d中。此处示出的所有变体均具有铰链中的c220s替换。

图16是示出了不同ecd4-ig蛋白的蛋白质表达产量的条形图。该图中示出的所有变体均包含mim6硫肽、铰链中的c220s替换和igg1fc。具有野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的ecd4-ig蛋白以黑色示出，而包含氨基酸替换的所有变体以灰色示出。

图17是示出了不同ecd4-ig蛋白的蛋白质表达产量的一系列条形图。图17a至h的每个图表示单独的蛋白质表达产量实验。两个对照以黑色示出。这两个对照是具有野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的ecd4-ig蛋白和包含替换g6a/s23n/a55v/v128l/v168l的ecd4-ig。所有其他变体以灰色示出。示出的所有变体均包含铰链中的c220s替换和igg1fc。图17a至g中的变体全部均是包含mim6硫肽的ecd4-ig蛋白，而图17h中的变体均是缺少硫肽的cd4-ig蛋白。

图18是示出了野生型cd4-ig或者具有提高构象稳定性之替换的所示的cd4-ig或ecd4-ig变体的人fcrn转基因小鼠中药动学的一系列线图。图18a至c中示出的数据是并行收集的，并且可将其直接进行比较，并且为清楚起见仅分为三个图。图18a示出了包含野生型人cd4d1d2序列或者具有r134/n164/k167或k72/k75/q94/q110/r134/n164/k167位置处突变的cd4d1d2序列的cd4-ig变体(不包含硫肽)的药动学。野生型cd4-ig的半衰期为2.4天，而r134g/n164d/k167tcd4-ig的半衰期为4.2天，而k72s/k75e/q94e/q110e/r134g/n164d/k167tcd4-ig的半衰期为8.6天。图18b示出了包含r134/n164/k167位置处的替换的cd4-ig(不包含硫肽)和ecd4-ig(包含硫肽)蛋白的药动学。图18c示出了具有k72/k75/q94/q110/r134/n164/k167位置处替换的cd4-ig(不包含硫肽)和ecd4-ig(包含硫肽)蛋白以及具有q94/q110/r134/n164/k167位置处替换的ecd4-ig蛋白的药动学。

图19是示出了具有野生型人cd4d1d2(seqidno：1)或者提高构象稳定性或fcrn结合的所示替换的ecd4-ig的人fcrn转基因小鼠中药动学的线图。在两组人fcrn转基因小鼠中使用广泛中和单克隆抗体10-1074作为对照，并且这两个对照组中的每一个均以单独的线示出。除野生型人cd4d1d2对照之外，在该药动学实验中评价的ecd4-ig变体包含以下氨基酸替换组合：k72s/k75e/r134g/n164d/k167t、k72s/k75e/q94e/q110e/r134g/n164d/k167t、s23n/k72s/k75e/r134g/n164d/k167t和s23n/a55v/k72s/k75e/q94e/l96v/q110e/r134g/n164d/k167t。另外，在包含s254t和t256e(“yte”)或m428l和n434s(“ls”)的igg1fc的情况下评价在cd4d1d2中具有替换s23n/a55v/k72s/k75e/q94e/l96v/q110e/r134g/n164d/k167t的ecd4-ig变体。

图20示出了评价包含替换g6a/s23n/a55v/v128l/v168l的ecd4-ig变体的野生型balb/cj小鼠中的药动学实验。将包含g6a/s23n/a55v/v128l/v168l的ecd4-ig变体的药动学针对包含s23n/a55v/k72s/k75e/q94e/l96v/q110e/r134g/n164d/k167t的对照进行比较(图20a)。将表面电荷替换r134g、n164d和k167t单独地或组合引入到g6a/s23n/a55v/v128l/v168l背景中。因此，在该药动学实验中受试的另外的变体为g6a/s23n/a55v/v128l/r134g/v168l、g6a/s23n/a55v/v128l/k176t/v168l、和g6a/s23n/a55v/v128l/r134g/n164d/k167t/v168l。对从第1天至第5天的蛋白质浓度计算出的半衰期进行比较(图20b)。半衰期的唯一显著性差异(p＝0.03，2尾参数t检验)在包含s23n/a55v/k72s/k75e/q94e/l96v/q110e/r134g/n164d/k167t的ecd4-ig变体与包含g6a/s23n/a55v/v128l/r134g/v168l的ecd4-ig变体之间。

图21是示出了野生型cd4-ig和具有提高构象稳定性之替换的ecd4-ig变体的大鼠中药动学的线图。将野生型人cd4-ig、r134g/n164d/k167tecd4-igg1和r134g/n164d/k167tecd4-igg2以10mg/kg皮下施用于大鼠。计算出野生型人cd4-ig的半衰期为11小时，而计算出r134g/n164d/k167tecd4-igg1和ecd4-igg2的半衰期分别为48和42小时。

图22示出了通过具有和不具有a55v替换的ecd4-ig变体进行的病毒中和。在感染后表达萤火虫萤光素酶的cd4⁺ccr5⁺tzm-bl细胞中测量通过具有和不具有a55v替换的ecd4-ig变体进行的病毒中和。在连续5倍稀释度上滴定具有野生型人a55残基或a55v替换的r134g/n164d/k167tecd4-ig变体。对具有和不具有a55v替换的ecd4-ig变体中和由bg505(图22a)、pvo.4(图22b)和9014(图22c)假病毒引起的感染的能力进行比较。相对于在不存在任何ecd4-ig的情况下表达的萤光素酶的量，百分比病毒感染以百分比相对光单位(relativelightunit，％rlu)表示。虚线指示50％病毒感染。

图23示出了通过具有和不具有s23n替换的ecd4-ig变体进行的病毒中和。在感染后表达萤火虫萤光素酶的cd4⁺ccr5⁺tzm-b1细胞中测量通过具有和不具有s23n替换的ecd4-ig变体进行的病毒中和。在连续5倍稀释度上滴定具有野生型人s23残基或s23n替换的l5y/a55v/i76p/l96v/r134g/n164d/k167tecd4-ig变体。对具有和不具有s23n替换的ecd4-ig变体中和由bg505(图23a)和pvo.4(图23b)假病毒引起的感染的能力进行比较。相对于在不存在任何ecd4-ig的情况下表达的萤光素酶的量，百分比病毒感染以百分比相对光单位(％rlu)表示。虚线指示50％病毒感染。

图24是示出了通过所示ecd4-ig变体进行病毒中和的散点图。针对受试病毒组进行病毒中和测定，所述病毒包括398f1、bg505、246f3、tro.11、x2278、9014、pvo.4、t257-10、ce0217、zm651、cne8、cne55、bjox2000、ch119、x1634和89.6。靶细胞是在感染后表达萤火虫萤光素酶的cd4⁺ccr5⁺tzm-bl细胞。相对于在不存在任何ecd4-ig的情况下表达的萤光素酶的量，百分比病毒感染以百分比相对光单位(％rlu)表示。虚线指示50％病毒感染。在r134g/n164d/k167t背景的情况下，替换s23n/a55v/l96v的存在导致抑制50％的hiv感染所需的ecd4-ig的浓度显著降低(p＜0.0001，威尔科克森匹配对检验(wilcoxonmatchedpairstest))。

图25示出了通过ecd4-ig变体进行的病毒中和，所述变体包含被比所替代氨基酸体积更大的疏水性氨基酸替换的甘氨酸或隐蔽疏水性氨基酸。受试的ecd4-ig变体包含野生型人cd4d1d2(seqidno：1)对照(灰色)、a55v、g6a/a55v、g6a/s23n/a55v/v128l/v168l、g6a/s23t/a55v/v128l/v168l、和g6a/s23n/q40a/a55v/v128l/v168l。受试病毒是由初始传播(transmitted/founder，t/f)病毒prb931-06的包膜糖蛋白产生的假病毒。靶细胞是在感染后表达萤火虫萤光素酶的cd4⁺ccr5⁺tzm-bl细胞。相对于在不存在任何ecd4-ig的情况下表达的萤光素酶的量，百分比病毒感染以百分比相对光单位(％rlu)表示。虚线指示50％病毒感染。

图26是示出了ecd4-ig变体的恒河猴中药动学的一系列线图。在恒河猴中评价的ecd4-ig变体均具有替换r134g/n164d/k167t。在指示的情况下，ecd4-ig变体具有免疫球蛋白fc结构域中的“ls”替换(m428l和n434s)。每只恒河猴中每个ecd4-ig变体的半衰期均指示在恒河猴的编号旁边(例如，动物编号r13007，半衰期＝2.8天)。三只恒河猴组成的组接受以下的静脉内输注：30mg/kg的r134g/n164d/k167tecd4-igg1(图26a)、30mg/kg的r134g/n164d/k167tecd4-igg2(图26b)、30mg/kg的r134g/n164d/k167tecd4-igg1ls(图26c)、30mg/kg的r134g/n164d/k167tecd4-igg2ls(图26d)、10mg/kg的r134g/n164d/k167tecd4-igg1ls(图26e)、10mg/kg的r134g/n164d/k167tecd4-igg2ls(图26f)、和1mg/kg的r134g/n164d/k167tecd4-igg1ls(图26g)。半衰期从前10天的数据计算得出，在可能出现抗药物抗体之前。黑色符号指示接受igg1的动物中血浆ecd4-ig浓度，而灰色符号指示接受igg2的动物中血浆ecd4-ig浓度。

图27是示出了通过ecd4-ig变体抑制恒河猴中病毒复制的线图。感染有shiv-ad8的恒河猴以30mg/kg施用r134g/n164d/k167tecd4-ig的igg1或igg2形式。此后在多个时间点，测量血浆病毒载量(病毒rna拷贝/ml)。黑色符号指示接受igg1的动物中的病毒载量，而灰色符号指示接受igg2的动物中的病毒载量。

发明详述

本发明部分地基于对包含人cd4结构域1和cd4结构域2二者(cd4d1d2)的蛋白质具有比包含天然存在的人cd4d1d2的蛋白质更高的稳定性和/或活性的发现。在某些实施方案中，与包含天然存在的人cd4d1d2的蛋白质相比，所述蛋白质表现出更高的产量；更高的聚集温度(例如，如在热扫描测定中通过动态光散射(dls)测量的)；更高的解链温度(例如，如通过染料嵌入测定测量的)；和/或更长的血浆半衰期。此外，预期本文中所述的蛋白质可适合于在人对象中治疗hiv。

下文更详细地讨论本发明的多个特征和方面。

i.蛋白质

在一个方面中，本发明提供了包含人cd4d1d2突变蛋白的蛋白质，其中所述cd4d1d2突变蛋白与野生型人cd4d1d2(seqidno：1)具有至少90％同一性，并且包含对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置处的至少一个替换：k1、k2、v4、l5、g6、k7、k8、d10、t11、v12、l14、t15、t17、a18、s19、q20、k21、k22、s23、i24、q25、h27、n30、n32、i34、k35、i36、l37、n39、g41、s42、l44、k46、p48、k50、l51、n52、d53、a55、d56、r58、r59、s60、l61、q64、g65、n66、f67、p68、l69、i70、i71、k72、k73、l74、k75、i76、e77、d80、t81、v86、e87、d88、q89、e91、v93、q94、l95、l96、v97、f98、g99、t101、a102、n103、s104、d105、h107、l108、q110、s113、l114、l116、t117、l118、s120、p121、p122、g123、s124、s125、v128、q129、c130、r131、s132、p133、r134、g135、n137、i138、q139、g140、g141、k142、t143、l144、s145、v146、s147、l149、e150、l151、q152、d153、g155、t156、w157、t158、t160、v161、l162、q163、n164、q165、k166、k167、v168、e169、f170、k171、1172、d173、i174、v175、v176或a178。本文中使用的术语“突变蛋白”是指具有与野生型氨基酸序列不同的氨基酸序列的蛋白质。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含非人灵长类cd4d1d2中对应位置的氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中氨基酸的至少一个替换。例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含例如非人灵长类cd4d1d2中对应位置的氨基酸对对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置处的至少一个替换：k1、k2、v4、g6、k7、d10、t11、v12、t15、t17、a18、s19、q20、k21、k22、s23、i24、q25、h27、n30、n32、i34、k35、n39、g41、s42、l44、k46、p48、k50、l51、n52、d53、a55、d56、r58、r59、s60、l61、q64、g65、n66、p68、l69、i70、k72、k73、l74、k75、i76、e77、d80、t81、e87、d88、q89、e91、q94、l96、g99、t101、a102、n103、s104、d105、h107、l108、q110、s113、t117、s120、p122、g123、s124、s125、v128、q129、c130、r131、s132、r134、g135、n137、i138、q139、g140、g141、k142、t143、l144、s145、v146、s147、e150、l151、q152、d153、t156、w157、t158、t160、v161、l162、q163、n164、q165、k166、k167、v168、e169、f170、k171、i172、d173、1174、v175或a178。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含猿、旧世界猴或新世界猴cd4d1d2中对应位置的氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中氨基酸的至少一个替换。例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含例如猿、旧世界猴或新世界猴cd4d1d2中对应位置的氨基酸对对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置处的至少一个替换：k1、k2、k7、d10、t11、t15、t17、a18、s19、q20、k21、k22、s23、i24、q25、h27、n30、n32、i34、n39、g41、s42、l44、k46、p48、n52、d53、a55、r59、l61、q64、g65、n66、p68、l69、i70、k72、k73、l74、k75、i76、d80、e87、d88、q89、q94、l96、a102、n103、s104、q110、s113、t117、s120、s124、q129、r131、r134、n137、q139、g140、g141、k142、t143、l144、s145、v146、s147、e150、l151、q152、t156、w157、t158、t160、v161、l162、n164、q165、k166、k167、v168、k171、d173、i174或v175。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含猿或旧世界猴cd4d1d2中对应位置的氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中氨基酸的至少一个替换。例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含例如猿或旧世界猴cd4d1d2中对应位置的氨基酸对对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置处的至少一个替换：k2、d10、t15、t17、s19、q20、k21、k22、s23、i24、q25、n30、n32、i34、n39、p48、n52、d53、a55、r59、g65、n66、p68、l69、d80、e87、d88、q89、q94、q110、t117、s120、s124、q129、r134、g140、k142、l144、s147、l151、t156、w157、t160、v161、l162、n164、k166或k167。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含猿cd4d1d2中对应位置的氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中氨基酸的至少一个替换。例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含例如猿cd4d1d2中对应位置的氨基酸对对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置处的至少一个替换：k1、t15、t17、q20、i34、n52、d53、a55、r59、g65、p68、e87、d88、t117、s120、r134、g140、s147、w157、t160、n164或k166。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含旧世界猴cd4d1d2中对应位置的氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中氨基酸的至少一个替换。例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含例如旧世界猴cd4d1d2中对应位置的氨基酸对对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置处的至少一个替换：k2、d10、t15、t17、s19、q20、k21、k22、s23、i24、q25、n30、n32、i34、n39、p48、n52、a55、r59、n66、p68、l69、d80、d88、q89、q94、q110、s124、q129、r134、g140、k142、l144、s147、l151、t156、t160、v161、l162、n164、k166或k167。

包括猿、旧世界猴、新世界猴和原猴的示例性非人灵长类(non-humanprimate，nhp)连同野生型人cd4d1d2(seqidno：1)氨基酸序列与示例性nhpcd4d1d2氨基酸序列之间的序列比对列于图4中。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含比所替代氨基酸的体积(例如，侧链体积)更大的疏水性氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中甘氨酸或疏水性氨基酸的至少一个替换。疏水性氨基酸可以是例如隐蔽疏水性氨基酸。本文中使用的氨基酸a、v、p、l、i、m、f、y和w被认为是疏水性氨基酸，甘氨酸与疏水性氨基酸的相对体积如下：g＜a＜v＜p＜l＝i＜m＜f＜y＜w。例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含例如比所替代氨基酸的体积更大的疏水性氨基酸对对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中的以下的位置的氨基酸的至少一个替换：l5、g6、v12、l14、a18、i24、i36、l37、l44、l51、a55、g65、f67、p68、l69、v93、g99、i71、l74、v86、v93、l95、l96、v97、f98、a102、l108、l114、l116、l118、p121、v128、p133、i138、g141、l144、v146、l149、g155、v161、v168、f170、i172、i174或v176。在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含例如比所替代氨基酸体积更大的疏水性氨基酸对对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中的以下的位置的氨基酸的至少一个替换：g6、i24、l44、l51、a55、l69、g99、a102、v128、g141、v146、v161和v168。在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含一个或更多个表1中确定的氨基酸替换。

表1

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含比所替代氨基酸的体积(例如，侧链体积)更大，并且还位于非人灵长类cd4d1d2中的对应位置的疏水性氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中甘氨酸或疏水性氨基酸的至少一个替换。例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下中的至少一个：a(g6a)对g6的替换；m(i24m)对124的替换；w(l44w)对l44的替换；m(l51m)对l51的替换；v(a55v)或i(a55i)对a55的替换；m(l69m)对l69的替换；a(g99a)对g99的替换；v(a102v)对a102的替换；l(v128l)对v128的替换；v(g141v)或m(g141m)对g141的替换；i(v146i)或m(v146m)对v146的替换；i(v161i)或l(v161l)对v161的替换；以及l(v168l)对v168的替换。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含导致蛋白质的净正电荷降低的至少一个替换。例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含不带电荷氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中碱性氨基酸的至少一个替换或者酸性氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中碱性氨基酸的至少一个替换。在某些实施方案中，不带电荷氨基酸是不带电荷的极性氨基酸(g、s、t、n、q和h)，a或y。

本文中使用的氨基酸g、a、s、t、n、q、h、y、l、i、v、m、f、w、p和c被认为是不带电荷氨基酸，氨基酸g、s、t、n、q和h被认为是不带电荷的极性氨基酸，氨基酸d和e和被认为是酸性氨基酸，而氨基酸k和r被认为是碱性氨基酸。

例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含例如g、a、s、t、n、q、h或y对对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置的氨基酸的至少一个替换：k1、k2、k7、k21、k22、k35、k46、k50、r58、r59、k72、k75、r131、r134、k142、k166、k167或k171。在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含表2中确定的一个或更多个氨基酸替换。在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含酸性氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中碱性氨基酸的表3中确定的一个或更多个替换。

表2

表3

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含也位于非人灵长类cd4d1d2中对应位置的不带电荷或酸性的氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中碱性氨基酸的至少一个替换。例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下中的至少一个：n(k1n)对k1的替换；n(k2n)、t(k2t)或e(k2e)对k2的替换；e(k7e)对k7的替换；n(k21n)对k21的替换；t(k22t)对k22的替换；t(k46t)对k46的替换；q(r59q)对r59的替换；q(k75q)或e(k75e)对k75的替换；t(r131t)或q(r131q)对r131的替换；t(r134t)或g(r134g)对r134的替换；g(k142g)或s(k142s)对k142的替换；n(k166n)、q(k166q)、h(k166h)或e(k166e)对k166的替换；t(k167t)对k167的替换；以及q(k171q)、s(k171s)、n(k171n)或e(k171e)对k171的替换。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含酸性氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中不带电荷氨基酸的至少一个替换。例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含例如d或e对对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置的氨基酸的至少一个替换：v4、t11、t15、t17、s19、q20、s23、q25、h27、n30、n32、i34、s42、p48、n52、s60、l61、q64、n66、i70、i76、t81、q89、q94、t101、n103、s104、h107、q110、s113、t117、s120、p122、g123、s124、s125、q129、g135、n137、q139、g140、t143、s145、s147、l151、q152、t156、t158、t160、l162、q163、n164、q165、v175或a178。在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含表4中确定的一个或更多个氨基酸替换。

表4

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含也位于非人灵长类cd4d1d2中对应位置的酸性氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中不带电荷氨基酸的至少一个替换。例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下中的至少一个：e(t17e)对t17的替换；d(n32d)对n32的替换；e(q94e)对q94的替换；e(q110e)对q110的替换；d(g123d)对g123的替换；e(q129e)对q129的替换；以及d(n164d)对n164的替换。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含cd4d1结构域(对应于seqidno：1的第1至98位氨基酸残基)中的至少一个替换，例如，一个或更多个本文中所述的替换，以及cd4d2结构域(对应于seqidno：1的第99至178位氨基酸残基)中的至少一个替换，例如，一个或更多个本文中所述的替换。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个替换。在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白与野生型人cd4d1d2(seqidno：1)具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白在野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中具有表面暴露侧链的氨基酸位置处包含少于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个替换。

序列同一性可以以本领域技术范围内的多种方式，例如，使用公开可获得的计算机软件，例如blast、blast-2、align或megalign(dnastar)软件来确定。定制使用程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx所利用的算法的blast(basiclocalalignmentsearchtool，基本局部比对搜索工具)分析(karlinetal，(1990)proc.natl.acad.sci.usa87：2264-2268；altschul，(1993)j.mol.evol.36，290-300；altschuletal，(1997)nucleicacidsres.25：3389-3402，通过引用并入)用于序列相似性检索。对于检索序列数据库中基本问题的讨论，参见altschuletal.，(1994)naturegenetics6：119-129，其通过引用完全并入。本领域技术人员可确定用于测量比对的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。直方图、描述、比对、期望(即，用于报道针对数据库序列的匹配的统计显著性阈值)、截止值、矩阵和过滤程序(filter)的检索参数处于默认设置。blastp、blastx、tblastn和tblastx使用的默认评分矩阵是blosum62矩阵(henikoffetal，(1992)proc.natl.acad.sci.usa89：10915-10919，通过引用完全并入)。4个blastn参数可如下调整：q＝10(空位产生罚分(gapcreationpenalty))；r＝10(空位延伸罚分(gapextensionpenalty))；wink＝1(在查询中在每个wink.sup.th位置生成词语命中项(hit))；以及gapw＝16(设置在其中生成空位比对的窗口宽度)。等效的blastp参数设置可以为q＝9；r＝2；wink＝1；以及gapw＝32。检索也可使用以下进行：ncbi(美国国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation))blast高级选项参数(例如：-g，开放空位罚分(costtoopengap)[整数]：默认值＝5(对于核苷酸)/11(对于蛋白质)；-e，延伸空位罚分(costtoextendgap)[整数]：默认值＝2(对于核苷酸)/1(对于蛋白质)；-q，核苷酸错配罚分(penaltyfornucleotidemismatch)[整数]：默认值＝-3；-r，核苷酸匹配得分(rewardfornucleotidematch)[整数]：默认值＝1；-e，期望值[实数]：默认值＝10；-w，字号[整数]：默认值＝11(对于核苷酸)/28(对于megablast)/3(对于蛋白质)；-y，以位数表示的blast延伸的下降(x)(dropoff(x)forblastextensionsinbit)：默认值＝20(对于blasm)/7(对于其他)；-x，空位比对的x下降值(xdropoffvalueforgappedalignment)(以位数表示)：默认值＝15(对于所有程序)，不适用于blastn；以及-z，空位比对的最终x下降值(finalxdropoffvalueforgappedalignment)(以位数表示)：50(对于blastn)，25(对于其他))。也可使用用于成对蛋白质比对的clustalw(默认参数可包括，例如blosum62矩阵和空位开放罚分(gapopeningpenalty)＝10以及空位延伸罚分＝0.1)。在gcg包版本10.0中可用的在序列之间的bestfit比较使用dna参数gap＝50(空位产生罚分)和len＝3(空位延伸罚分)，以及蛋白质比较中的等效设置为gap＝8和len＝2。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置处的至少一个替换：k1、k2、l5、g6、k7、k8、t15、t17、k21、k22、s23、a55、i70、k72、k75、q94、l96、g99、a102、q110、r134、k142、n164、k166、k167或k171。在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置处的至少一个替换：l5、k8、s23、a55、k75、q94、l96、q110、r134、n164或k167。例如，cd4d1d2突变蛋白可包含对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置处的至少一个替换：l5、s23、a55、l96、r134、n164或k167；对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置处的至少一个替换：s23、a55、r134、n164或k167，或者对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置处的至少一个替换：a55、r134、n164或k167。在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置处的至少一个替换：k2、k7、k8、t17、i70、k72、q94、q110、r134、k142、n164或k167。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下位置处的替换：r134和k167；r134和n164；n164和k167；a55和r134；a55和n164；a55和k167；s23和r134；s23和n164；s23和k167；k72和k75；k75和r134；k75和n164；k75和k167；k75和q94；k75和q110；s23和k75；a55和k75；q94和q110；s23和a55；l5和s23；k2和n164；k2和k167；k7和k8；k7和a55；k8和n164；k8和k167；k8和a55；t17和n164；t17和k167；i70和n164；i70和k167；a55和i70；a55和k72；k72和n164；k72和k167；q94和n164；q94和k167；q110和n164；q110和k167；k142和k167；r134、n164和k167；a55、r134和n164；a55、r134和k167；a55、n164和k167；a55、k7和k8；s23、r134和n164；s23、r134和k167；s23、n164和k167；s23、a55和r134；s23、a55和n164；s23、a55和k167；k75、r134和n164；k75、r134和k167；k75、n164和k167；k75、q94和q110；a55、k75和r134；l5、a55和l96；a55、r134、n164和k167；a55、k75、r134和k167；l5、s23、a55和l96；r134、k142、n164和k167；k7、r134、n164和k167；k8、r134、n164和k167；k72、r134、n164和k167；k75、r134、n164和k167；t17、r134、n164和k167；170、r134、n164和k167；q94、r134、n164和k167；q110、r134、n164和k167；q94、q110、r134和n164；s23、a55、r134、n164和k167；q94、q110、r134、n164和k167；q94、q110、r134、k142和k167；q94、q110、k142、n164和k167；k7、k8、r134、n164和k167；s23、a55、l96、r134、n164和k167；k75、094、q110、r134、n164和k167；k72、k75、q94、q110、r134、n164和k167；或k2、t17、k21、k72、k75、q94、q110、r134、n164和k167。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下位置处的替换：r134和k167；r134和n164；n164和k167；q94和q110；k2和n164；k2和k167；k7和k8；k8和n164；k8和k167；t17和n164；t17和k167；i70和n164；i70和k167；k72和n164；k72和k167；k75和r134；k75和n164；k75和k167；k75和q94；k75和q110；q94和n164；q94和k167；q110和n164；q110和k167；k142和k167；r134、n164和k167；k75、q94和q110；k7、r134、n164和k167；k8、r134、n164和k167；t17、r134、n164和k167；r134、k142、n164和k167；i70、r134、n164和k167；k72、r134、n164和k167；q94、r134、n164和k167；q110、r134、n164和k167；q94、q110、r134和n164；q94、q110、r134、n164和k167；q94、q110、r134、k142和k167；q94、q110、k142、n164和k167；k75、q94、q110、r134、n164和k167；k72、k75、q94、q110、r134、n164和k167；或k7、k8、r134、n164和k167。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下位置处的替换：r134、n164和k167；a55、r134和n164；a55、r134和k167；a55、n164和k167；l5、a55和l96；a55、r134、n164和k167；l5、s23、a55和l96；s23、a55、r134、n164和k167；s23、a55、l96、r134、n164和k167；l5、s23、a55、r134、n164和k167；或l5、s23、a55、l96、r134、n164和k167。在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下位置处的替换：l5、a55和l96；a55、r134、n164和k167；s23、a55、r134、n164和k167；或l5、s23、a55、l96、r134、n164和k167。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下中的至少一个：n(k1n)对k1的替换；e(k2e)、n(k2n)或t(k2t)对k2的替换；y(l5y)、i(l5i)、e(l5e)、w(l5w)、v(l5v)、f(l5f)或t(l5t)对l5的替换；e(k7e)对k7的替换；e(k8e)对k8的替换；n(t15n)或e(t15e)对t15的替换；n(t17n)或e(t17e)对t17的替换；n(s23n)、t(s23t)、k(s23k)、y(s23y)或a(s23a)对s23的替换；v(a55v)、i(a55i)、p(a55p)、l(a55l)、m(a55m)、f(a55f)、y(a55y)、w(a55w)或t(a55t)对a55的替换；e(i70e)、l(i70l)或v(i70v)对i70的替换；s(k72s)对k72的替换；e(k75e)或q(k75q)对k75的替换；e(q94e)对q94的替换；v(l96v)、q(l96q)、t(l96t)、i(l96i)或y(l96y)对l96的替换；e(q110e)或h(q110h)对q110的替换；g(r134g)或t(r134t)对r134的替换；r(k142r)、g(k142g)或s(k142s)对k142的替换；d(n164d)、h(n164h)、r(n164r)或e(n164e)对n164的替换；以及t(k167t)、r(k167r)或l(k167l)对k167的替换。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下替换中的至少一个：k2e、k7e、k8e、t17n、t17e、a55v、i70e、k72s、k75e、q94e、q110e、r134g、k142r、n164d和k167t替换。例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下替换：k2e和n164d；k2e和k167t；k7e和k8e；k8e和n164d；k8e和k167t；t17n和n164d；t17n和k167t；t17e和n164d；t17n和k167t；i70e和n164d；i70e和k167t；k72s和n164d；k72s和k167t；q94e和q110e；q94e和n164d；q94e和k167t；q110e和n164d；q110e和k167t；r134g和n164d；r134g和k167t；k142r和k167t；n164d和k167t；r134g、n164d和k167t；k2e、r134g、n164d和k167t；k8e、r134g、n164d和k167t；t17n、r134g、n164d和k167t；t17e、r134g、n164d和k167t；a55v、r134g、n164d和k167t；i70e、r134g、n164d和k167t；k72s、r134g、n164d和k167t；k75e、q94e和q110e；或k72s、k75e、q94e、q110e、r134g、n164d和k167t。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下替换中的至少一个：l5y、k8e、s23n、a55v、k75e、q94e、l96v、q110e、r134g、n164d和k167t替换；以下替换中的至少一个：l5y、s23n、a55v、l96v、r134g、n164d和k167t替换；以下替换中的至少一个：s23n、a55v、r134g、n164d和k167t替换，或者以下替换中的至少一个：a55v、r134g、n164d和k167t替换。例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下替换：a55v；l5y、a55v和l96v；a55v、r134g、n164d和k167t；s23n、a55v、r134g、n164d和k167t；l5y、a55v、l96v、r134g、n164d和k167t；或l5y、s23n、a55v、l96v、r134g、n164d和k167t。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含以下的氨基酸序列：seqidno：8、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22、seqidno：24、seqidno：26、seqidno：28、seqidno：30、seqidno：32、seqidno：36、seqidno：38、seqidno：40、seqidno：42、seqidno：44，或者与以下具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列：seqidno：8、seqidno：10、seqidno：12、seqidno：14、seqidno：16、seqidno：18、seqidno：20、seqidno：22、seqidno：24、seqidno：26、seqidno：28、seqidno：30、seqidno：32、seqidno：36、seqidno：38、seqidno：40、seqidno：42或seqidno：44。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含含有seqidno：46的氨基酸序列的前导序列，其由seqidno：47的核苷酸序列编码。在某些实施方案中，所述前导序列与seqidno：46具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白不包含野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中接触gp120的氨基酸残基的替换。例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白不包含对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置处的替换：n32、k35、l44、k46或r59，并且天然存在的氨基酸得以保留。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白不包含在野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中形成盐桥的氨基酸残基的替换。例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白不包含对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的以下的位置处的替换：k1、k2、k50、d56、r58、r59、k72、e77、e91、r131、d153、k167、e169或k171，并且天然存在的氨基酸得以保留。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白不包含对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的f98的位置处的替换，例如cd4d1d2突变蛋白不包含缬氨酸(f98v)对f98的替换。在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白不包含对应于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的i76的位置处的替换，例如cd4d1d2突变蛋白不包含脯氨酸(i76p)对i76的替换。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含使蛋白质的聚集温度提高的至少一个氨基酸替换，例如一个或更多个本文中所述的替换。在某些实施方案中，所述蛋白质的聚集温度为至少60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃。在某些实施方案中，所述蛋白质的聚集温度比包含野生型人cd4d1d2的对应蛋白质的聚集温度高至少7℃、8℃、9℃、10℃、11℃或12℃。聚集温度可通过本领域已知的任何方法，包括通过如本文中实施例1和2中所述的热扫描测定中的动态光散射(dls)来测量。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含使所述蛋白质的解链温度提高的至少一个氨基酸替换，例如，一个或更多个本文中所述的替换。在某些实施方案中，所述蛋白质的解链温度为至少50.3℃、51℃、52℃、53℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃。在某些实施方案中，所述蛋白质的解链温度比包含野生型人cd4d1d2的对应蛋白质的解链温度高至少0.1℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或16℃。解链温度可通过本领域已知的任何方法，包括如本文中实施例3中所述的使用例如染料嵌入通过热扫描测定来测量。在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含使cd4d1d2突变蛋白的产量提高的至少一个氨基酸替换，例如，一个或更多个本文中所述的替换。在某些实施方案中，所述蛋白质以为包含野生型人cd4d1d2的对应蛋白质的产量的以下倍的产量产生：约1.1至5倍、约1.5至5倍、约2至5倍、约3至5倍、约4至5倍、约1.1至4倍、约1.5至4倍、约2至4倍、约4至4倍、约1.1至3倍、约1.5至3倍、约2至3倍、约1.1至2倍、约1.5至2倍、或约1.1至1.5倍。在某些实施方案中，所述蛋白质以为高于包含野生型人cd4d1d2的对应蛋白质的产量的以下的产量产生：至少约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约150％、约200％、约250％、约300％、约350％、约400％、约450％。

在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含使cd4d1d2突变蛋白对病毒例如hiv的中和提高的至少一个氨基酸替换，例如，一个或更多个本文中所述的替换。例如，在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白包含使用于cd4⁺ccr5⁺细胞的hiv感染的所述蛋白质的ic50降低的至少一个氨基酸替换。病毒中和可通过本领域已知的任何方法，包括通过如本文中实施例5中所述的孵育包含cd4d1d2突变蛋白的蛋白质与病毒以及在病毒感染后表达萤火虫萤光素酶的cd4⁺ccr5⁺tzm-bl细胞来测量。

在某些实施方案中，所述蛋白质例如在小鼠(例如，人fcrn转基因小鼠)、大鼠、恒河猴、或人的血浆中的血浆半衰期为至少12小时、24小时、1天、1.5天、2天、2.5天、3天、3.5天、4天、4.5天、5天、5.5天、6天、6.5天、7天、7.5天、8天、8.5天、9天、9.5天或10天。例如，在某些实施方案中，所述蛋白质在大鼠中的血浆半衰期为至少12小时。在某些实施方案中，所述蛋白质在人fcrn转基因小鼠中的血浆半衰期为至少3天。

在某些实施方案中，包含cd4d1d2突变蛋白的蛋白质还包含灵长类慢病毒包膜糖蛋白结合部分。所述结合部分可例如包含ccr5(hiv的共受体(co-receptor))的肽模拟物。在某些实施方案中，所述结合部分包含至少一个硫代酪氨酸。在某些实施方案中，所述结合部分包含seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6或seqidno：7的氨基酸序列。在某些实施方案中，seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6或seqidno：7中的任一个的酪氨酸残基被硫酸化。

作为替代或另外地，在某些实施方案中，包含cd4d1d2突变蛋白的蛋白质还包含免疫球蛋白fc结构域。除非另外指明，否则本文中使用的术语“免疫球蛋白fc结构域”是指免疫球蛋白重链恒定区的片段。免疫球蛋白fc结构域可包含例如免疫球蛋白ch2和ch3结构域。免疫球蛋白fc结构域可包含例如免疫球蛋白ch2和ch3结构域以及免疫球蛋白铰链区。在某些实施方案中，免疫球蛋白铰链区包含c220的替换或缺失例如c220s。免疫球蛋白铰链区、ch2与ch3结构域之间的边界是本领域公知的，并且可见于例如prosite数据库中(可在万维网上prosite.expasy.org处获得)。

在某些实施方案中，免疫球蛋白fc结构域来源于人igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2、igd、ige和igmfc结构域。在某些实施方案中，免疫球蛋白fc结构域来源于人igg1同种型或指导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，adcc)和/或补体介导的细胞毒性(cdc)的另外的同种型。在某些实施方案中，免疫球蛋白fc结构域来源于人igg1同种型。在某些实施方案中，免疫球蛋白fc结构域来源于人igg2同种型或者很少或不引起抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)和/或补体介导的细胞毒性(cdc)的另外的同种型。在某些实施方案中，免疫球蛋白fc结构域来源于人igg3同种型。在某些实施方案中，免疫球蛋白fc结构域来源于人igg4同种型。

在某些实施方案中，fc结构域包含提高fc结构域的稳定性和/或半衰期的替换，例如，一个或更多个本文中所述的替换。例如，在某些实施方案中，fc结构域包含以下替换中的至少一个：m252y、s254t、t256e、m428l、h433k、n434s和n434f替换。例如，fc结构域可包含m252y、s254t和t256e替换，或m428l和n434s替换。所有fc结构域残基编号均根据常规人igg编号(hesselletal.(2007)nature，449(7158)：101-4)。

在某些实施方案中，包含cd4d1d2突变蛋白的蛋白质还包含免疫球蛋白fc结构域和/或灵长类慢病毒包膜糖蛋白结合部分。在某些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白与fc结构域和/或包膜糖蛋白结合部分直接连接或融合。在另一些实施方案中，cd4d1d2突变蛋白可通过接头与fc结构域和/或包膜糖蛋白结合部分共价结合。

ii.蛋白质产生

用于产生本发明蛋白质的方法是本领域已知的。例如，可使用本文中提供的序列信息化学合成编码包含cd4突变蛋白的蛋白质的dna分子。可将合成dna分子与另一些合适的核苷酸序列，包括例如表达控制序列连接，以产生编码所期望蛋白质的常规基因表达构建体。

可将编码包含cd4突变蛋白的所期望蛋白质的核酸并入(连接)到表达载体中，所述表达载体可通过常规转染或转化技术引入到宿主细胞中。可使经转化的宿主细胞在允许所述宿主细胞表达编码蛋白质的基因的条件下生长。

编码cd4突变蛋白的核酸可通过使用本领域已知的方法使编码野生型人cd4d1d2的核苷酸序列(seqidno：35)突变来产生。此外，在某些实施方案中，可使用本领域已知的方法对编码本发明蛋白质的核酸进行密码子优化以在异源细胞，例如e.coli细胞、cho细胞等中表达。

本文中公开的编码cd4突变蛋白的示例性核苷酸序列包括seqidno：9(编码seqidno：8中所示的氨基酸序列)、seqidno：11(编码seqidno：10中所示的氨基酸序列)、seqidno：13(编码seqidno：12中所示的氨基酸序列)、seqidno：15(编码seqidno：14中所示的氨基酸序列)、seqidno：17(编码seqidno：16中所示的氨基酸序列)、seqidno：19(编码seqidno：18中所示的氨基酸序列)、seqidno：21(编码seqidno：20中所示的氨基酸序列)、seqidno：23(编码seqidno：22中所示的氨基酸序列)、seqidno：25(编码seqidno：24中所示的氨基酸序列)、seqidno：27(编码seqidno：26中所示的氨基酸序列)、seqidno：29(编码seqidno：28中所示的氨基酸序列)、seqidno：31(编码seqidno：30中所示的氨基酸序列)、seqidno：33(编码seqidno：32中所示的氨基酸序列)、seqidno：37(编码seqidno：36中所示的氨基酸序列)、seqidno：39(编码seqidno：38中所示的氨基酸序列)、seqidno：41(编码seqidno：40中所示的氨基酸序列)、seqidno：43(编码seqidno：42中所示的氨基酸序列)和seqidno：45(编码seqidno：44中所示的氨基酸序列)。

具体的表达和纯化条件将取决于所使用的表达系统而变化。例如，如果基因要在e.coli中表达，则可通过将经改造的基因置于合适的细菌启动子(例如trp或tac)和原核信号序列的下游，而将其克隆到表达载体中。表达的分泌蛋白积聚在折射体或包涵体中，并且可在通过弗氏压碎器(frenchpress)或声处理破坏细胞之后收获。然后使折射体溶解，并且通过本领域已知的方法将蛋白质再折叠和切割。

所述蛋白质可通过在允许该蛋白质表达的条件下使用编码这样的蛋白质的表达载体转染的宿主细胞生长(或对其进行培养)来产生。在表达之后，可收获蛋白质，并使用本领域已知的技术，例如蛋白a纯化将其纯化或分离。

iii.表达载体

在另一个方面中，本发明提供了包含编码任何前述蛋白质之核苷酸序列的分离的核酸。在另一个方面中，本发明提供了包含任何前述核酸的表达载体。在某些实施方案中，表达载体是病毒载体，例如腺相关病毒(aav)载体。

腺相关病毒(aav)是细小病毒(parvovirus)科dependoparvovirus属的小的非包膜二十面体病毒。aav具有约4.7kb的单链线性dna基因组。aav包括许多血清学上可区分的类型，包括血清型aav-1至aav-12，以及来自非人灵长类的多于100种的血清型(参见，例如srivastava(2008)j.cellbiochem.，105(1)：17-24，和gaoetal.(2004)j.virol.，78(12)，6381-6388)。aav能够感染数种组织类型的分裂细胞和静止细胞二者，而不同的aav血清型表现出不同的组织嗜性。

野生型aav基因组包含两个145个核苷酸的反向末端重复(invertedterminalrepeat，itr)，其包含指导aav复制、基因组衣壳化和整合的信号序列。除itr之外，三个aav启动子p5、p19和p40驱动编码rep和cap基因的2个开放阅读框的表达。两个rep启动子，加上单个aav内含子的差异剪接，导致从rep基因产生四个rep蛋白(rep78、rep68、rep52和rep40)。rep蛋白负责基因组复制。cap基因从p40启动子表达，并编码三种衣壳蛋白(vp1、vp2和vp3)，它们是cap基因的剪接变体。这些蛋白质形成aav颗粒的衣壳。

因为itr中包含用于复制、衣壳化和整合的cis作用信号，所以4.3kb内部基因组中的一些或全部可被外源dna，例如，外源目的蛋白的表达盒替代。在这种情况下，在例如质粒上反式提供rep和cap蛋白。为了产生aav载体，允许aav复制的宿主细胞系必须表达rep和cap基因、itr侧翼表达盒以及由辅助病毒提供的辅助功能，例如av基因e1a、e1b55k、e2a、e4orf6和va(weitzmanelal，adeno-associatedvirusbiology.adeno-associatedvirus：methodsandprotocols，pp.1-23，2011)。已详细描述了用于产生和纯化aav载体的方法(参见例如，muelleretal，(2012)currentprotocolsinmicrobiology，14d.1.1-14d.1.21，productionanddiscoveryofnovelrecombinantadeno-associatedviralvectors)。许多细胞类型适合于产生aav载体，包括hek293细胞、cos细胞、hela细胞、bhk细胞、vero细胞以及昆虫细胞(参见，例如，美国专利no.6,156,303、5,387,484、5,741,683、5,691,176、5,688,676、8,163,543、美国公开no.20020081721、pct公开no.wo00/47757、wo00/24916和w096/17947)。通常在这些细胞类型中由包含itr侧翼表达盒的一个质粒和提供另外的aav和辅助病毒基因的一个或更多个另外的质粒产生aav载体。

任何血清型的aav均可用于本发明。类似地，预期可使用任何av类型，并且本领域技术人员将能够鉴定适合于产生其所期望的重组aav载体(raav)的aav和av类型。aav和av颗粒可例如通过亲和色谱、碘克沙醇梯度(iodixonalgradient)或cscl梯度进行纯化。

aav载体可具有尺寸为4.7kb或者大于或小于4.7kb的单链基因组，包括大到5.2kb或小到3.0kb的超大基因组。此外，载体基因组可以是基本上自身互补的，因此在病毒内，基因组是基本上双链的。包含所有类型的基因组的aav载体适合于用于本发明的方法。

一些示例性aav载体描述于gardner，m.r.etal.(2015)nature，519(7541)：87-91中。一个示例性aav载体核苷酸序列示于seqidno：34中。

iv.药物组合物

对于治疗用途，本文中公开的蛋白质或表达载体优选地与可药用载体组合。本文中使用的术语“可药用”是指在合理的医学判断范围内适合用于与人和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、变应性应答，或者其他问题或并发症，与合理的获益/风险比相称的那些化合物、物质、组合物和/或剂型。

本文中使用的术语“可药用载体”是指适合用于与人和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、变应性应答，或者其他问题或并发症，与合理的获益/风险比相称的缓冲剂、载体和赋形剂。可药用载体包括任何标准的药用载体，例如磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳剂(例如，如油/水或水/油乳剂)和多种类型的润湿剂。所述组合物还可包含稳定剂和防腐剂。对于载体、稳定剂和辅料的一些实例，参见，例如martin，remington’spharmaceuticalsciences，15thed.，mackpubl.co.，easton，pa[1975]。可药用载体包括与药物施用相容的缓冲剂、溶剂、分散体介质、包衣、等张剂和吸收延迟剂，等。这样的介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域已知的。

在某些实施方案中，药物组合物可包含用于修饰、维持或保持例如组合物的ph、渗量、黏度、澄清度、颜色、等张性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放的速率、吸附或渗透的制剂材料。在这样的实施方案中，合适的制剂材料包括但不限于氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(例如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(例如硼酸盐、碳酸氢盐、tris-hcl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)；填充剂(bulkingagent)(例如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(例如乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid，edta))；络合剂(例如咖啡碱、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充剂(filler)；单糖；二糖；以及其他碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、矫味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐反离子(例如钠)；防腐剂(例如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(例如甘露醇或山梨糖醇)；助悬剂；表面活性剂或润湿剂(例如pluronic、peg、山梨聚糖酯、聚山梨酯例如聚山梨酯20、聚山梨酯、triton、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊(tyloxapal))；稳定性增强剂(例如蔗糖或山梨糖醇)；张度增强剂(例如碱金属卤化物，优选氯化钠或氯化钾、甘露醇山梨糖醇)；递送载剂；稀释剂；赋形剂和/或药用辅料(参见remington’spharmaceuticalsciences，18thed.(mackpublishingcompany，1990))。

在某些实施方案中，药物组合物可包含纳米颗粒，例如聚合物纳米颗粒、脂质体或胶束(参见anselmoetal.(2016)bioeng.transl.med.1：10-29)。

在某些实施方案中，药物组合物可包含持续或受控递送制剂。用于配制持续或受控递送方式，例如脂质体载体，可生物蚀解的微粒或多孔珠和储库型注射剂(depotinjection)的技术，也是本领域技术人员已知的。缓释制剂可包括例如以成形制品，例如膜或微囊的形式的多孔聚合物微粒或半透性聚合物基质。缓释基质可包括聚酯、水凝胶、聚丙交酯、l-谷氨酸与γ乙基-l-谷氨酸酯的共聚物、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、乙烯乙酸乙烯酯或聚-d(-)-3-羟基丁酸。缓释组合物还可包括脂质体，其可通过本领域已知的数种方法中的任一种来制备。

包含本文中公开的蛋白质或表达载体的药物组合物可以以剂量单位形式存在并且可通过任何合适的方法来制备。药物组合物应配制成与其预期施用途径相容。施用途径的一些实例是静脉内(iv)、皮下、皮内、吸入、经皮、表面(topical)、经黏膜、鞘内和直肠施用。一种示例性施用途径是iv输注。可用的制剂可通过药学领域已知的方法制备。例如，参见remington’spharmaceuticalsciences，18thed.(mackpublishingcompany，1990)。适合于肠胃外施用的制剂组分包括无菌稀释剂，例如注射用水、盐溶液、固定油(fixedoil)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如edta；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张度的试剂，例如氯化钠或右旋糖。

对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、cremophoreltm(basf，parsippany，nj)或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。载体应在制造和储存条件下保持稳定，并应以预防微生物来保存。载体可以是溶剂或分散体介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)，及其合适的混合物。

药物制剂优选地为无菌的。灭菌可通过任何合适的方法，例如通过无菌滤膜过滤来完成。当将所述组合物冻干时，可在冻干和重构之前或之后进行滤器灭菌。

本文中所述的组合物可局部或全身施用。在某些实施方案中，施用将是肠胃外施用。在某些实施方案中，药物组合物皮下施用，并且在某些实施方案中，静脉内施用。肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液，混悬剂和乳剂。

在某些实施方案中，活性组分的治疗有效量为0.1mg/kg至100mg/kg，例如1mg/kg至100mg/kg、1mg/kg至50mg/kg、1mg/kg至40mg/kg、1mg/kg至30mg/kg、1mg/kg至20mg/kg、1mg/kg至10mg/kg、1mg/kg至5mg/kg、50mg/kg、40mg/kg、30mg/kg、20mg/kg、10mg/kg、7.5mg/kg、5mg/kg或2.5mg/kg。在某些实施方案中，病毒载体的治疗有效量为10²至10¹⁵个载体基因组(vectorgenome，vg)拷贝，例如10²至10¹⁰、10²至10⁵、10⁵至10¹⁵、10⁵至10¹⁰、10¹⁰至10¹⁵、10¹⁰至10¹⁴、10¹⁰至10¹²、或10¹²至10¹⁴个vg拷贝。施用量将取决于这样的变量，例如待治疗的疾病或适应证的类型和程度、患者的整体健康、活性组分的体内效力、药物制剂和施用途径。可将初始剂量提高超过上水平，以便迅速达到所期望的血液水平或组织水平。或者，初始剂量可小于最佳剂量，并且在治疗过程期间日剂量可渐进地提高。可例如在设计为从0.5mg/kg至30mg/kg进行的常规i期剂量逐增研究中优化人的剂量。施用频率可以变化，这取决于一些因素，例如施用途径、剂量量、抗体的血清半衰期和所治疗的疾病。一些示例性给药频率为每天一次、每周一次和每两周一次。一种示例性施用途径是肠胃外的，例如静脉内输注。在某些实施方案中，将本文中公开的蛋白质或表达载体冻干，并随后在施用时，将其在缓冲盐水中重构。

v.治疗用途

本文中公开的蛋白质、表达载体、组合物和方法可用于在对象中治疗人类免疫缺陷病毒(hiv)感染。本发明提供了在对象中治疗hiv感染的方法。所述方法包括向对象施用有效量的单独的或与另外的治疗剂组合的本文中公开的蛋白质、表达载体或药物组合物，以在对象中治疗hiv感染。本发明还提供了阻断hiv进入到宿主细胞，例如人宿主细胞中的方法。所述方法包括将宿主细胞暴露于有效量的单独的或与另外的治疗剂组合的本文中公开的蛋白质、表达载体或药物组合物，以阻断hiv进入到宿主细胞中。本发明还提供了导致杀伤感染有hiv的宿主细胞，例如人宿主细胞的方法。所述方法包括将宿主细胞暴露于有效量的单独的或与另外的治疗剂组合的本文中公开的蛋白质、表达载体或药物组合物，以导致对被感染宿主细胞的杀伤。本发明还提供了引起病毒颗粒例如hiv病毒颗粒失活的方法。所述方法包括将病毒颗粒暴露于有效量的单独的或与另外的治疗剂组合的本文中公开的蛋白质、表达载体或药物组合物，以引起病毒颗粒的失活。本发明还提供了从对象的血浆中清除病毒颗粒，例如hiv病毒颗粒的方法。所述方法包括将对象暴露于有效量的单独的或与另外的治疗剂组合的本文中公开的蛋白质、表达载体或药物组合物，以从对象的血浆中清除病毒颗粒。

本文中使用的术语“有效量”是指足以实现有益或所期望结果的活性物质(例如，根据本发明的包含突变体cd4d1d2的蛋白质或表达包含突变体cd4d1d2的蛋白质的病毒载体)的量。有效量可以以一种或更多种施用、应用或剂量施用，并且并不旨在限于特定的制剂或施用途径。

本文中使用的“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”意指在对象，例如人中的对疾病的治疗。这包括：(a)抑制疾病，即阻止其发展；和(b)减轻疾病，即引起疾病状态的消退。本文中使用的术语“对象”和“患者”是指要通过本文中所述的方法和组合物治疗的生物体。这样的生物体优选地包括但不限于哺乳动物(例如，鼠、猿、马、牛、猪、犬、猫，等)，并且更优选地包括人。

本文中所述的方法和组合物可单独的或与其他治疗剂和/或方式组合使用。本文中使用的术语“以组合”施用理解为意指在对象患有病症的过程期间向对象递送两种(或更多种)不同的治疗，以便使治疗对患者的作用在某个时间点重叠。在某些实施方案中，当开始第二递送时，仍在进行第一种治疗的递送，因此在施用方面存在重叠。这在本文中有时称为“同时递送”或“并发递送”。在另一些实施方案中，一种治疗的递送在开始另一种治疗的递送之前结束。在任一种情况的某些实施方案中，所述治疗由于组合施用因此是更有效的。例如，第二治疗比当在不存在第一治疗的情况下施用第二治疗时将看到的，或在用第一治疗看到的类似情况相比是更有效的，例如，用较少的第二治疗看到等同的效果，或者第二治疗在更大程度上减轻症状。在某些实施方案中，递送使得症状或与该病症有关的其他参数的降低大于在不存在另一种递送的情况下递送的一种治疗下将观察到的降低。两种治疗的效果可以是部分累加、完全累加或大于累加。所述递送可使得当递送第二治疗时仍然可检测到递送的第一治疗的效果。

在某些实施方案中，本文中所述的方法或组合物与以下组合施用：核苷/核苷酸逆转录酶抑制剂(例如，拉米夫定(lamivudine)、阿巴卡韦(abacavir)、齐多夫定(zidovudine)、司他夫定(stavudine)、去羟肌苷(didanosine)、恩曲他滨(emtricitabine)和替诺福韦(tenofovir))、非核苷逆转录酶抑制剂(例如，地拉韦定(delavirdine)、依发韦仑(efavirenz)、依曲韦林(etravirine)和奈韦拉平(nevirapine))、蛋白酶抑制剂(例如，安普那韦(amprenavir)、夫沙那韦(fosamprenavir)、阿扎那韦(atazanavir)、地瑞那韦(darunavir)、茚地那韦(indinavir)、洛匹那韦(lopinavir)、利托那韦(ritonavir)、奈非那韦(nelfinavir)、沙奎那韦(saquinavir)和替拉那韦(tipranavir))、融合或进入抑制剂(例如，恩夫韦地(enfuvirtide)和马拉韦罗(maraviroc))、整合酶抑制剂(例如雷特格韦(raltegravir)和卡博特韦(cabotegravir))，或其任意组合。在某些实施方案中，本文中所述的方法或组合物与潜伏期逆转剂(latency-reversingagent，lra)，例如hdac抑制剂(例如伏立诺他(vorinostat))或tlr7激动剂(例如gs-9620，例如如美国专利公开no.us20160008374a1中所述)组合施用。

在说明书通篇，在组合物被描述为具有、包括或包含特定组分的情况下，或在过程和方法被描述为具有、包括或包含特定步骤的情况下，预期了另外存在基本上由所记载组分组成或由其组成的本发明的组合物，并且预期了存在基本上由所记载处理步骤组成或由其组成的根据本发明的过程和方法。

在本申请中，在说明要素或组分被包括在所记载的要素或组分的列表中和/或从中选择的情况下，应理解，该要素或组分可以是所记载的要素或组分中的任一个，或者要素或组分可选自所记载要素或组分中的两个或更多个。

此外，应理解，本文中所述的组合物或方法的要素和/或特征可以以多种方式组合，而不脱离本发明的精神和范围，无论本文中是明确的或是隐含的。例如，除非从上下文中另外理解，否则当提及特定化合物时，该化合物可用于本发明组合物的多个实施方案中和/或本发明方法中。换言之，在本申请中，已经以使得能够书写和描绘出清楚且简洁的申请的方式描述和示出了一些实施方案，但是旨在并且将理解的是，在不脱离本发明教导和一个或更多个发明的情况下，可对一些实施方案进行多种组合或分离。例如，将理解，本文中所述和示出的所有特征可适用于本文中所述和示出的本发明的所有方面。

应理解，除非从上下文和用途中另外理解，否则表述“至少一个/种”包括在该表述之后单独的每个所记载的对象以及两个或更多个所记载对象的多种组合。除非从上下文中另外理解，否则与三个或更多个所记载对象相连的表述“和/或”应理解为具有相同的含义。

除非另外特别说明或从上下文中理解，否则术语“包括”、“具有”、“包含”(包括其语法上的等同形式)的使用应通常理解为开放式且非限制性的，例如不排除另外的未记载的要素或步骤。

在术语“约/大约”的使用在定量值之前的情况下，除非另外特别说明，否则本发明还包括特定定量值本身。除非另外指出或推断，否则本文中使用的术语“约/大约”是指与标称值相差±10％。

应理解，步骤的顺序或执行某些动作的顺序并不重要，只要本发明保持可操作性即可。此外，可同时进行两个或更多个步骤或动作。

除非要求保护，否则本文中任何和所有实例或示例性语言(例如“例如”或“包括”)的使用仅旨在更好地举例说明本发明，并且不构成对本发明范围的限制。说明书中的语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于实践本发明是必不可少的。

实施例

以下实施例仅是举例说明性的，并且并不旨在以任何方式限制本发明的范围或内容。

实施例1-非人灵长类ecd4-ig表现出比人ecd4-ig更高的稳定性

cd4-ig是cd4的结构域1和2(cd4d1d2)与抗体fc结构域的融合体。ecd4-ig是cd4d1d2、抗体fc结构域与类似于hiv和siv共受体的酪氨酸硫酸化区的酪氨酸硫酸化肽(硫肽)的融合体(gardner，m.r.etal.(2015)nature，519(7541)：87-91)。该实施例描述了对包含人cd4d1d2或非人灵长类(nhp)cd4d1d2的ecd4-ig变体的聚集温度的测量结果。

蛋白质的构象稳定性(蛋白质对解折叠的抗性)是蛋白质治疗剂中的重要属性之一。部分解折叠可使治疗性蛋白质在体内非特异性地黏附于其他分子，这继而可缩短治疗性蛋白质的半衰期。

构象稳定性可通过动态光散射(dls)来测量，所述动态光散射是一种用于测量溶液中粒径的方法，其可继而用于测量不同条件下的粒径(nobbmann，u.etal.(2007)biotechnol.genet.eng.rev.，24：117-28)。由于布朗运动(brownianmotion)引起的颗粒运动对于小颗粒而言比大颗粒更快。dls能够通过检测颗粒运动来计算粒径。由于可溶性蛋白质分子小于相同蛋白质的聚集体，因此通过dls检出的粒径的提高指示蛋白质聚集。当蛋白质样品的温度缓慢提高时，热扫描dls测定检测到聚集体的形成。在该测定中，具有较高构象稳定性的蛋白质在相对较高温度下开始聚集，而具有较低构象稳定性的蛋白质在相对较低温度下开始聚集。

通常来说，对于重组蛋白治疗剂，期望60℃或更高的聚集温度。如图1a中所示，具有igg1fc结构域和野生型人cd4d1d2的ecd4-ig变体的聚集温度为51℃。如图1b中所示，具有igg2fc结构域和野生型人cd4d1d2的ecd4-ig变体的聚集温度为53℃。如图1a中所示，具有igg1fc结构域和野生型恒河猴cd4d1d2的ecd4-ig变体的聚集温度为62℃，其比具有人cd4d1d2的相应ecd4-ig变体的聚集温度高9℃。如图1b中所示，具有igg2fc结构域和野生型恒河猴cd4d1d2的ecd4-ig变体的聚集温度为67℃，其比具有人cd4d1d2的相应ecd4-ig变体的聚集温度高14℃。

因此，与基于野生型人cd4d1d2的ecd4-ig相比，基于野生型恒河猴cd4d1d2的ecd4-ig显示出提高的构象稳定性。

还测量了各自包含野生型人cd4d1d2的cd4-ig(不具有硫肽)和ecd4-ig(具有“mim2”(seqidno：3)硫肽)的聚集温度。如图2中所示，cd4-ig的聚集温度为80.4℃，而ecd4-ig的聚集温度为51℃。因此，另外的结合部分(例如，硫肽)的存在可大大降低cd4-ig的构象稳定性。

实施例2-使用dls测定进行对改善人cd4d1d2稳定性的氨基酸替换的鉴定

本实施例描述了对提高包含人cd4d1d2的蛋白质(例如cd4-ig和ecd4-ig)的聚集温度的氨基酸替换的鉴定。

为了鉴定可赋予人ecd4-ig以提高的构象稳定性的氨基酸替换，将人cd4d1d2与来自多种非人灵长类(nhp)物种的cd4d1d2进行比较。将人cd4d1d2氨基酸序列与多种猿、猴和原猴物种的cd4d1d2氨基酸序列进行比对，所述物种包括：黑猩猩、倭黑猩猩(bonobo)、大猩猩(gorilla)、婆罗洲猩猩(borneanorangutan)、白颊长臂猿(whitecheekedgibbon)、敏捷长臂猿(agilegibbon)、合趾猿(siamang)、疣猴(colobusmonkey)、东非黑白疣猴(colobusguereza)、安哥拉疣猴(angolancolobus)、非洲绿猴(africangreenmonkey)、草原猴(vervetmonkey)、sabaeus猴(sabaeusmonkey)、坦塔罗斯猴(tantalusmonkey)、红长尾猴(redguenon)、乌白眉猴(sootymangabey)、山魈(mandrill)、黑仰鼻猴(blacksnub-nosemonkey)、金仰鼻猴(goldensnub-nosemonkey)、叶猴(leafmonkey)、豚尾猴(pig-tailedmacaque)、恒河猴、食蟹猴(cynomolgusmacaque)、日本猕猴(japanesemacaque)、狼猴(wolf’sguenon)、侏长尾猴(talapoin)、灰颊白眉猴(gray-cheekedmangabey)、橄榄狒狒(olivebaboon)、铜色伶猴(copperytiti)、狨猴(marmoset)、普通松鼠猴(commonsquirrelmonkey)、玻利维亚松鼠猴(boliviansquirrelmonkey)、吼猴(howlermonkey)、玻利维亚红吼猴(bolivianredhowlermonkey)、巴拿马白喉卷尾猴(panamanianwhite-throatedcapuchin)、南希马夜猴(nancyma’sowlmonkey)、阿扎拉之夜猴(azara’sowlmonkey)、眼镜猴(tarsier)、巽他飞行狐猴(sundaflyinglemur)、灰鼠狐猴(graymouselemur)和克氏冕狐猴(coquerel’ssifaka)(图3和4)。在这些nhp物种中，人的cd4d1d2序列与其他猿的cd4d1d2序列最相似，与旧世界猴的cd4d1d2序列第二相似，与新世界猴的cd4d1d2序列第三相似，而与原猴的cd4d1d2序列最不相似(图3)。发现恒河猴与人cd4d1d2具有88％同一性，但在t17、s23、i24、n39、n52、r59、n66、p68、l69、d88、q89、q94、q110、q129、r134、k142、l144、s147、l151、l162、n164和k167位置处具有差异。发现黑猩猩与人cd4d1d2具有98％同一性，但在i34、a55、p68和e87位置处具有差异。

为了确定某些替换是否使cd4结构域1(d1)和结构域2(d2)的疏水内核稳定，我们用具有比所替代氨基酸体积(例如，侧链体积)更大的疏水性氨基酸替换野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中的甘氨酸或疏水性氨基酸。疏水性氨基酸在某些情况下是隐蔽疏水性氨基酸。在该实验中，氨基酸a、v、p、l、i、m、f、y和w被认为是疏水性氨基酸，并且甘氨酸和疏水性氨基酸的相对体积被认为如下：g＜a＜v＜p＜l＝i＜m＜f＜y＜w。例如，观察到第g6、i24、l44、l51、a55、l69、g99、a102、v128、g141、v146、v161和v168位各自为相对于在人cd4d1d2中而在nhpcd4d1d2中体积更大的疏水性氨基酸(图4)。不希望受理论的束缚，假设蛋白质的疏水内核内的某些氨基酸替换，其中甘氨酸或疏水性氨基酸被比所替代氨基酸体积更大的疏水性氨基酸替代，会提高构象稳定性。因此，cd4d1d2的构象稳定性可通过使蛋白质的疏水内核稳定的策略来改善。为了分析潜在的替换，开发了计算机软件程序以使蛋白质的疏水内核内的空间可视化。该程序允许对蛋白质数据库(pdb)结构进行虚拟层析成像分区和编辑。例如，注意由l100、l144、v161和f170和周围的v128界定的疏水袋内的空空间(图5a)。对替换v128l进行建模填充了该疏水袋的大部分(图5b)。同样，注意由v168周围的l5、v161、f170和k7界定的疏水袋(图5c)。该疏水袋被替换v168l填充(图5d)。除此处示出的对v128和v168建模之外，该工具还允许对例如g6、a55和v146处的替换进行建模。因此，分析人cd4d1d2的结构以确定空间，以及可填充这些空间从而使cd4d1和d2的疏水内核稳定的替换。

基于这些比较，进行诱变分析以确定赋予nhpecd4-ig优于人ecd4-ig的聚集温度的突变。如实施例1中所述，使用dls热扫描测定评价替换。单独的和/或与cd4d1d2中其他位置处的突变组合(即，在不同的突变背景中)评价替换。除非另外指明，否则受试的ecd4-ig变体包含硫肽mim1(seqidno：2)、mim2(seqidno：3)、mim4(seqidno：4)、mim5(seqidno：5)或mim6(seqidno：6)。除非另外指明，否则受试的ecd4-ig变体包含具有或不具有c220s替换的所包含的igg1或igg2fc结构域。

人cd4d1d2(seqidno：1)中的k1在为猿的大猩猩中为n(图4a)。将k1n引入到基于野生型人cd4d1d2背景(seqidno：1)的ecd4-ig中使ecd4-ig的聚集温度提高2.3℃，所述温度如针对热稳定性进行的动态光散射(dls)测定中测量的(图6a)。

人cd4d1d2(seqidno：1)中的k2在数种旧世界猴(包括疣猴(colobus)、乌白眉猴和山魈)中是n，在新世界猴中是t，在原猴中是e(图4a)。在野生型人cd4d1d背景中，k2t、k2n和k2e分别使ecd4-ig的聚集温度提高了3℃、3.7℃和4.6℃(图6b至d)。r134g/n164d/k167t背景中的k2e替换使聚集温度提高了3.9℃(图6d)。这些结果表明，人cd4d1d2(seqidno：1)中k2位置处的替换，例如被e(k2e)替换，使包含cd4d1d2的蛋白质，例如ecd4-ig的聚集温度提高。

人cd4d1d2(seqidno：1)中的g6在眼镜猴(一种原猴)中是a(图4a)。将g6a引入到野生型人cd4d1d2(seqidno：1)背景中使ecd4-ig的聚集温度提高4.6℃。在a55v背景下，引入g6a使ecd4-ig的聚集温度提高0.8℃(图6e)。

人cd4d1d2(seqidno：1)中的k7在数种新世界猴(包括南希马夜猴、阿扎拉之夜猴和巴西夜猴(spix’sowlmonkey))中是e(图4a)。其在数种其他新世界猴中和原猴中也可以是r。k7e替换适度地提高了构象稳定性(图6f)。这些结果表明，人cd4d1d2(seqidno：1)中k7位置处的替换，例如被e(k7e)替换，使包含cd4d1d2的蛋白质，例如ecd4-ig的聚集温度提高。

由于其邻近k7，因此还评价了人cd4d1d2(seqidno：1)中k8处的替换。在人cd4d1d2(seqidno：1)中e对k8的替换显著提高了构象稳定性(图6g)。这些结果表明，人cd4d1d2(seqidno：1)中k8位置处的替换，例如被e(k8e)替换，使包含cd4d1d2的蛋白质，例如ecd4-ig的聚集温度提高。

人cd4d1d2(seqidno：1)中的t15在大猩猩(猿)中是n，在乌白眉猴(旧世界猴)中是a，在原猴和某些新世界猴中是p，以及在所剩的新世界猴中是s。t15n为n-连接的糖基化创建了n-x-t共有基序(图4a)。人cd4d1d2(seqidno：1)中t15n的引入使ecd4-ig的聚集温度提高7.9℃(图6h)。

人cd4d1d2(seqidno：1)中的t17在大多数旧世界猴(包括恒河猴)中是n。n的存在为n-连接的糖基化创建了n-x-t共有基序(图4a)。人ecd4-ig中t17n替换的引入使ecd4-ig的聚集温度提高(图6i)。人cd4d1d2(seqidno：1)中的t17在所有新世界猴中也是e，并且t17e替换赋予了构象稳定性适度的改善(图6j)。这些结果表明，人cd4d1d2(seqidno：1)中t17位置处的替换，例如被n(t17n)或e(t17e)替换，使包含cd4d1d2的蛋白质，例如ecd4-ig的聚集温度提高。

人cd4d1d2(seqidno：1)中的k21在为旧世界猴的sabaeus猴和坦塔罗斯猴中是n(图4a)。将k21n引入到野生型人cd4d1d2背景下的ecd4-ig中使其聚集温度提高11℃(图6k)。

人cd4d1d2(seqidno：1)中的k22在数种旧世界猴(包括非洲绿猴、草原猴、sabaeus猴、坦塔罗斯猴和红长尾猴)中是t(图4a)。将k21t引入到野生型人cd4d1d2背景下的ecd4-ig中使其聚集温度提高6.3℃(图6l)。

人cd4d1d2(seqidno：1)中的s23在多种旧世界和新世界猴(包括恒河猴)中是n，在某些其他旧世界和新世界猴中是t，以及在原猴中是s、y或a(图4a)。在基于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)和包含替换g6a/a55v/v128l/v168l的人cd4d1d2的ecd4-ig分子中，s23n使聚集温度分别提高10.1℃和4.8℃(图6m)。在包含g6a/a55v/v128l/v168l的背景下，s23t使聚集温度提高2.3℃(图6n)。

人cd4d1d2(seqidno：1)中的g38在巽他飞行狐猴(一种原猴)中在野生型人cd4d1d2(seqidno：1)背景中改变g38a使ecd4-ig的聚集温度降低9℃。

人cd4d1d2(seqidno：1)中的l51在某些原猴中是m(图4a)。在野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中和g6a/a55v背景下，将l51改变为i使ecd4-ig的聚集温度分别提高1.8℃和2.2℃(图6p)。

人cd4d1d2(seqidno：1)中的a55在黑猩猩、以及倭黑猩猩和原猴中是v(图4a)。该位置在所有新世界猴和数种旧世界猴(包括非洲绿猴、草原猴、sabaeus猴、坦塔罗斯猴和山魈)中都是i。红长尾猴(一种旧世界猴)是在该位置带有苏氨酸的唯一离群者(outlier)。在野生型人cd4d1d2背景中将人ecd4-ig中的a55突变为v(a55v)，使其聚集温度提高5.7℃，而在r134g/n164d/k1k67t突变背景中将人ecd4-ig中的a55突变为v(a55v)使聚集温度提高4.9℃(图6q)。然而，在g6a的背景下，ecd4-ig的聚集温度无变化。在具有野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的ecd4-ig的情况下，将a55突变为i使其聚集温度提高7.1℃(图6r)。这些结果表明，人cd4d1d2(seqidno：1)中a55位置处的替换，例如被v(a55v)或i(a55i)替换，使包含cd4d1d2的蛋白质，例如ecd4-ig的聚集温度提高。

a55是隐蔽疏水性氨基酸。不希望受理论的束缚，预期在该位置存在大量疏水性氨基酸提高了cd4d1的疏水内核的稳定性，从而改善其总体构象稳定性。作为结果，比所替代氨基酸体积更大的疏水性氨基酸对cd4d1d2中的隐蔽甘氨酸残基或隐蔽疏水性残基的替换可提高包含cd4d1d2的蛋白质，例如ecd4-ig的聚集温度。例如，以下位置是cd4d2d2中隐蔽甘氨酸残基或隐蔽疏水性残基，其可被体积更大的疏水性氨基酸替代：野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的l5、g6、v12、l14、a18、i24、i36、l37、l44、l51、a55、g65、f67、p68、l69、v93、g99、i71、l74、v86、v93、l95、l96、v97、f98、a102、l108、l114、l116、l118、p121、v128、p133、i138、g141、l144、v146、l149、g155、v161、v168、f170、i172、i174或v176。这些位置中的数个在nhp中也有所不同，包括野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的g6、i24、l44、l51、a55、l69、g99、a102、v128、g141、v146、v161和v168。

人cd4d1d2(seqidno：1)中的i70被新世界猴和原猴中的其他氨基酸替换(图4b)。在r134g/n164d/k167tecd4-ig背景中，引入氨基酸替换i70e使构象稳定性提高2℃(图6s)。这些结果表明，人cd4d1d2(seqidno：1)中i70位置处的替换，例如被e(i70e)替换，使包含cd4d1d2的蛋白质，例如ecd4-ig的聚集温度提高。

人cd4d1d2(seqidno：1)中的k72被新世界猴和原猴中的其他氨基酸替换(图4b)。在野生型人cd4d1d2(seqidno：1)背景和r134g/n164d/k167tecd4-ig背景中，引入氨基酸替换k72s使构象稳定性分别提高1.3℃和3℃(图6t)。这些结果表明，人cd4d1d2(seqidno：1)中k72位置处的替换，例如被s(k72s)替换，使包含cd4d1d2的蛋白质，例如ecd4-ig的聚集温度提高。

人cd4d1d2(seqidno：1)中的k75被nhp中的其他氨基酸，包括原猴中的e和多种新世界猴中的q替换(图4b)。k75e使野生型人cd4d1d2背景(seqidno：1)下的ecd4-ig的聚集温度提高4.1℃(图6u)。同样，k75q使野生型人cd4d1d2背景(seqidno：1)下的ecd4-ig的聚集温度提高3℃(图6v)。

在野生型人cd4d1d2(seqidno：1)背景或g6a/a55v背景的情况下，l对人cd4d1d2(seqidno：1)中v86的替换不会显著影响ecd4-ig的聚集温度(图6w)。

在野生型人cd4d1d2(seqidno：1)背景的情况下，i对人cd4d1d2(seqidno：1)中v93的替换，使ecd4-ig的聚集温度适度提高0.2℃，但在g6a/a55v背景下使聚集温度降低9.25℃(图6x)。

人cd4d1d2(seqidno：1)中的q94在猿和人中只是q，而在旧世界灵长类、新世界灵长类和原猴中是e(图4b)。在r134g背景下，q94e使ecd4-ig的聚集温度适度降低(图6u)。

在g6a/a55v背景的情况下，i对人cd4d1d2(seqidno：1)中v97的替换使ecd4-ig的聚集温度适度降低(图6z)。

人cd4d1d2(seqidno：1)中的a102在松鼠猴(一种新世界猴)中是v(图4b)。a102v使野生型人cd4d1d2背景(seqidno：1)下的ecd4-ig的聚集温度提高1.1℃(图6aa)。

人cd4d1d2(seqidno：1)中的q110在某些旧世界灵长类(包括恒河猴)中是e，以及在某些原猴中是h(图4b)。在q94e/r134g/n164d/k167t背景下，q110e不会改变ecd4-ig的聚集温度(图6bb)。

尽管在灵长类中表面上没有变化，但由于与由l116、c130、v146、w157和c159界定的疏水袋邻近，人cd4d1d2(seqidno：1)的第l116位是令人感兴趣的。在g6a/s23n/a55v/v128l/v168l背景的情况下，f(比所替代氨基酸体积更大的一种疏水性氨基酸)对人cd4d1d2(seqidno：1)中l116的替换使ecd4-ig的聚集温度提高7.2℃(图6cc)。然而，在g6a/s23n/a55v/v128l/v146i/v168l背景下，l116f导致聚集温度降低0.4℃。同样，w(比所替代氨基酸体积更大的另一种疏水性氨基酸)对l116的替换，使g6a/s23n/a55v/v128l/v168l背景中的ecd4-ig的聚集温度提高1.4℃。但使g6a/s23n/a55v/v128l/v146i/v168l背景中的聚集温度降低6℃(图6dd)。这些结果表明，人cd4d1d2(seqidno：1)中第l116位处的替换，例如被f或w(l116f或l116w)替换，使包含cd4d1d2的蛋白质，例如ecd4-ig的聚集温度提高，尽管未与v146i组合。

人cd4d1d2(seqidno：1)中的v128在眼镜猴(一种原猴)中是l(图4c)。用i(比所替代氨基酸体积更大的一种疏水性氨基酸)替换v128使野生型人cd4d1d2(seqidno：1)背景中ecd4-ig的聚集温度提高1.6℃(图6ee)。使用开发用于可视化和编辑蛋白质结构的计算工具，对替换v128l进行建模(图5)。v128l(用比所替代氨基酸体积更大的疏水性氨基酸进行的一种替换)比野生型v128更大程度地填充由l100、l144、v161和f170界定的疏水袋。v128l使野生型人cd4d1d2(seqidno：1)背景下的ecd4-ig的聚集温度提高2.7℃(图6ff)。这些结果表明，在第v128位处的替换，特别是用比v体积更大的疏水性氨基酸进行的替换，使包含cd4d1d2的蛋白质，例如ecd4-ig的构象稳定性和聚集温度提高。

人cd4d1d2(seqidno：1)中的r134在婆罗洲猩猩(一种猿)中是t，但在恒河猴(旧世界猴)、眼镜猴(原猴)、巽他飞行狐猴(原猴)和灰鼠狐猴(原猴)中是g(图4c)。在野生型人cd4d1d2(seqidno：1)背景下的ecd4-ig中包含r134g替换，使聚集温度提高4.1℃(图6gg)。另外，在不同的突变背景(例如k167t或q94e/q110e/k142r/n164d)中包含r134g替换大大提高了人ecd4-ig的构象稳定性(图6gg)。这些结果表明，人cd4d1d2(seqidno：1)中第r134位处的替换，例如被g(r134g)替换，使包含cd4d1d2的蛋白质，例如ecd4-ig的聚集温度提高。

人cd4d1d2(seqidno：1)中的g140在婆罗洲猩猩(一种猿)中是a，以及在数种旧世界猴中是v或r。在野生型人cd4d1d2(seqidno：1)背景中用a替换g140使ecd4-ig的聚集温度提高7.8℃(图6hh)。

人cd4d1d2(seqidno：1)中的k142在多种旧世界和新世界猴(包括恒河猴)中是r，以及在原猴中可以是g或s(图4c)。在多种背景情况下，k142r并未提高ecd4-ig的聚集温度(图6ii)。

人cd4d1d2(seqidno：1)中的v146在多种新世界猴和原猴中是l或m(图4c)。v146还与由l116、c130、v146、w157和c159界定的cd4d2的结构中的疏水袋邻近。在g6a/s23n/a55v/v128l/v146l背景中，用l(比所替代氨基酸体积更大的一种疏水性氨基酸)替换v146使ecd4-ig的聚集温度提高2.2℃(图6jj)。然而，用i(比所替代氨基酸体积更大的一种疏水性氨基酸)替换v146使g6a/s23n/a55v/v128l/v146l背景下的ecd4-ig的聚集温度提高7.6℃(图6kk)。同样，用f或w(各自为比所替代氨基酸体积更大的一种疏水性氨基酸)替换v146使g6a/s23n/a55v/v128l/v146l背景下的ecd4-ig的聚集温度分别提高3.6℃和4.1℃(图6ll&mm)。不旨在受任何特定理论的束缚，这些结果表明，通过用比所替代氨基酸体积更大的疏水性氨基酸替换v146(例如v146i、v146f、v146l、v146w、v146m和v146p)来填充由l116、c130、v146、w157和c159界定的cd4d2结构中的疏水袋，可提高蛋白质稳定性，如在热稳定性测定(例如dls)中测量的。

人cd4d1d2(seqidno：1)中的n164在除黑猩猩、倭黑猩猩、和大猩猩之外的猿中，以及在旧世界猴和原猴中为d(图4c)。这个d可能是祖先的，而存在于某些猿中的n和存在于新世界猴中的h可能是衍生的。与数种另一些替换(r134g、r134g/k167t和q94e/q110e/r134g/k142r/k167t)组合测量具有和不具有n164d替换的人ecd4-ig的聚集温度(图6nn)。在这些突变背景中的每一个中，n164d赋予ecd4-ig以提高的构象稳定性。这些结果表明，人cd4d1d2(seqidno：1)中第n164位处的替换，例如被d(n164d)替换，使包含cd4d1d2的蛋白质，例如ecd4-ig的聚集温度提高。

人cd4d1d2(seqidno：1)中的k167在除疣猴之外的所有旧世界猴中，以及在所有原猴中均是t。在疣猴中，该位置是r，而在新世界猴中，其是l。将人ecd4-ig中k167突变为例如t(k167t)，提高了构象稳定性(图6oo)。在三种不同的突变背景(r134g、q94e/q110e/r134g/k142r/n164d和q94e/q110e/r134g/n164d)中观察到构象稳定性的提高。这些结果表明，人cd4d1d2(seqidno：1)中第k167位处的替换，例如，被t(k167t)替换，使包含cd4d1d2的蛋白质，例如ecd4-ig的聚集温度提高。

人cd4d1d2(seqidno：1)中的v168在夜猴(其是新世界灵长类)和原猴中为l(图4c)。使用开发用于可视化和编辑蛋白质结构的计算工具，对替换v168l进行建模。用l(比所替代氨基酸体积更大的一种疏水性氨基酸)替换v168使野生型人cd4d1d2(seqidno：1)背景中ecd4-ig的聚集温度提高0.8℃(图6pp)。因此，第v168位处的替换，特别是用比v体积更大的疏水性氨基酸进行的替换，使包含cd4d1d2的蛋白质，例如ecd4-ig的构象稳定性和聚集温度提高。

人cd4d1d2(seqidno：1)中的v176被i替换。在野生型人cd4d1d2(seqidno：1)背景中，v176i使ecd4-ig的聚集温度提高9.2℃。

在受试背景中，以下替换组合使聚集温度提高：k2e/n164d(图7a)；k2e/k167t(图7b)；k7e/k8e(图7c)；k8e/n164d(图7d)；k8e/k167t(图7e)；t17n/n164d(图7f)；t17n/k167t(图7g)；t17e/n164d(图7h)；t17e/k167t(图7i)；i70e/n164d(图7j)；i70e/k167t(图7k)；k72s/n164d(图7l)；k72s/k167t(图7m)；q94e/q110e(图7n)；q94e/n164d(图7p)；q94e/k167t(图7q)；q110e/n164d(图7s)；q110e/k167t(图7t)；r134g/n164d(图7v)；r134g/k167t(图7w)；k142r/n164d(图7x)；k142e/k167t(图7y)；n164d/k167t(图7z)和k166n/k167t(图7aa)。在受试背景中，以下替换组合使聚集温度降低：q94/r134(图7o)、q110/r134(图7r)、r134/k142(图7u)和k142/n164(图7x)。出乎意料地，尽管q94e和q110e未单独地提高聚集温度，但是将组合q94/q110替换通常确实会提高聚集温度(图7n)。

还比较了具有和不具有3个、4个或5个所替换位置的组合的蛋白质的聚集温度。所替换位置的组合包括r134/n164/k167(图7a)、r134/k142/n164/k167(图7b)、t17/r134/n164/k167(图7c)、q94/r134/n164/k167(图7d)、q94/q110/r134/n164/k167(图7e)、q110/r134/n164/k167(图7f)、q94/q110/r134/k142/k167(图7g)、q94/q110/r134/n164(图7h)、q94/q110/k142/k167(图7i)和k75/q94/q110(图7j)。所有这些替换组合均显著地提高了构象稳定性。

在其他情况下的野生型人cd4d1d2(seqidno：1)背景中的3个位置r134/n164/k167处的替换使ecd4-ig的聚集温度从53℃提高至63℃，提高了十度(图8a)。具体地，该ecd4-ig变体包含氨基酸替换r134g/k164d/k167t。这些结果表明，人cd4d1d2(seqidno：1)中第r134、k164和k167位处的替换，例如r134g、k164d和k167t替换，使包含cd4d1d2的蛋白质，例如ecd4-ig的聚集温度提高。这些结果还表明，相对于人cd4d1d2，nhpcd4d1d2的优异构象稳定性可用最少数目的替换进行再现。由于包含r134g/k164d/k167t的ecd4-ig变体的提高的构象稳定性，因此在该突变背景下评价了许多其他替换。

使人cd4d1d2构象稳定性提高的氨基酸替换及其组合通常导致正电荷净损失。例如，k72s、r134g和k167t各自用不带电荷氨基酸替换带正电荷的碱性氨基酸。t17e、i70e、q94e、q110e和n164d各自用带负电荷的酸性氨基酸替换不带电荷氨基酸。同样，k2e、k7e、k8e和k75e各自用带负电荷的酸性氨基酸替换带正电荷的碱性氨基酸。这些结果表明，导致正电荷净损失或负电荷增加的替换，使包含cd4d1d2的蛋白质，例如ecd4-ig的聚集温度提高。

此外，观察到提高构象稳定性的许多氨基酸替换不破坏盐桥。潜在盐桥中所涉及的位置通过分析人cd4的现有x射线晶体结构来确定。潜在盐桥(由连字符指示的每个盐桥)为：k1-e91、k2-e91、k7-d10、k8-e119、k29-k85、k50-e77、r54-d78、r58-e13、r59-d56、k72-d56、k89-e85、r131-e169、k136-d153、k167-e169和k171-e169。在人与nhpcd4d1d2中不同的位置中，潜在盐桥中涉及的位置为：k1、k2、k50、d56、r58、r59、k72、e77、e91、r131、d153、k167、e169和k171。在以下位置具有替换的cd4来源多肽中观察到提高的构象稳定性：t17、a55、i70、k75、q94、q110、r134和n164，所述替换中均不参与盐桥。这些结果表明，使包含cd4d1d2的蛋白质，例如ecd4-ig的构象稳定性提高的替换通常不参与盐桥。

在包含第l5、i76、l96和f98位处的替换的ecd4-ig突变形式的情况下，进一步研究了包含a55v的替换组合(图9)。发现a55v与这些另一些替换中的所有四个(l5y、i76p、l96v和f98v)一起替换使ecd4-ig的构象稳定性降低(图9a)。当单独评价时，f98v导致构象稳定性的显著损失(图9b)。不希望受理论的束缚，f98v替换可能会使结构域1与结构域2之间的接合面不稳定。当替换i76p(其也是结构域1与结构域2之间的接合面处的位置)恢复为野生型时，在cd4d1d2的情况下，发现176p对构象稳定性有适当的损害(图9c)。出乎意料地，发现替换对s23n/l96v的存在显著提高了构象稳定性(图9d)。因此，a55v和s23n在cd4d1d2的情况下提高了构象稳定性，而i76p和f98v不利于构象稳定性。

将用比所替代氨基酸体积更大的不同疏水性氨基酸代替甘氨酸或隐蔽疏水性氨基酸的替换组合，并测量所得ecd4-ig蛋白的聚集温度(图10)。例如，将g6a与a55v组合使野生型人cd4d1d2(seqidno：1)背景下的ecd4-ig的聚集温度提高4.5℃(图10a)。将v128l与v128l组合使g6a/a55v背景下的ecd4-ig的聚集温度提高2.9℃(图10b)。将g6a、a55v、v128l与v168l组合使野生型人cd4d1d2(seqidno：1)背景下的ecd4-ig的聚集温度提高7.4℃(图10c)。将g6a、s23n、v128l、v146i和v168l组合，使a55v背景下的ecd4-ig的聚集温度提高15.7℃(图10d)。将g6a、s23n、a55v、v128l、v146i与v168l组合使野生型人cd4d1d2(seqidno：1)背景下的ecd4-ig的聚集温度提高19.4℃(图10e)。将s23n与v146i组合使g6a/a55v/v128l/v168l背景下的ecd4-ig的聚集温度提高7.4℃(图10f)。将s23n、v128l与v168l组合，使g6a/a55v背景下的ecd4-ig的聚集温度提高7.3℃(图10g)。将s23n、a55v、v128l、v146i与v168l组合，使g6a背景下的ecd4-ig的聚集温度提高14.8℃(图10h)。将s23n、v128l、v146i与v128l组合，使g6a/a55v背景下的ecd4-ig的聚集温度提高14.9℃(图10i)。将g6a、s23n、a55v、l116f、v128l与v168l组合，使野生型人cd4d1d2(seqidno：1)背景下的ecd4-ig的聚集温度提高19℃(图10j)。将g6a、s23n、a55v、v128l、v146f与v168l组合，使野生型人cd4d1d2(seqidno：1)背景下的ecd4-ig的聚集温度提高15.4℃(图10k)。将g6a、s23n、a55v、v128l、v146w与v168l组合，使野生型人cd4d1d2(seqidno：1)背景下的ecd4-ig的聚集温度提高15.9℃(图10l)。因此，用比所替代氨基酸体积更大的疏水性氨基酸替代甘氨酸或隐蔽疏水性氨基酸的替换的组合导致含cd4d1d2的蛋白质，例如ecd4-ig的聚集温度的显著提高。

为了进一步举例说明通过用比所替代氨基酸体积更大的氨基酸替换甘氨酸或隐蔽疏水性氨基酸而赋予的提高的聚集温度，某些实例呈现了来自dls测定的主要热扫描数据(图11)。在这些实例中，g6a、a55v、g6a/a55v、v128l/v168l、s23n和v146i的添加逐渐提高了ecd4-ig的热稳定性。

通过该实施例中描述的dls热扫描测定测量的ecd4-ig蛋白的聚集温度从最高温度到最低温度以降序示出(图12)。

该实施例中描述的cd4-ig和ecd4-ig蛋白变体的热扫描测定结果总结于表5中。除标记有*的那些之外，所有igg1fc结构域包含铰链区中的c220s替换(标准的igg1编号)。

表5

实施例3-使用染料嵌入测定进行的对提高人cd4d1d2稳定性的氨基酸替换的鉴定

该实施例描述了基于染料嵌入的另一种类型的热扫描测定的使用，以鉴定cd4突变蛋白(例如，cd4-ig和ecd4-ig)内提高其构象稳定性的的替换及其组合。与dls测定类似，随着温度逐渐提高，构象不稳定性使染料嵌入到解折叠蛋白质中。嵌入的染料发荧光，并且其光被检测为蛋白质解折叠或“解链”的程度的定量测量结果。因此，将数据报道为50％解链温度。使用两种互补类型的染料嵌入测定，一种基于syproorange嵌入，以及另一种是appliedbiosystemsproteinthermalshift测定的专有染料组分。

首先，使用syproorange染料嵌入测定来鉴定ecd4-ig中提高其构象稳定性的替换及其组合。示出了来自该syproorange染料嵌入测定的解链温度(图13)。这些结果也列于表6中。此处报道的所有ecd4-ig蛋白均包含mim6硫肽、铰链区中的c220s替换和igg1fc。

表6

进行数种另外的syproorange染料嵌入测定，以比较ecd4-ig中因其提高蛋白质构象稳定性的能力而引起关注的替换组合。将包含替换r134g/n164d/k167t和k72s/k75e/q94e/q110e/r134g/n164d/k167t的ecd4-ig蛋白与包含野生型人cd4d1d2(seqidno：1)或野生型恒河猴cd4d1d2的那些进行比较(图15a)。现在在igg2fc的情况下，在r134g/n164d/k167t下重复该测定(图15b)。接下来，将包含替换r134g/n164d/k167t、k72s/k75e/q94e/q110e/r134g/n164d/k167t和s23n/a55v/k72s/k75e/q94e/l96v/q110e/r134g/n164d/k167t的ecd4-ig蛋白与广泛中和抗体10-1074和包含野生型人cd4d1d2(seqidno：1)或野生型恒河猴cd4d1d2的对照ecd4-ig蛋白进行比较(图15c)。图15a至c中报道的ecd4-ig蛋白均包含mim6硫肽，和铰链区中的c220s替换。

使用appliedbiosystemsproteinthermalshift测定，比较构象最稳定的cd4突变蛋白中的两种突变蛋白的热稳定性。在该实验中，cd4突变蛋白是缺少硫肽的cd4-ig蛋白。比较的替换组合为g6a/s23n/a55v/v128l/v168l(平均解链温度68.5℃)和s23n/a55v/k72s/k75e/q94e/l96v/q110e/r134g/n164d/k167tv168l(平均解链温度66.1℃)(图15d)。这两种蛋白均显著地比具有野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的cd4-ig(平均解链温度53.3℃)更稳定。尽管g6a/s23n/a55v/v128l/v168l的稳定相比于s23n/a55v/k72s/k75e/q94e/l96v/q110e/r134g/n164d/k167tv168l在更大程度上依赖于用更大体积的疏水性氨基酸替换甘氨酸或隐蔽疏水性氨基酸，但用于蛋白质稳定的这些方法是互补的。此外，图15d示出了无论存在或不存在硫肽，任何集合的替换都显著地使cd4突变蛋白稳定。这些蛋白质中的每一个均包含铰链区中的c220s替换。

因此，在该实施例中，鉴定出人cd4d1d2(seqidno：1)内的许多替换以及提高蛋白质稳定性的替换的组合，如使用不同的染料嵌入测定测量的。

实施例4-对提高人cd4d1d2表达的氨基酸替换的鉴定

该实施例描述了对提高cd4突变蛋白，例如cd4-ig和ecd4-ig的表达的人cd4d1d2(seqidno：1)中的替换及其组合的鉴定。高蛋白质产量是至少以下三种方式的期望特性：首先，在从生产者细胞分泌之前，正确折叠且未聚集的所翻译蛋白质的比例将反映在蛋白质产量中。因此，测量蛋白质产量是用于测量适当蛋白质折叠和稳定性的一种替代方法。实际上，蛋白质稳定性测定(例如，dls)用于鉴定提高蛋白质表达的替换。其次，重组蛋白治疗剂的产量越高，产生相同量蛋白质所需的资源越少，并且产生成本越低。第三，当cd4突变蛋白通过任何基因治疗载体介导的递送系统(例如aav)递送时，更高的蛋白质产量将有望提高存在于血浆中cd4突变蛋白的浓度，或降低达到血浆中cd4突变蛋白的相同浓度所需的载体量。由于高蛋白质产量是期望的特性，因此评估了不同替换和替换组合对蛋白质产量的作用。

在expi293细胞中表达包含单独替换和替换组合的多种cd4突变蛋白，并将累积蛋白质产量与具有野生型人cd4d1d2(seqidno：1)的ecd4-ig进行比较(图16)。该分析表明所述替换通常使蛋白质产量提高。在这些产量实验中表达的蛋白质量列于表7中。

表7

设计了数个对照实验来专门研究用比所替代氨基酸体积更大的疏水性氨基酸替换甘氨酸或隐蔽疏水性氨基酸对蛋白质表达的作用。第s23位处的突变也包括在内，由于在该位点上的突变对蛋白质稳定性和产量的显著影响。基于上述对包含s23n和作为用比所替代氨基酸体积更大的疏水性氨基酸对甘氨酸或隐蔽疏水性氨基酸的替换的g6a/a55v/v128l/v168l组合的cd4-ig和ecd4-ig蛋白的改进，将g6a/s23n/a55v/v128l/v168l和野生型人cd4d1d2(seqidno：1)二者包括在内作为这些蛋白质表达实验的对照(图17)。每个图(图17a至g)表示具有平行表达的对照蛋白的单独的蛋白质表达实验。注意到以下观察结果：从最大到最小(即，其中＞意指“大于”)，ecd4-ig蛋白的表达为g6a/s23n/a55v/v128l/v168l＞g6a/a55v＞a55v＞野生型人cd4d1d2(图17a)。l116w和l116f二者均使包含g6a/s23n/a55v/v128l/v168l的ecd4-ig的表达提高(图17b)。除s23n之外的第s23位处的替换，例如s23t，也使蛋白质表达提高(图17b&d)。用c130v/c159a替代c130-c159二硫化物使蛋白质表达提高(图17c至d)。用更大体积的疏水性氨基酸替换v146(例如，v146i、v146l、v146f和v146w)通常使蛋白质表达提高(图17e至g)。同样，用更大体积的疏水性氨基酸替换l116(例如，l116f和l116w)通常使蛋白质表达提高(图17b、d和g)。然而，用比所替代氨基酸体积更大的疏水性氨基酸在l116和v146二者处的替换的组合趋于不使蛋白质表达进一步提高(图17g)。因此，使蛋白质表达最大化，通常高于基于野生型人cd4d1d2(seqidno：1)序列的表达蛋白质的3至4倍的替换的组合包括g6a/s23n/a55v/v128l/v146i/v168l、g6a/s23n/a55v/v128l/v146f/v168l、g6a/s23n/a55v/v128l/v146l/v168l、g6a/s23n/a55v/v128l/v146w/v168l、g6a/s23n/a55v/l116f/v128l/v168l、g6a/s23n/a55v/l116w/v128l/v168l、g6a/s23n/a55v/v128l/c130v/c159a/v168l、g6a/s23n/a55v/l110i/v128l/v168l和g6a/s23n/a55v/v128l/v168l/v176i。还应注意，g6a/s23n/a55v/v128l/v168l显示挽救了在野生型人cd4d1d2(seqidno：1)背景下不良表达的突变蛋白的表达，例如g140a和v176i(图16)与(图17e&f)。图17中所示的蛋白质表达产量在表8至15中说明。还比较了具有野生型人cd4d1d2(seqidno：1)、g6a/s23n/a55v/v128l/v168l、和s23n/a55v/k72s/k75e/q94e/l96v/q110e/r134g/n164d/k167t的缺少硫肽的cd4-ig变体的蛋白质表达(图17h)。来自图17h的蛋白质表达产量在表15中说明。该实验表明，与包含野生型或s23n/a55v/k72s/k75e/q94e/l96v/q110e/r134g/n164d/k167tcd4d1d2的其他相同的cd4-ig蛋白相比，g6a/s23n/a55v/v128l/v168l更有效地表达，并且g6a/s23n/a55v/v128l/v168l的表达的增强与硫肽无关。这些结果表明，用比所替代氨基酸体积更大的疏水性氨基酸替换甘氨酸或隐蔽疏水性氨基酸可提高蛋白质表达，特别是在人cd4d1d2的第g6、a55、l116、v128、v146、v168和v176位处。值得注意的是，g6a、a55、l116、v128、v146、v168和v176的侧链是非表面暴露的。因此，g6a/s23n/a55v/v128l/v168l在具有表面暴露侧链的位置(s23)处仅具有一个替换。

表8

表9

表10

表11

表12

表13

表14

表15

实施例5-cd4d1d2变体在人fcrn转基因小鼠中的药动学

该实施例描述了包含实施例2至4中鉴定的具有提高的稳定性的cd4d1d2变体的蛋白质在人fcrn转基因免疫缺陷小鼠中的药动学。在人fcrn转基因小鼠中静脉内施用之后，测量野生型人cd4-ig或者人cd4-ig或ecd4-ig变体的体内药动学(pk)。

在人fcrn转基因小鼠的第一实验中，野生型人cd4-ig的半衰期为2.4天，而具有第r134/n164/k167或k72/k75/q94/q110/r134/n164/k16位处替换的cd4-ig变体的半衰期分别为4.2天或8.6天(图18a)。因此，提高cd4d1d2蛋白的聚集温度的替换显著提高体内半衰期。还测得r134/n164/k167ecd4-ig的半衰期为5.5天(图18b)。此外，具有第k72/k75/q94/q110/r134/n164/k167和q94/q110/r134/n164/k167位处的替换的ecd4-ig的半衰期分别为9.0天和3.7天(图18c)。这些结果表明，在dls和染料嵌入热扫描测定中提高ecd4-ig的构象稳定性的替换改善了所述蛋白质的药动学。

在人fcrn转基因小鼠的第二实验中，对包含另外的突变组合的ecd4-ig变体的药动学进行比较(图19)。在该实验中，使用已知具有长半衰期的对照广泛中和抗体10-1074作为对照。10-1074(具有igg1fc)的半衰期为11.6天。具有野生型人igg1fc和以下氨基酸替换的ecd4-ig变体的半衰期为：野生型人cd4d1d2(seqidno：1)为3.5天，k72s/k75e/r134g/n164d/k167t为4.6天，k72s/k75e/q94e/q110e/r134g/n164d/k167t为6.1天，s23n/a55v/k72s/k75e/q94e/q110e/r134g/n164d/k167t为6.3天，以及s23n/a55v/k72s/k75e/r134g/n164d/k167t为6.9天(图19，表16)。。因此，ecd4-ig的半衰期延长多至两倍。另外，在cd4d1d2中s23n/a55v/k72s/k75e/q94e/q110e/r134g/n164d/k167t替换的情况下，将包含fc结构域替换m252y、s254t和t256e(“yte”)或m428l和n434s(“ls”)的ecd4-ig蛋白的半衰期与具有野生型人igg1fc的其他相同变体的半衰期进行比较。包含fc结构域中m252y、s254t和t256e替换的ecd4-ig变体显示并未显著地改变ecd4-ig的半衰期(不具有m252y、s254t和t256e替换的为6.3天，而具有所述替换的为6.0天)(表16)。然而，fc结构域中的m428l和n434s替换确实显著地延长了该ecd4-ig变体的半衰期，从不具有m428l和n434s替换的6.3天到具有所述替换的10.2天，为62％提高(图19)。与具有野生型人cd4d1d2(seqidno：1)和野生型人igg1fc结构域的ecd4-ig蛋白相比，cd4d1d2中的s23n/a55v/k72s/k75e/q94e/q110e/r134g/n164d/k167t替换以及fc结构域中的m428l和n434s替换使其半衰期从3.5天提高到10.2天，或者提高近3倍。

表16

实施例6-cd4d1d2变体在野生型小鼠中的药动学

该实施例描述了在cd4d1d2中具有替换的ecd4-ig蛋白在野生型balb/cj小鼠中的药动学。

该实验的第一目标是确定通过用比所替代氨基酸体积更大的疏水性氨基酸替换甘氨酸或隐蔽疏水性氨基酸而稳定的ecd4-ig变体是否产生显示与在很大程度上通过提高其酸度的替换组合而稳定的ecd4-ig变体相似的半衰期的ecd4-ig变体。在该实施例中受试的对照蛋白具有带有以下替换的cd4d1d2序列：s23n/a55v/k72s/k75e/q94e/q110e/r134g/n164d/k167t。将在很大程度上通过表面改变而稳定的该变体的药动学与具有替换g6a/s23n/a55v/v128l/v168l的变体的药动学进行比较(图20a)。除s23n之外，g6a/s23n/a55v/v128l/v168l仅包含蛋白质的疏水内核中的内部替换。

该实验的第二目标是确定将(i)使cd4突变蛋白更具酸性的替换，加(ii)用比所替代氨基酸体积更大的疏水性氨基酸对甘氨酸或隐蔽疏水性氨基酸的内部替换组合，是否影响cd4突变蛋白的药动学。为了评估向该高度内部稳定的变体添加表面电荷替换对药动学的影响，ecd4-ig变体被包含在该实验内，所述变体包含cd4d1d2中的以下替换组合：g6a/s23n/a55v/v128l/r134g/v168l、g6a/s23n/a55v/v128l/k167t/v168l和g6a/s23n/a55v/v128l/r134g/n164d/k167t/v168l(图20a)。针对第1天至第5天的期间计算半衰期，这是由于在第8天，在这些野生型(即，非免疫缺陷)balb/cj小鼠中的一些而非全部中观察到针对这些ecd4-ig蛋白的小鼠抗体应答。平均半衰期列于表17中。该实验表明，在很大程度上通过用比所替代氨基酸体积更大的疏水性氨基酸替换甘氨酸或隐蔽疏水性氨基酸而稳定的所有变体均显示出与包含在很大程度上使蛋白质更具酸性的替换s23n/a55v/k72s/k75e/q94e/q110e/r134g/n164d/k167t的变体至少一样长的半衰期(图20b)。这些变体中之一，g6a/s23n/a55v/v128l/r134g/v168l显示出比具有替换s23n/a55v/k72s/k75e/q94e/q110e/r134g/n164d/k167t的对照变体显著更长的半衰期(p＝0.03，2尾参数t检验)。此外，该实施例(例如，g6a/s23n/a55v/v128l/r134g/v168l相对于g6a/s23n/a55v/v128l/v168l)表明用酸性氨基酸对野生型人cd4d1d2(seqidno：1)中碱性氨基酸的替换可与用比所替代氨基酸体积更大的疏水性氨基酸对甘氨酸或隐蔽疏水性氨基酸的替换组合以提高体内cd4突变蛋白(例如ecd4-ig)的半衰期。总之，该实施例表明，包含用比所替代氨基酸体积更大的疏水性氨基酸对甘氨酸或隐蔽疏水性氨基酸的替换的cd4突变蛋白，例如ecd4-ig，可使蛋白质在体内的半衰期提高至与本文中表征的替换的其他组合至少一样大的程度。

表17

实施例7-cd4d1d2变体在大鼠中的药动学

该实施例描述了包含在实施例2中鉴定的具有提高的稳定性的cd4d1d2变体的蛋白质在大鼠中的药动学。在大鼠中皮下施用10mg/kg蛋白质之后，测量野生型人cd4-ig和具有替换r134g/n164d/k167t的人ecd4-ig变体的体内药动学(pk)。

野生型人cd4-ig的半衰期在大鼠中为11小时(图21)，这与已发表的文献一致(例如，chamow，s.m.etal.(1994)bloconjug.chem.，5(2)：133-40)。然而，包含突变r134g/n164d/k167t的ecd4-ig变体具有显著更长的半衰期，例如r134g/n164d/k167tecd4-igg1为48小时以及r134g/n164d/k167tecd4-igg2为42小时。这些结果表明，在dls热扫描测定中提高ecd4-ig的构象稳定性的替换，例如r134g/n164d/k167t替换，还改善了所述蛋白质的药动学。

实施例8-通过cd4d1d2变体进行的病毒中和

该实施例描述了通过包含实施例2至7中鉴定的具有改进的稳定性和药动学的cd4d1d2变体的蛋白质对病毒的中和。

针对病毒中和，对具有和不具有a55v替换的ecd4-ig变体进行测试。在r134g/n164d/k167t突变背景中测试a55v替换的作用。a55v突变使ecd4-ig中和hiv的以下三种不同主要分离株的感染的效力提高：bg505(图22a)、pvo.4(图22b)和9014(图22c)。针对病毒中和，还对具有和不具有s23n替换的ecd4-ig变体进行测试。在l5y/a55v/i76p/l96v/r134g/n164d/k167t突变背景中测试s23n替换的作用。s23n替换的存在使ecd4-ig中和两种不同hiv毒株(进化枝a病毒bg505(图23a)和进化枝b病毒pvo.4(图23b))的能力提高。总之，这些结果表明人cd4d1d2(seqidno：1)中第s23和a55位处的替换，例如s23n和a55v替换，使包含cd4d1d2的蛋白质，例如ecd4-ig对病毒的中和提高。

将包含替换s23n/a55v/l96v/r134g/n164d/k167t的ecd4-ig变体(68.5℃聚集温度)中和受试病毒组的能力与包含替换r134g/n164d/k167t的变体(60℃聚集温度)的中和受试病毒组的能力进行比较。受试病毒为398f1、bg505、246f3、tro.11、x2278、9014、pvo.4、t257-10、ce0217、zm651、cne8、cne55、bjox2000、ch119、x1634和89.6。具有68.5℃聚集温度的ecd4-ig变体比具有60℃聚集温度的ecd4-ig变体显著更好地中和病毒感染(p＜0.0001，威尔科克森匹配对检验)(图24)。对于具有高8.5℃聚集温度的变体，中和50％病毒感染所需的ecd4-ig的几何平均浓度低约一个数量级。

还对包含用比所替代氨基酸体积更大的疏水性氨基酸在甘氨酸或隐蔽疏水性氨基酸处的替换的ecd4-ig变体的病毒中和进行测试(图25)。该测定中使用的受试病毒是初始传播(t/f)病毒prb931-06。受试的ecd4-ig变体包含野生型人cd4d1d2(seqidno：1)对照(灰色)、a55v、g6a/a55v、g6a/s23n/a55v/v128l/v168l、g6a/s23n/a55v/v128l/v168l和g6a/s23n/q40a/a55v/v128l/v168l。该实验表明，对于包含a55v、g6a/a55v和g6a/a55v/s23t/v128l/v168l的变体，病毒中和是高度相似的。然而，包含s23n而不是s23t使病毒中和提高。此外，由q40a提供的中和增强与由s23n和a55v提供的中和增强并不冗余，并且当将这三个替换组合时，观察到最大的中和效力。因此，用比所替代氨基酸体积更大的疏水性氨基酸替换甘氨酸或隐蔽疏水性氨基酸不会负面影响病毒中和。

这些结果表明，使聚集温度提高的人cd4d1d2(seqidno：1)中的替换还使通过包含cd4d1d2的蛋白质，例如ecd4-ig进行的病毒中和提高。

实施例9-cd4d1d2变体在恒河猴中的药动学

该实施例描述了包含实施例2中鉴定的具有提高的稳定性的cd4d1d2变体的蛋白质在恒河猴中的药动学。

用igg1和igg2免疫球蛋白fc区构建具有r134g/n164d/k167t替换的ecd4-ig变体。在igg1和igg2fc区内，产生了包含替换m428l和n434s(缩写：“ls”)的变体，已显示所述替换延长单克隆抗体的半衰期。在恒河猴中体内评估这些变体的药动学。此处受试的变体具有以下聚集温度：r134g/n164d/k167tecd4-igg1，60℃；r134g/n164d/k167tecd4-igg2，66℃；r134g/n164d/k167tlsecd4-igg1，68℃；和r134g/n164d/k167tecd4-igg2，66℃。

三只恒河猴的组接受以下的静脉内输注：30mg/kg的r134g/n164d/k167tecd4-igg1(图26a)、30mg/kg的r134g/n164d/k167tecd4-igg2(图26b)、30mg/kg的r134g/n164d/k167tlsecd4-igg1(图26c)和30mg/kg的r134g/n164d/k167tlsecd4-igg2(图26d)。每个cd4来源的多肽都趋于表现出双阶段药动学谱，其中存在半衰期为2.7至6.2天的第一阶段，以及其中多肽的血浆浓度迅速下降的第二阶段。值得注意的是，r134g/n164d/k167tecd4-ig的所观察到的半衰期显著长于cd4-ig的所报道的半衰期。igg1或igg2fc中ls替换的存在显示适度延长了半衰期。

当将相同的ecd4-igg1蛋白以10mg/kg(图26e)或以1mg/kg(图26g)施用于恒河猴时，观察到与如已在将其以30mg/kg(图26c)施用时所观察到的相同的药动学谱。同样，当将相同的ecd4-igg2蛋白以10mg/kg(图26f)施用于恒河猴时，观察到与如已在将其以30mg/kg(图26d)施用时所观察到的相同的药动学谱。

实施例10-用cd4d1d2变体治疗感染的恒河猴

该实施例描述了用包含实施例2中鉴定的具有提高的稳定性的cd4d1d2变体的蛋白质治疗shiv感染的恒河猴。

用30mg/kg静脉内的igg1或igg2形式的r134g/n164d/k167tecd4-ig治疗感染有shiv-ad8的恒河猴(图27)。每种蛋白质使血浆病毒载量抑制多于一个数量级。在所有动物中，至少在一个时间点，病毒载量被抑制到检测限。病毒载量在接受igg1形式的ecd4-ig的动物中更慢地反弹，即使这些动物以较高的病毒载量开始。这些结果表明包含本文中所述的cd4d1d2变体(例如包含r134g/n164d/k167t替换)的蛋白质，例如ecd4-ig可抑制病毒复制，并由此在灵长类中治疗病毒感染。

通过引用并入

本文中提及的专利和科学文献中的每一个的全部公开内容出于所有目的通过引用并入。

等同方案

在不脱离本发明的精神或基本特征的情况下，本发明可以以其他特定形式实施。因此，前述实施方案在所有方面中都应被认为是举例说明性的，而不是对本文中所述的本发明进行限制。因此，本发明的范围由所附权利要求书而不是由前述描述来指示，并且在权利要求书的等同的含义和范围内的所有改变都旨在包含在其中。

序列表

seqidno：1：

seqidno：2：

seqidno：3：

seqidno：4：

seqidno：5：

seqidno：6：

seqidno：7：其中x是任何氨基酸。

seqidno：8：

seqidno：9：

seqidno：10：

seqidno：11：

seqidno：12：

seqidno：13：

seqidno：14：

seqidno：15：

seqidno：16：

seqidno：17：

seqidno：18：

swqidno：19：

seqidno：20：

seqidno：21：

seqidno：22：

seqidno：23：

seqidno：24：

seqidno：25：

seqidno：26：

seqidno：27：

seqidno：28：

seqidno：29：

seqidno：30：

seqidno：31：

seqidno：32：

seqidno：33：

seqidno：34：

seqidno：35：

seqidno：36：

seqidno：37：

seqidno：38：

seqidno：39：

seqidno：40：

seqidno：41：

seqidno：42：

seqidno：43：

seqidno：44：

seqidno：45：

seqidno：46：

seqidno：47：

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除