通过光学和/或电子显微技术成像的生物样品的包埋剂的制作方法

2021-01-08 11:01:34|

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本发明涉及显微技术领域，优选地涉及光学显微技术和/或电子显微技术领域。特别地，本发明涉及用于通过显微技术使生物样品成像的包埋剂。本发明的包埋剂涉及包含或组成为(i)二醇二甲基丙烯酸酯、(ii)聚亚烷基二醇二丙烯酸酯和/或聚亚烷基二醇甲基丙烯酸酯和(iii)引发剂的混合物的组合物。本发明还涉及由聚合本发明的包埋剂得到的导电材料和/或生物保存材料，及其制备方法和试剂盒；包埋至少一个生物样品的所述材料。

本发明还涉及通过显微技术对生物样品进行成像的方法，该方法包括使用本发明的包埋剂和/或导电材料。

背景技术：

显微技术是指用于观察肉眼无法达到的目标和目标区域的一组技术。在众所周知的显微镜技术中，电子显微技术对于观察生物材料是有用的。由于电子束或电磁辐射直接与待观察样品相互作用产生的衍射、反射或折射，因此该技术可产生振幅或相位对比图像。

迄今为止，只有通过添加基本上由重金属盐和固定剂(例如醛)组成的造影剂，才可能获得良好的振幅对比。

任何样品的高分辨率电子显微技术可视化还包括诸如固定之类的复杂制备步骤，从而使样品在显微技术分析过程中与天然样品最接近，同时保持免受电子显微技术高真空的影响。

生物材料的固定可以通过化学方法(添加固定剂，如醛类)或物理方法(超快冷冻方法以实现生物材料中水分的玻璃化或无定形固定)来实现。

特别地，为了实现固定后的天然生物材料的观察，已经开发了用聚合物树脂代替固定的生物样品的水，以保护其免受真空的影响，同时对其进行加强以允许通过超薄切片术进行薄切片。

然而，使用固定剂和造影剂会导致：1)样品制备过程中受污染的废物后处理问题；2)生物学特性改变；和3)成像过程中电荷疏散不良。实际上，固定剂和重金属盐具有毒性、致突变性、致癌性和/或放射性。它们部分或完全改变在刺激后的荧光发射的生物学特性或蛋白活性或掩盖用于进行免疫检测的抗原。此外，重金属盐仅在成像期间捕获电子，而在实现显微技术底片的过程中不允许释放积聚在样品表面上的电荷。结果，电荷在样品表面上局部积聚，从而导致在样品周围形成光晕并妨碍了完全成像。因此，难以制成底片。

例如，在透射电子显微技术(tem)或电子断层成像术中，这种超负荷极大地改变了焦平面，并且在错误的焦点处获得了图像。在扫描电子显微技术(sem)中，电子过载在样品表面产生白色光晕。

已经开发出替代的解决方案。一种解决方案是通过大量使用重金属盐和通过改善低电子成像参数来减少产生的电荷效应(deerinck等人，2010)。但是，该方法非常苛刻，不适用于多种生物样品，并且要求在室温下工作，从而无法通过冷冻固定实现最佳的超微结构保存。尤其是，该方法可以突出大部分膜或细胞壁，但导致大量提取不包括与其余生物成分有关的所有信息。

另一解决方案在于将重金属盐的使用与薄的碳膜或通过蒸发的金属沉积相关联，后者使得提供电子放电成为可能。然而，该方法需要额外的步骤来制备样品并仅在样品的周围排空电荷。另外，重金属盐的量仍然导致随后需要废物再处理。

因此，需要提供一种更有效的方法来制备用于电子显微技术成像的生物样品。特别地，需要提供更有效的生物材料包埋剂，其能够减少对造影剂和/或它们的生物学效应的需求，同时在通过电子显微技术成像的过程中使样品的对比度最大化，以尽可能获得最佳质量的图像。

在可商购获得的树脂中，树脂具有在电子束作用下几乎不升华的优点。此外，根据产品的不同，这些树脂的前体溶液(即聚合前)在低至-35℃或-70℃的温度下仍保持流体状态，从而使其与用于玻璃固化生物样品分析的快速冷冻和冷冻置换方法兼容。迄今为止，快速冷冻被认为是最接近天然生物材料的固定方法，广泛用于定性和定量分析。

然而，树脂不导电，导致在电子显微技术分析过程中不能令人满意地观察样品，特别是如果在样品制备过程中使用的造影剂含量太少时。

因此，还需要提供在室温或低温下包埋后用电子显微技术成像期间能够有效地排空样品和/或包埋剂表面上积聚的电荷的生物材料包埋剂。还需要提供更有效的生物材料包埋剂，其能够在其电子显微技术成像期间保持良好的稳定性和/或物理完整性。还需要提供能够大幅度减少所使用的重金属盐或镧系元素盐的量的包埋剂。因此，还需要提供能够在显微技术分析时保留最佳超微结构的生物材料包埋剂。

荧光显微技术可以有效靶向生物样品从而进一步优化电子显微技术在生物学研究中的使用。固定剂和/或造影剂的使用显著降低了荧光性和包埋到树脂中的蛋白质的天然性质。环氧树脂例如与蛋白质的胺基相互作用，阻止了它们进一步作为蛋白质的能力。树脂或丙烯酸酯树脂不与生物物质发生交叉反应，并能保护其共振特性。

因此，需要提供一种非生物相互作用的包埋剂，其可以有效地保留被包埋的生物样品的天然荧光性，同时保留潜在电子显微技术(em)的对比度。

出乎意料地，申请人已经证明，由选自二醇二甲基丙烯酸酯、聚亚烷基二醇二丙烯酸酯和/或聚亚烷基二醇甲基丙烯酸酯的单体混合物的聚合得到的亲水树脂提供了一种有效的包埋剂，解决上述现有技术的问题。

有利地，保留了本发明包埋剂中包括的生物样品的超微结构以及荧光性。有利地，用本发明的包埋剂获得的成像对比度大于使用商业树脂获得的图像对比度。

技术实现要素：

因此，本发明涉及一种用于生物样品的导电包埋剂，其包含：

-60重量％至99重量％的二醇二甲基丙烯酸酯，其选自亚烷基二醇二甲基丙烯酸酯和/或低聚(亚烷基二醇)二甲基丙烯酸酯；

-聚亚烷基二醇二丙烯酸酯或聚亚烷基二醇甲基丙烯酸酯；所述聚亚烷基二醇二丙烯酸酯或聚亚烷基二醇甲基丙烯酸酯任选地被至少一个亲水基团取代，亲水基团例如羟基、氨基或羰基基团；

-至少一种添加剂，优选包含至少一种重金属盐或镧系元素盐；和

-自由基聚合引发剂。

根据一个实施方案，用于生物样品的导电包埋剂包含：

-60重量％至99重量％的二醇二甲基丙烯酸酯，其选自亚烷基二醇二甲基丙烯酸酯和/或低聚(亚烷基二醇)二甲基丙烯酸酯；

-0重量％至38重量％的聚亚烷基二醇二丙烯酸酯或聚亚烷基二醇甲基丙烯酸酯；所述聚亚烷基二醇二丙烯酸酯或聚亚烷基二醇甲基丙烯酸酯任选地被至少一个亲水基团取代，亲水基团例如羟基、氨基或羰基基团；和

-0.1重量％至2重量％的自由基聚合引发剂。

根据一个实施方案，二醇二甲基丙烯酸酯选自乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙二醇二甲基丙烯酸酯、三乙二醇二甲基丙烯酸酯、丙二醇二甲基丙烯酸酯和丁二醇二甲基丙烯酸酯；优选地，二醇二甲基丙烯酸酯是三乙二醇二甲基丙烯酸酯。

根据一个实施方案，聚亚烷基二醇二丙烯酸酯选自聚乙二醇二丙烯酸酯、聚丙二醇二丙烯酸酯和聚丁二醇二丙烯酸酯；优选地，聚亚烷基二醇二丙烯酸酯是聚丙二醇二丙烯酸酯。

根据一个实施方案，聚亚烷基二醇甲基丙烯酸酯选自聚乙二醇甲基丙烯酸酯、聚丙二醇甲基丙烯酸酯和聚丁二醇甲基丙烯酸酯；所述聚亚烷基二醇甲基丙烯酸酯任选地被至少一个亲水基团取代，所述亲水基团例如羟基、氨基或羰基基团；优选地，聚亚烷基二醇甲基丙烯酸酯是羟基聚乙二醇甲基丙烯酸酯。

根据一个实施方案，自由基聚合引发剂为光引发剂或热引发剂，优选自由基聚合引发剂为光引发剂，更优选为安息香甲基醚或2-羟基-2-甲基-1-苯基-丙烷-1-酮。

根据一个实施方案，导电包埋剂包含：

-60重量％至99重量％的三乙二醇二甲基丙烯酸酯；

-大于0重量％至38重量％的聚丙二醇二丙烯酸酯；和

-0.1重量％至2重量％的自由基聚合引发剂。

根据一个实施方案，导电包埋剂包含：

-60重量％至99重量％的三乙二醇二甲基丙烯酸酯；

-大于0重量％至38重量％的羟基聚乙二醇甲基丙烯酸酯；和

-0.1重量％至2重量％的自由基聚合引发剂。

根据一个实施方案，导电包埋剂包含至少一种重金属盐，更优选包含乙酸锇和/或乙酸铀酰。

根据一个实施方案，导电包埋剂还包含至少一种生物样品，优选为玻璃固化和/或化学固定和/或脱水的生物样品。

本发明还涉及一种导电成像材料，其包含至少一种生物样品，该生物样品包埋在由如上所述的包埋剂聚合产生的聚合物基质中。

根据一个实施方案，导电材料保留了被包埋的生物样品的内部荧光性、蛋白质活性和/或抗原特异性。

本发明还涉及通过显微技术对生物样品进行成像的方法，其包括以下步骤：

(i-1)固定和/或脱水生物样品；

(ii)将如上定义的导电包埋剂浸润到步骤(i-1)的生物样品中；

(iii)聚合在步骤(ii)中获得的混合物，得到导电成像材料；

(iv)通过光学显微技术和/或电子显微技术对步骤(iii)的导电成像材料进行成像。

根据一个实施方案，该方法还包括在导电成像材料上进行切片或超薄切片的步骤。

本发明还涉及如上定义的包埋剂或如上定义的导电成像材料在通过显微技术，优选通过光学显微技术和/或电子显微技术对生物样品进行成像中的用途。

本发明还涉及用于制备将通过显微技术成像的生物样品的试剂盒，其包含：

-第一容器，其包含(a)选自亚烷基二醇二甲基丙烯酸酯和/或低聚(亚烷基二醇)二甲基丙烯酸酯的二醇二甲基丙烯酸酯；和(b)聚亚烷基二醇二丙烯酸酯或聚亚烷基二醇甲基丙烯酸酯，所述聚亚烷基二醇二丙烯酸酯或聚亚烷基二醇甲基丙烯酸酯任选地被至少一个亲水基团取代，亲水基团例如羟基、氨基或羰基基团；

-第二容器，其包含自由基聚合引发剂；

或包含：

容器，其包含(a)选自亚烷基二醇二甲基丙烯酸酯和/或低聚(亚烷基二醇)二甲基丙烯酸酯的二醇二甲基丙烯酸酯；(b)聚亚烷基二醇二丙烯酸酯或聚亚烷基二醇甲基丙烯酸酯，所述聚亚烷基二醇二丙烯酸酯或聚亚烷基二醇甲基丙烯酸酯任选地被至少一个亲水基团取代，亲水基团例如羟基、氨基或羰基基团；和(c)自由基聚合引发剂；

和混合装置。

定义

在本发明中，以下术语具有以下含义：

-“约”：在数字之前是指所述数字值的正负10％。

-“丙烯酸酯”：是指具有至少一个ch2＝ch-coo-基团的乙烯基单体。

-“氨基”：是指通过用有机基团取代一个或多于一个氢原子而衍生自氨nh3的任何化合物。氨基优选是指–nh2、-nhr和-nrr'，其中r和r'优选是烷基。因此，“氨基”包括单烷基氨基和二烷基氨基。

-“生物样品”：是指从动物或植物或活的人体中收集的任何生物材料，例如细胞提取物、细胞、组织或器官。生物样品不涉及植入物。

-“包埋剂”是指将生物样品放入其中的介质，以便可以直接或在使用切片机或超薄切片机切割后通过使用显微技术对所得材料进行成像。包埋剂不涉及用作植入物的物体或金属。

-“二醇”：是指具有至少一个二醇基团并且其每个羟基位于不同碳原子上的任何有机化合物。根据一个实施方案，二醇化合物的每个羟基位于所述二醇化合物的一端。根据一个实施方案，二醇具有至少一个邻位二醇，即，两个羟基连接至相邻的碳原子。二醇化合物包括亚烷基二醇，例如乙二醇、丙二醇或丁二醇；低聚(亚烷基二醇)，例如二乙二醇、三乙二醇或四乙二醇；和聚亚烷基二醇，例如聚(乙二醇)、聚(丙二醇)或聚(丁二醇)。

-“二醇丙烯酸酯”：是指其中所述二醇的两个羟基官能团之一与丙烯酸或丙烯酰卤反应以提供具有羟基官能团和丙烯酸酯基团的化合物的任何二醇化合物。术语“二醇丙烯酸酯”包括亚烷基二醇丙烯酸酯、低聚(亚烷基二醇)丙烯酸酯和聚亚烷基二醇丙烯酸酯。

-“二醇二丙烯酸酯”：是指其中所述二醇的两个羟基官能团与丙烯酸或丙烯酰卤反应以提供具有两个丙烯酸酯基团的化合物的任何二醇化合物。术语“二醇二丙烯酸酯”包括亚烷基二醇二丙烯酸酯、低聚(亚烷基二醇)二丙烯酸酯和聚亚烷基二醇二丙烯酸酯。

-“二醇二甲基丙烯酸酯”：是指其中所述二醇的两个羟基官能团与甲基丙烯酸或甲基丙烯酰卤反应以提供具有两个甲基丙烯酸酯基团的化合物的任何二醇化合物。术语“二醇二甲基丙烯酸酯”包括亚烷基二醇二甲基丙烯酸酯、低聚(亚烷基二醇)二甲基丙烯酸酯和聚亚烷基二醇二甲基丙烯酸酯。

-“二醇甲基丙烯酸酯”：是指其中所述二醇的两个羟基官能团之一与甲基丙烯酸或甲基丙烯酰卤反应以提供具有羟基官能团和甲基丙烯酸酯基团的化合物的任何二醇化合物。术语“二醇甲基丙烯酸酯”包括亚烷基二醇甲基丙烯酸酯、低聚(亚烷基二醇)甲基丙烯酸酯和聚亚烷基二醇甲基丙烯酸酯。

-“重金属盐”：是指包含重金属(即具有相对较高的密度、原子量或原子序数的金属)的任何盐。根据一个实施方案，重金属选自铁、钴、锌、钌、银、铟、镉、汞、铅、铀、锇和铜。

-“亲水”：定义分子或分子的一部分，该分子或分子的一部分通常具有极化的电荷并能够通过氢键结合，使其比油或其他溶剂更易溶于水。

-“羟基”：指化学官能团-oh。

-“引发剂”：是指能够引发聚合反应，优选自由基聚合的任何化合物。在本发明中，引发剂提供能够与第一乙烯基单体单元反应的自由基实体，从而引发聚合物链的生长。

-是指基于丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯树脂的可商购获得的包埋剂。hm20是指一种非极性包埋剂，其包含或构成为2-丙烯酸-2-甲基-1,2-乙烷二基双(氧-2,1-乙烷二基)酯(cas106-16-0)；2-丙酸-2-甲基乙酯(cas97-63-2)；甲基丙烯酸正己酯和任选的4-甲氧基苯酚和/或苯乙酮-2-甲氧基-2-苯基(cas3524-62-7)。根据一个实施方案，术语“lowicryl”包括可商购获得的产品hm20、hm21和hm23。

-“大分子单体”：是指具有至少一个能够充当单体的端基的聚合物链。根据一个实施方案，术语

-“基质”：是指化学网络，优选有机化学网络，更优选有机聚合物网络。根据一个实施方案，该网络是共价交联的。

-“成像材料”：是指包埋生物样品的固体或半固体，适合用于通过显微技术的分析。

-“甲基丙烯酸酯”：是指具有至少一个ch2＝c(ch3)-coo-基团的乙烯基单体。

-“显微技术”：指涵盖使用显微技术对物体成像的一般领域。

-“切片术”：是指制备用于显微技术研究的对象的方法，所述方法包括使用切片机或超薄切片机(即适合于将要通过显微技术分析的样品薄切的设备)。根据一个实施方案，术语“切片术”包括聚焦离子束铣削技术。

-“电子显微技术”：是指使用加速电子束作为样品照射源并提供放大图像的显微技术。

-“光学显微技术”是指使用波长受控的光子束作为样品照射源并提供放大图像的显微技术。

-“导电”：是指任何能够传导电子的材料或化合物。根据一个实施方案，术语“导电”是指能够使积聚在其表面上的电子疏散的材料或化合物。

-“冷冻置换”：是指生物样品的脱水过程，该过程在足够低的温度下进行，以避免形成冰晶并避免相同样品在环境温度下脱水后观察到的破坏作用。在本发明中，冷冻置换过程是指首先将样品的冷冻水通过有机溶剂溶解的过程，所述有机溶剂任选地包含化学固定剂；然后，将样品包埋在树脂中；最后，将样品逐渐加热以进行显微技术成像。

-“高压冷冻”：是指生物样品在高压下，优选在2000巴至2700巴的压力，更优选在约2048巴的压力下进行的冷冻固定方法。

-“羰基”：指化学官能团-c(o)-。

-“聚合物”：是指由重复单元(单体)组成的大分子化合物。根据一个实施方案，术语“聚合物”是指由重复单元组成的有机大分子化合物。

-“光引发剂”：是指当暴露于辐照(uv或可见光)时能够引发聚合反应，优选自由基聚合的任何化合物。在本发明中，当暴露于辐射时，光引发剂提供能够与第一乙烯基单体单元反应的自由基实体，从而引发聚合物链的生长。

-“自由基聚合”是指其中通过连续添加自由基单体来实现聚合物链的生长的任何聚合反应技术。在本发明中，表述“自由基聚合”是指提供聚合物的方法，其包括以下三个步骤：(1)引发、(2)传递和(3)终止，这是技术人员众所周知的。

-“热引发剂”：是指当暴露于热时能够引发聚合反应，优选自由基聚合的任何化合物。在本发明中，当暴露于热时，热引发剂提供能够与第一乙烯基单体单元反应的自由基实体，从而引发聚合物链的生长。

-“超薄切片术”：是指制备用于通过显微技术研究的对象的方法，该方法包括使用超薄切片机(即装有金刚石刀或玻璃刀的设备，适用于将样品超薄切片以进行显微技术分析)。

-“玻璃固化”：是指将生物材料转化为含有无定形水的固体的过程，在该过程中所有细胞成分均保持为接近生命状态。在本发明中，表述“玻璃固化的生物样品”是指玻璃固化后获得的生物样品。

发明详述

包埋剂

本发明涉及包埋剂，优选地是用于生物样品的包埋剂，甚至更优选地是用于浸润和浸渍生物样品的包埋剂。根据一个实施方案，本发明涉及一种用于生物样品成像的包埋剂，优选通过显微技术，更优选通过电子显微技术。根据一个实施方案，包埋剂是导电的。

根据一个实施方案，包埋剂是包含或构成为有机化合物的组合物。

根据一个实施方案，包埋剂包含或构成为聚合物前体制剂。根据一个实施方案，包埋剂包含或构成为单体混合物和任选的引发剂。

根据一个实施方案，包埋剂包含或构成为单体混合物，其中至少一种单体具有式(i)：

其中：

r1表示h、直链或带支链的烷基，优选r1表示h或甲基；

r2表示h、甲基丙烯酰基、丙烯酰基、直链或带支链的烷基，优选r1

表示h、甲基丙烯酰基或丙烯酰基；

ra、rb、rc和rd各自独立地选自h、直链或带支链的烷基，优选选自h或甲基；

n是正整数。

根据一个实施方案，包埋剂包含或构成为单体混合物，其包括：

-具有式(ii-a)的单体：

-具有式(ii-b)的单体：

和/或

-具有式(ii-c)的单体：

其中：

r1表示h、直链或带支链的烷基，优选r1表示h或甲基；

r2表示h、甲基丙烯酰基、丙烯酰基、直链或带支链的烷基，优选r1表示h、甲基丙烯酰基或丙烯酰基；

ra表示h、直链或带支链的烷基；优选选自h或甲基；

n1为1至5的正整数，优选为3；

n2和n3各自独立地表示大于5的正整数，优选为10至100，更优选为10至40。

根据一个实施方案，单体混合物包含或构成为至少一种单体，优选至少一种自由基可聚合的单体，更优选至少一种亲水自由基可聚合的单体。根据一个实施方案，包埋剂包含或构成为至少一种亲水单体。根据一个实施方案，包埋剂包含或构成为两种自由基可聚合的单体的混合物。

根据一个实施方案，自由基可聚合的单体选自丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、二丙烯酸酯和/或二甲基丙烯酸酯，所述基团任选地被至少一个亲水基团例如羟基、氨基或羰基基团取代。

根据一个实施方案，包埋剂包含：

-聚亚烷基二醇(二)丙烯酸酯或聚亚烷基二醇(二)甲基丙烯酸酯，所述聚亚烷基二醇二丙烯酸酯或聚亚烷基二醇甲基丙烯酸酯任选地被至少一个亲水基团取代，亲水基团例如羟基、氨基或羰基基团；和

-引发剂。

根据一个实施方案，包埋剂包含：

-亚烷基二醇二甲基丙烯酸酯；

-聚亚烷基二醇二丙烯酸酯或聚亚烷基二醇甲基丙烯酸酯，所述聚亚烷基二醇二丙烯酸酯或聚亚烷基二醇甲基丙烯酸酯任选地被至少一个亲水基团取代，亲水基团例如羟基、氨基或羰基基团；和

-引发剂。

根据一个实施方案，包埋剂不包含甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯(dema)、甲基丙烯酸羟乙酯(hema)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚(乳酸-co-乙醇酸)(plga)、聚乳酸(pla)或聚乙二醇(peg)。

根据一个实施方案，单体混合物包含或构成为一种二丙烯酸酯和一种二甲基丙烯酸酯，优选一种二醇二丙烯酸酯和一种二醇二甲基丙烯酸酯；所述二醇二丙烯酸酯和/或二醇二甲基丙烯酸酯任选地被至少一个亲水基团取代，亲水基团例如羟基、氨基或羰基基团。

根据一个实施方案，单体混合物包含或构成为一种或多于一种亚烷基二醇二甲基丙烯酸酯和一种聚亚烷基二醇二丙烯酸酯，所述亚烷基二醇二甲基丙烯酸酯和/或聚亚烷基二醇二丙烯酸酯任选地被至少一个亲水基团取代，亲水基团例如羟基、氨基或羰基基团。

根据一个实施方案，单体混合物包含或构成为一种亚烷基二醇二甲基丙烯酸酯和一种聚亚烷基二醇甲基丙烯酸酯，所述亚烷基二醇二甲基丙烯酸酯和/或聚亚烷基二醇甲基丙烯酸酯任选地被至少一个亲水基团取代，亲水基团例如羟基、氨基或羰基基团。

根据一个实施方案，亚烷基二醇二甲基丙烯酸酯选自乙二醇二甲基丙烯酸酯、丙二醇二甲基丙烯酸酯和丁二醇二甲基丙烯酸酯；优选地，亚烷基二醇二甲基丙烯酸酯是乙二醇二甲基丙烯酸酯。

根据一个实施方案，聚亚烷基二醇甲基丙烯酸酯选自聚乙二醇甲基丙烯酸酯、聚丙二醇甲基丙烯酸酯和聚丁二醇甲基丙烯酸酯，所述聚亚烷基二醇甲基丙烯酸酯任选地被至少一个亲水基团取代，所述亲水基团例如羟基、氨基或羰基基团；优选地，聚亚烷基二醇甲基丙烯酸酯是羟基聚乙二醇甲基丙烯酸酯。

根据一个实施方案，单体混合物包含或构成为三乙二醇二甲基丙烯酸酯(tgdma)和聚丙二醇二丙烯酸酯(ppgda)。根据一个实施方案，包埋剂包含或构成为三乙二醇二甲基丙烯酸酯、聚丙二醇二丙烯酸酯和引发剂。

根据一个实施方案，引发剂是自由基聚合引发剂。根据一个实施方案，引发剂是光引发剂。根据一个实施方案，引发剂是热引发剂。

根据一个实施方案，光引发剂选自2-叔丁基蒽醌、樟脑醌、二苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)氧化膦、9,10-菲醌、苯基双(2,4,6-三甲基苯甲酰基)氧化膦、2-苄基-2-(二甲基氨基)-4'-吗啉代苯丁酮、3,6-双(2-甲基-2-吗啉代丙酰基)-9-辛基咔唑、4'-叔丁基-2',6'-二甲基苯乙酮、2,2-二乙氧基苯乙酮、4'-乙氧基苯乙酮、3'-羟基苯乙酮、4'-羟基苯乙酮、1-羟基环己基苯丙酮、2-羟基-4'-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮、2-羟基-2-甲基苯丙酮、2-甲基-4'-(甲硫基)-2-吗啉代苯丙酮、4'-苯氧基苯乙酮、安息香、安息香乙基醚、安息香甲基醚、4,4'-二甲基安息香、4,4'-二甲基二苯二酮、二苯甲酮、苯甲酰基联苯、4,4'-双(二乙氨基)二苯甲酮、4,4'-二羟基二苯甲酮、3,4-二甲基二苯甲酮、3-羟基二苯甲酮、4-羟基二苯甲酮、2-甲基二苯甲酮、3-甲基二苯甲酮、4-甲基苯甲酮、苯甲酰甲酸甲酯、米歇尔酮、1-氯-4-丙氧基-9h-噻吨-9-酮、2-氯噻吨-9-酮、2,4-二乙基-9h-噻吨-9-酮、异丙基-9h-噻吨-9-酮、10-甲基吩噻嗪、噻吨-9-酮、六氟磷酸二芳基碘鎓盐、六氟锑酸二芳基碘鎓盐、六氟磷酸三芳基碘鎓盐、六氟磷酸盐和六氟锑酸三芳基锍盐。

根据一个实施方案，热引发剂选自偶氮化合物，例如2,2'-偶氮二(异丁腈)(aibn)、4,4'-偶氮二-(4-氰基戊酸)、1,1'-偶氮二(环己烷腈)、2,2'-偶氮二(2-甲基丙基脒)二盐酸盐、2,2'-偶氮二(2-甲基丙腈)；以及有机过氧化物，例如过氧化苯甲酰(bpo)。

根据一个实施方案，亚烷基二醇二甲基丙烯酸酯或其任何衍生物为包埋剂总重量的60重量％至99重量％，优选65重量％至99重量％，70重量％至99重量％，75重量％至99重量％，80重量％至99重量％，85重量％至99重量％，90重量％至99重量％。根据一个实施方案，亚烷基二醇二甲基丙烯酸酯为包埋剂总重量的60重量％至99重量％，优选60重量％至90重量％，60重量％至85重量％，60重量％至80重量％，60重量％至75重量％，60重量％至70重量％。根据一个实施方案，亚烷基二醇二甲基丙烯酸酯为包埋剂总重量的约60重量％、61重量％、62重量％、63重量％、64重量％、65重量％、66重量％、67重量％、6重量％、69重量％、70重量％、71重量％、72重量％、73重量％、74重量％、75重量％、76重量％、77重量％、78重量％、79重量％、80重量％、81重量％、82重量％、83重量％、84重量％、85重量％、86重量％、87重量％、88重量％、89重量％、90重量％、91重量％、92重量％、93重量％、94重量％、95重量％、96重量％、97重量％、98重量％或99重量％。根据一个实施方案，亚烷基二醇二甲基丙烯酸酯或其任何衍生物为包埋剂总重量的70重量％至90重量％，75重量％至85重量％，更优选为80重量％。

根据一个实施方案，亚烷基二醇二甲基丙烯酸酯或其任何衍生物为包埋剂总重量的0.1重量％至100重量％；优选0.1重量％至90重量％；1重量％至90重量％；10重量％至90重量％；15重量％至90重量％；20重量％至90重量％；25重量％至90重量％；30重量％至90重量％；35重量％至90重量％；40重量％至90％；45％至90％；50％至90％；55％至90％；60％至90％；65重量至90重量％；70重量％至90重量％；75重量％至90重量％；80重量％至90重量％；或85重量％至90重量％。根据一个实施方案，亚烷基二醇二甲基丙烯酸酯为包埋剂总重量的0.1重量％至99重量％；优选0.1重量％至95重量％，0.1重量％至90重量％，0.1重量％至85重量％，0.1重量％至80重量％，0.1重量％至75重量％，0.1重量％至70重量％，0.1重量％至65重量％，0.1重量％至60重量％，0.1重量％至55重量％，0.1重量％至50重量％，0.1重量％至45重量％，0.1重量％至40重量％，0.1重量％至35重量％，从0.1重量％至30重量％，0.1重量％至25重量％，0.1重量％至20重量％，0.1重量％至15重量％，0.1重量％至10重量％或0.1重量％至5重量％。

根据一个实施方案，聚亚烷基二醇二丙烯酸酯或其任何衍生物为包埋剂总重量的大于0重量％至38重量％，优选为1重量％至38重量％，5重量％至38重量％，10重量％至38重量％，15重量％至38重量％，20重量％至38重量％，25重量％至38重量％，30重量％至38重量％。根据一个实施方案，聚亚烷基二醇二丙烯酸酯或其任何衍生物为包埋剂总重量的大于0重量％至38重量％，优选为1重量％至35重量％，1重量％至30重量％，1重量％至25重量％，1重量％至20重量％，1重量％至15重量％，1重量％至10重量％，1重量％至5重量％。

根据一个实施方案，聚亚烷基二醇二丙烯酸酯或其任何衍生物为包埋剂总重量的大于0重量％至50重量％，优选为0.1重量％至50重量％，5重量％至50重量％，10重量％至50重量％，15重量％至50重量％，20重量％至50重量％，25重量％至50重量％，30重量％至50重量％，35重量％至50重量％，40重量％至50重量％或45重量％至50重量％。根据一个实施方案，聚亚烷基二醇二丙烯酸酯为包埋剂总重量的大于0重量％至50重量％，优选为0.1重量％至45重量％，0.1重量％至40重量％，0.1重量％至35重量％，0.1重量％至30重量％，0.1重量％至25重量％，0.1重量％至20重量％，0.1重量％至15重量％，0.1重量％至10重量％或0.1重量％至5重量％。根据一个实施方案，聚亚烷基二醇二丙烯酸酯为包埋剂总重量的大于0重量％至50重量％，优选为1重量％至40重量％，5重量％至30重量％，更优选10重量％至25重量％，更优选20重量％。

根据一个实施方案，聚亚烷基二醇甲基丙烯酸酯或其任何衍生物为包埋剂总重量的大于0重量％至38重量％，优选为1重量％至38重量％，5重量％至38重量％，10重量％至38重量％，15重量％至38重量％，20重量％至38重量％，25重量％至38重量％，30重量％至38重量％。根据一个实施方案，聚亚烷基二醇甲基丙烯酸酯或其任何衍生物为包埋剂总重量的大于0重量％至38重量％，优选为1重量％至35重量％，1重量％至30重量％，1重量％至25重量％，1重量％至20重量％，1重量％至15重量％，1重量％至10重量％，1重量％至5重量％。

根据一个实施方案，所述亚烷基二醇二丙烯酸酯或其任何衍生物的摩尔重量为100kda至500kda；优选为100kda至400kda，100kda至300kda，100kda至200kda。根据一个实施方案，亚烷基二醇二丙烯酸酯或其任何衍生物的摩尔重量为约150kda，优选为150kda。根据一个实施方案，三乙二醇二甲基丙烯酸酯(tgdma)的摩尔重量为约150kda，优选为150kda。

根据一个实施方案，聚亚烷基二醇二丙烯酸酯或其任何衍生物的摩尔重量为500kda至1500kda，优选为500kda至100kda，700kda至900kda，750kda至850kda。根据一个实施方案，聚亚烷基二醇二丙烯酸酯或其任何衍生物的摩尔重量为约800kda。根据一个实施方案，聚亚烷基二醇二丙烯酸酯或其任何衍生物的摩尔重量为800kda。根据一个实施方案，聚丙二醇二丙烯酸酯的摩尔重量为约800kda，优选为800kda。

根据一个实施方案，包埋剂包含或构成为：

-79％重量的一种亚烷基二醇二甲基丙烯酸酯，优选三乙二醇二甲基丙烯酸酯；

-20％重量的一种聚亚烷基二醇二丙烯酸酯，优选聚丙二醇二丙烯酸酯；和

-1％重量的自由基聚合引发剂，优选自由基聚合光引发剂，更优选安息香甲基醚。

根据一个实施方案，包埋剂包含：

-60重量％至99重量％的三乙二醇二甲基丙烯酸酯；

-大于0重量％至38重量％的聚丙二醇甲基丙烯酸酯；和

-0.1重量％至2重量％的自由基聚合引发剂；优选安息香甲基醚。

根据一个实施方案，包埋剂包含：

-98重量％至99.9重量％的三乙二醇二甲基丙烯酸酯；

-0.1重量％至2重量％的自由基聚合引发剂；优选安息香甲基醚。

根据一个实施方案，包埋剂包含：

-60重量％至99重量％的三乙二醇二甲基丙烯酸酯；

-大于0重量％至38重量％的羟基聚丙二醇甲基丙烯酸酯；和

-0.1重量％至2重量％的自由基聚合引发剂；优选安息香甲基醚。

根据一个实施方案，包埋剂还包含溶剂，优选为挥发性溶剂，更优选为醇，例如乙醇。根据一个实施方案，包埋剂还包含丙酮。

根据一个实施方案，包埋剂还包含至少一种选自造影剂和/或用于冷冻置换的化合物例如固定剂和/或溶剂的添加剂，优选包含至少一种重金属盐，更优选包含硝酸银、乙酸锇和/或乙酸铀酰。根据一个实施方案，包埋剂还包含至少一种添加剂，其占包埋剂总重量的大于0重量％至5重量％。根据一个实施方案，包埋剂包含包埋剂总重量的0.5重量％。根据一个实施方案，包埋剂包含包埋剂总重量的0.01重量％。根据一个实施方案，用于冷冻置换的化合物选自丙酮、无水丙酮、乙酸铀酰、单宁酸、醛例如戊二醛或多聚甲醛；及其任何组合。根据一个实施方案，固定剂选自锇、四氧化锇、乙酸铀酰、戊二醛、多聚甲醛或其任何组合。根据一个实施方案，造影剂选自乙酸铀酰、铅衍生物、银衍生物、锇衍生物、镧系元素盐、单宁中所含的多酚、没食子酸和单宁酸。

根据一个实施方案，包埋剂还包含亲水化合物。

根据一个实施方案，包埋剂还包含至少一种生物样品，优选为玻璃固化的生物样品和/或化学固定的生物样品和/或脱水的生物样品。根据一个实施方案，生物样品是细胞提取物。根据一个实施方案，生物样品是细胞。根据一个实施方案，生物样品是组织。根据一个实施方案，生物样品是器官。根据一个实施方案，生物样品是海拉(hela)细胞。根据一个实施方案，生物样品是黑色素细胞。

根据一个实施方案，包埋剂是液体。根据一个实施方案，包埋剂是半固体。根据一个实施方案，包埋剂在低温下，优选在低于0℃的温度下，优选在-90℃至-10℃的温度下，更优选在-40℃至-20℃的温度下是可聚合的。根据一个实施方案，包埋剂在-70℃至-20℃的温度下，优选在-35℃、-40℃或-45℃的温度下是可聚合的。根据一个实施方案，包埋剂在-90℃至-10℃，优选-80℃至-10℃，-70℃至-10℃，-60℃至-10℃，-50℃至-10℃，-40℃至-10℃，-30℃至-10℃，或-20℃至-10℃的温度下是可聚合的。根据一个实施方案，包埋剂在-90℃至-10℃，优选-90℃至-20℃，-90℃至-30℃，-90℃至-40℃，-90℃至-50℃，-90℃至-60℃，-90℃至-70℃或-90℃至-80℃的温度下是可聚合的。

根据一个实施方案，包埋剂不是或不包含树脂。根据一个实施方案，包埋剂不包含苯酚或其衍生物。根据一个实施方案，无机材料不包含甲氧基苯酚。根据一个实施方案，无机材料不包含甲基丙烯酸烷基酯。根据一个实施方案，无机材料不包含甲基丙烯酸己酯。根据一个实施方案，包埋剂不包含双酚a或其衍生物。根据一个实施方案，无机材料不包含乙氧基化双酚a二甲基丙烯酸酯。

成像材料

本发明还涉及用于显微技术的支撑材料。根据一个实施方案，支撑材料是用于显微技术的材料，优选地是用于待成像的样品的包埋材料(称为“成像材料”)。根据一个实施方案，本发明的成像材料由如上所述的包埋剂的聚合产生。

根据一个实施方案，本发明的成像材料是导电的。根据一个实施方案，成像材料在显微技术分析过程中不会在其表面积聚任何电子。根据一个实施方案，本发明的成像材料是抗静电的。

根据一个实施方案，本发明的成像材料是透明的。根据一个实施方案，本发明的成像材料是半固体或固体。根据一个实施方案，本发明的成像材料包含或构成为交联的聚合物基质和任选的至少一种生物样品。根据一个实施方案，本发明的成像材料保留了被包埋的生物样品的物理性质，例如其荧光性和/或保留其蛋白质超微结构。根据一个实施方案，本发明的成像材料保留了被包埋的生物样品的蛋白质超微结构，使得用于免疫检测的抗体的检测可以通过显微技术成像。

根据一个实施方案，成像材料包含至少一种生物样品，其被包埋在聚合物基质中，该聚合物基质是由如上所述的包埋剂的聚合产生的。

根据一个实施方案，成像材料不包含环氧树脂。根据一个实施方案，成像材料不包含环氧基团。根据一个实施方案，成像材料不包含聚亚芳基醚。

包埋剂的制造方法

本发明还涉及一种用于制造如上所述的包埋剂的方法。

根据一个实施方案，所述方法包含或构成为混合：

-至少一种如上定义的单体，优选至少一种自由基可聚合单体，更优选至少一种亲水自由基可聚合单体；和

-如上所述的引发剂。

根据一个实施方案，所述方法包含或构成为混合：

-两种如上定义的单体，优选两种自由基可聚合单体，更优选两种亲水自由基可聚合单体以获得单体混合物；和

-任选的如上所述的引发剂。

根据一个实施方案，所述方法包含或构成为混合：

-亚烷基二醇二甲基丙烯酸酯；

-如上所述的引发剂。

根据一个实施方案，该方法还包括添加生物样品，例如细胞提取物、细胞、组织和/或器官；优选添加玻璃固化的生物样品和/或脱水的生物样品。根据一个实施方案，该方法还包括添加添加剂，例如重金属盐。根据一个实施方案，该方法还包括添加硝酸银和/或乙酸铀酰。

根据一个实施方案，制备包埋剂的方法在0℃至40℃的温度下进行；优选在5℃至30℃，10℃至30℃，15℃至30℃，20℃至30℃，25℃至30℃的温度下进行；更优选地，制备包埋剂的方法在约25℃的温度下进行。

成像材料的制造方法

本发明还涉及用于制造如上所述的成像材料的方法。

根据一个实施方案，所述方法包括：

(a)提供如上定义的包埋剂；和

(c)聚合包埋剂。

根据一个实施方案，所述方法还包括将包埋剂在生物样品上浸润。根据一个实施方案，所述方法包括：

(a)提供如上定义的包埋剂；

(b)将包埋剂在生物样品上浸润以提供被包埋的生物样品；和

(c)聚合步骤(b)的被包埋的生物样品。

根据一个实施方案，所述方法还包括玻璃固化生物样品。根据一个实施方案，所述方法包括：

(a-0)对生物样品进行玻璃固化以获得玻璃固化的生物样品；

(a)提供如上定义的包埋剂；

(b)将包埋剂在步骤(a-0)的玻璃固化的生物样品上浸润以提供被包埋的生物样品；和

(c)聚合步骤(b)的被包埋的生物样品。

根据一个实施方案，所述方法还包括将步骤(a-0)的玻璃固化的生物样品固定并脱水。根据一个实施方案，所述方法包括：

(a-0)对生物样品进行玻璃固化以获得玻璃固化的生物样品；

(a-1)将步骤(a-0)的玻璃固化的生物样品固定并脱水；

(a)提供如上定义的包埋剂；

(b)在步骤(a-1)的生物样品上浸润包埋剂以提供被包埋的生物样品；和

(c)聚合步骤(b)的被包埋的生物样品。

根据另一个实施方案，所述方法还包括将生物样品固定和脱水。根据一个实施方案，所述方法包括：

(a-1)将生物样品固定并脱水；

(a)提供如上定义的包埋剂；

(b)在步骤(a-1)的生物样品上浸润包埋剂以提供被包埋的生物样品；和

(c)聚合步骤(b)的被包埋的生物样品。

根据一个实施方案，步骤(a-0)通过本领域技术人员公知的低温方法进行，优选通过高压冷冻方法进行。

根据一个实施方案，步骤(a-1)通过本领域技术人员公知的任何方法进行，优选通过冷冻置换进行。根据一个实施方案，步骤(a-1)通过使用至少一种固定剂来进行，所述固定剂优选选自锇、四氧化锇、乙酸铀酰、多聚甲醛和醛例如戊二醛，或其任何组合。根据一个实施方案，步骤(a-1)通过使用至少一种造影剂来进行，所述造影剂优选选自重金属盐。根据一个实施方案，步骤(a-1)通过使用至少一种造影剂来进行，所述造影剂优选选自镧系盐。根据一个实施方案，造影剂选自乙酸铀酰、铅衍生物、银衍生物、锇衍生物、镧系元素盐、单宁中所含的多酚、没食子酸和单宁酸。根据一个实施方案，步骤(a-1)在-90℃至-30℃的温度下进行。根据一个实施方案，步骤(a-1)在-70℃至-20℃的温度下，优选在-35℃、-40℃或-45℃的温度下进行。根据一个实施方案，步骤(a-1)在-90℃至-30℃，优选-80℃至-40℃，或-60℃至-50℃的温度下进行。

根据一个实施方案，步骤(a)根据上述制备包埋剂的方法进行。

根据一个实施方案，聚合在-90℃至-10℃的温度下，优选在-40℃至-20℃的温度下进行。根据一个实施方案，聚合在-70℃至-20℃的温度下，优选在-35℃、-40℃或-45℃的温度下进行。根据一个实施方案，聚合在-90℃至-10℃，优选-80℃至-10℃，-70℃至-10℃，-60℃至-10℃，-50℃至-10℃，-40℃至-10℃，-30℃至-10℃或-20℃至-10℃的温度下进行。根据一个实施方案，聚合在-90℃至-10℃，优选-90℃至-20℃，-90℃至-30℃，-90℃至-40℃，-90℃至-50℃，-90℃至-60℃，-90℃至-70℃或-90℃至-80℃的温度下进行。

根据一个实施方案，通过加热和/或通过辐照，优选通过uv或可见光辐照引发聚合。

根据一个实施方案，造影剂的重量为成像材料总重量的0.005重量％至0.1重量％，优选0.005重量％至0.05重量％，0.005重量％至0.015重量％。根据一个实施方案，造影剂为成像材料总重量的约0.01重量％。根据一个实施方案，造影剂为成像材料总重量的0.01重量％。

通过(电子)显微技术对生物样品进行成像的方法

本发明还涉及通过显微技术，优选地通过光学和/或电子显微技术对生物样品进行成像的方法。

根据一个实施方案，本发明的方法包括或构成为以下步骤：

-提供如上定义的成像材料，优选通过用于制造如上定义的成像材料的方法进行；和

-对成像材料进行成像，优选通过显微技术，更优选通过光学显微技术和/或电子显微技术对成像材料进行成像。

根据一个实施方案，本发明的方法包括或构成为以下步骤：

(i-0)将生物样品玻璃固化，优选通过高压冷冻法、急速冷冻、喷射冷冻和/或猛击冷冻来实现；

(ii)优选通过使用冷冻置换方案将在步骤(i-0)的玻璃固化的生物样品上浸润如上定义的包埋剂；

(iii)聚合在步骤(ii)中获得的混合物，得到导电成像材料；

(iv)通过光学显微技术和/或电子显微技术对步骤(iii)的导电成像材料进行成像。

根据一个实施方案，本发明的方法包括或构成为以下步骤：

(ii)在生物样品上浸润如上定义的包埋剂，优选通过使用冷冻置换方案来进行；

(iii)聚合在步骤(ii)中获得的混合物，得到导电成像材料；

(iv)通过光学显微技术和/或电子显微技术对步骤(iii)的导电成像材料进行成像。

根据一个实施方案，该方法还包括在导电成像材料上进行切片或超薄切片的步骤。

根据一个实施方案，该方法还包括固定和/或脱水生物样品的步骤(步骤i-1)，优选在步骤(i-0)之后。根据一个实施方案，该方法还包括固定和/或脱水经玻璃固化的生物样品的步骤(步骤i-1)，优选在步骤(i-0)之后。根据一个实施方案，步骤(i-1)包括使用溶剂，优选丙酮和/或乙醇；所述溶剂包含固定剂和/或造影剂。根据一个实施方案，在-90℃至-30℃的温度下进行步骤(i-1)。

根据一个实施方案，步骤(iv)通过显微技术来实施；优选通过光显微技术、光学显微技术、荧光显微技术和/或电子显微技术来实施；更优选通过电子显微技术来实施。根据一个实施方案，步骤(iv)通过相关显微技术来实施。根据一个实施方案，步骤(iv)通过扫描电子显微技术(sem)来实施。根据一个实施方案，步骤(iv)通过透射电子显微技术(tem)来实施。根据一个实施方案，步骤(iv)通过相关光学和电子显微技术(clem)来实施。根据一个实施方案，步骤(iv)通过落射荧光、共聚焦、超分辨率或结构化照明显微技术(sim)来实施。

用途

本发明还涉及如上所定义的包埋剂或成像材料在显微技术中，优选在光学显微技术、荧光显微技术和/或电子显微技术中的用途；更优选在电子显微技术中的用途。根据一个实施方案，如上定义的包埋剂或成像材料在相关显微技术中是有用的。

根据一个实施方案，如上定义的包埋剂和/或成像材料对于生物样品，例如细胞提取物、细胞、组织和/或器官进行成像有用；优选对于玻璃固化的生物样品进行成像有用。

根据一个实施方案，如上定义的包埋剂和/或成像材料对于特异性地靶向细胞结构和/或黑色素有用。根据一个实施方案，包含银盐如硝酸银的如上定义的包埋剂和/或成像材料对于特异性靶向细胞结构，优选特异性靶向使用金偶联抗体标记的细胞结构和/或黑色素有用。根据一个实施方案，如上定义的包含银盐例如硝酸银的包埋剂和/或成像材料对于在低温，优选在低于0℃，更优选为-90℃至-10℃的温度下特异性靶向细胞结构和/或黑色素有用。

根据一个实施方案，如上定义的包埋剂和/或成像材料对于特异性地靶向抗体，优选与纳米级金纳米颗粒偶联的抗体有用。根据一个实施方案，如上定义的包埋剂和/或成像材料对于通过聚集被包埋在所述包埋剂和/或成像材料中的硝酸银来特异性靶向与纳米级金纳米颗粒偶联的抗体有用。根据一个实施方案，如上定义的包埋剂和/或成像材料对于在低温下，优选在低于0℃的温度下产生银增强反应有用。

试剂盒

本发明还涉及一种试剂盒，该试剂盒用于制备待成像，优选通过显微技术成像的生物样品。

根据一个实施方案，该试剂盒包括第一容器和第二容器，第一容器包括至少一种如上定义的单体；第二容器包括引发剂。根据一个实施方案，该试剂盒包括第一容器和第二容器，第一容器包括如上定义的亲水单体混合物；第二容器包括引发剂。

根据一个实施方案，所述试剂盒包括：

-第一容器，其包括(a)亚烷基二醇二甲基丙烯酸酯和(b)聚亚烷基二醇二丙烯酸酯或聚亚烷基二醇甲基丙烯酸酯，所述聚亚烷基二醇二丙烯酸酯或聚亚烷基二醇甲基丙烯酸酯任选地被至少一个亲水基团取代，亲水基团例如羟基、氨基或羰基基团；

-第二容器，其包括自由基聚合引发剂。

根据一个实施方案，所述试剂盒包括：

-第一容器，其包含(a)三乙二醇二甲基丙烯酸酯；和(b)聚(丙二醇)二丙烯酸酯；和

-第二容器，其包括安息香甲基醚或羟基-2-甲基苯丙酮。

根据一个实施方案，本发明还涉及一种试剂盒，该试剂盒包括容器和混合装置，所述容器包括至少一种单体和如上定义的引发剂。

根据一个实施方案，本发明还涉及一种试剂盒，其包括：

-容器，其包括(a)亚烷基二醇二甲基丙烯酸酯，(b)聚亚烷基二醇二丙烯酸酯或聚亚烷基二醇甲基丙烯酸酯，所述聚亚烷基二醇二丙烯酸酯或聚亚烷基二醇甲基丙烯酸酯任选地被至少一个亲水基团取代，亲水基团例如羟基、氨基或羰基基团；和(c)自由基聚合引发剂；和

-混合装置。

根据一个实施方案，混合装置例如但不限于：容器、胶囊、混合器和/或刮铲。

附图说明

图1是通过透射电子显微技术(tem)获得的包埋到本发明的包埋剂(图1a)或树脂(图1b)中的hela细胞的底片。

图2是通过聚焦离子束扫描电子显微技术(fib-sem)获得的包埋在本发明的包埋剂中的hela细胞的底片。

图3是包含秀丽隐杆线虫的本发明的成像材料的两次扫描电子显微技术(sem3view)图的对比，在冷冻置换过程中，使用0.01％的乙酸铀酰造影。a是包埋在本发明的包埋剂中的，b是包埋在树脂中的。第一底片显示出鲜明而均匀的对比。第二底片显示视为白色斑点的大量电荷，方形区域用于聚焦底片。电子积聚在方块的表面，不能清晰的成像。

图4是包埋在本发明的包埋剂中的秀丽隐杆线虫的显微技术底片。底片4a是通过扫描电子显微技术(sem)获得的；底片4b是通过绿色荧光蛋白(gfp)获得的；底片4c是通过红色荧光蛋白(rfp)获得的；底片4d是通过“透射光”获得的；底片4e是多通道图像。

图5是图4的荧光显微技术底片的放大图。底片5a是通过扫描电子显微技术(sem)获得的；底片5b是通过绿色荧光蛋白(gfp)获得的；底片5c是通过红色荧光蛋白(rfp)获得的；底片5d是多通道图像。

实施例

将参考以下实施例更详细地解释本发明。这些实施例意在代表本发明的具体实施方案，而不意在限制本发明的范围。

缩写

℃：摄氏度

cdcl3：氘代氯仿

clem：相关光学和电子显微技术

eq：当量

peg：聚乙二醇

ppgda：聚(丙二醇)二丙烯酸酯

g：克

h：小时

mmol：毫摩尔

mol：摩尔

nmr：核磁共振

tgdma：三乙二醇二甲基丙烯酸酯

uv：紫外

材料和方法

试剂、溶剂和原料购自sigmaaldrich，无需进一步纯化即可使用。

uv辐照

样品的uv辐照是通过使用fusionfusion的uv灯系统f300sheraeus或徕卡的afs-1或afs-2进行冷冻置换方案进行的(自动化的冷冻置换自动进行)。

第一部分-包埋剂的制备

实施例1：聚(丙二醇)二丙烯酸酯(ppgda)的合成

通过丙烯酰化反应合成ppgda：将800g/mol(20g，25mmol)的聚(丙二醇)和三乙胺(11.7g，115mmol)加入装有140ml二氯甲烷的圆底烧瓶中。将混合物冷却至5℃，并在磁力搅拌下滴加丙烯酰氯(9.5g，105mmol)。

根据所使用的聚(丙二醇)的分子量，必须调节三甲胺和丙烯酰氯的比例(每个羟基官能团分别为2.3当量和2.1当量)。

2小时后反应完成。过滤除去三乙胺盐，产物用碱性、酸和中性水洗涤几次。有机相用无水硫酸钠干燥并过滤。减压除去溶剂后，得到最终产物(20.7g，产率：91％)。

¹hnmr(cdcl3，300mhz)：6.43-6.35(2h，d，h-ch＝ch-)；6.15-3.06(2h，d，h-ch＝ch-)，5.81-5.78(2h，d，h-ch＝ch-)，5.18-5.02(2h，m，-c(o)-o-ch-ch2-)，3.83-3.18(42h，m，-ch(ch3)-ch2-)，3.83-3.18(42h，m，-ch(ch3)-ch2-o-)，1.39-0.99(42h，m，-ch(ch3)-ch2-o-).

实施例2：本发明包埋剂的制备

2.1.一锅法

制剂1

将三乙二醇二甲基丙烯酸酯(tgdma)、聚丙二醇二丙烯酸酯(ppgda)和引发剂，优选安息香甲基醚和/或羟基-2-甲基苯丙酮以79/20/1的质量比加入烧瓶中，并在室温下搅拌。将最终的包埋剂1远离光和/或热存储。

制剂2

将三乙二醇二甲基丙烯酸酯(tgdma)和引发剂，优选安息香甲基醚和/或羟基-2-甲基苯丙酮以99/1的质量比加入烧瓶中，并在室温下搅拌。将最终的包埋剂2远离光和/或热存储。

制剂3

将三乙二醇二甲基丙烯酸酯(tgdma)、羟基peg甲基丙烯酸酯和引发剂，优选安息香甲基醚和/或羟基-2-甲基苯丙酮以74/25/1的质量比加入烧瓶中，并在室温下搅拌。将最终的包埋剂3远离光和/或热存储。

制剂4

将三乙二醇二甲基丙烯酸酯(tgdma)、聚丙二醇二丙烯酸酯(ppgda)、硝酸银溶液(1.4mm)和引发剂，优选安息香甲基醚和/或羟基-2-甲基苯丙酮以72.4/18.1/9/0.5的质量比加入烧瓶中，并在室温下搅拌。将最终的包埋剂4远离光和/或热存储。

2.2.包含本发明的包埋剂的试剂盒

将三乙二醇二甲基丙烯酸酯(tgdma)和聚(丙二醇)二丙烯酸酯(ppgda)以79/20的质量比加入第一容器中，并在室温下搅拌。

在第二容器中储存引发剂，优选安息香甲基醚和/或羟基-2-甲基苯丙酮。

在混合第一容器和第二容器的内容物之后获得基质前体溶液，优选地，将混合物远离光和/或热。

第二部分-导电成像材料的制备及其电子显微技术成像

实施例3：制备用于显微技术分析的生物样品的方法

目的是包埋生物样品，以提供用于电子显微技术的荧光和/或导电生物成像材料。为此，申请人使用实施例2的包埋剂1进行了处理。

一般方法

步骤1-生物样品的玻璃固化和/或固定/脱水

首先，通过技术人员公知的任何低温方法对生物样品进行玻璃固化，然后在-90℃下加入可以是乙醇、甲醇或丙酮的溶剂(溶剂中的生物样品称为“冷冻置换混合物”)。任选地，可以添加化学固定剂和/或造影剂。化学固定剂的实例可以是锇、四氧化锇、乙酸铀酰、戊二醛和多聚甲醛。造影剂的实例可以是乙酸铀酰、铅衍生物、银衍生物、锇衍生物或单宁酸。

将生物样本在1分钟到数天的时间内保持在-90℃。然后，将温度缓慢升高至-40℃，并通过连续用纯溶剂洗涤除去冷冻置换混合物。获得了脱水的生物样品。

步骤2-包埋剂1的浸润

其次，将步骤1中获得的脱水的生物样品依次用包埋剂/溶剂的混合物浸润，直到仅用包埋剂溶液浸润。获得包含脱水的生物样品包埋到本发明的基质前体溶液中的组合物。

步骤3-聚合-导电生物成像材料的制备

然后通过光聚合或通过热聚合使在步骤2获得的组合物聚合。

在光聚合的情况下，在-40℃下通过在24小时至48小时的uv辐照引发组合物。然后，始终在uv辐照下将温度缓慢升至室温。在室温下额外辐照24小时，以实现生物样品内部的完全聚合。

获得了导电且保留荧光性的成像材料。

步骤4b(任选的)-切片术或超薄切片术

导电成像材料任选地通过切片术和/或超薄切片术制备，然后通过电子显微技术观察。

任选的其他步骤-光学显微技术

在该方法中，在通过电子显微技术观察之前，可以在步骤1至步骤4中的任何一个对导电成像材料进行光学显微技术分析。

第三部分-电子显微技术观察