胡黄连苷Ⅰ在制备防治肝纤维化的药物中的应用的制作方法

本发明属于医药及中药
技术领域：
，涉及胡黄连苷ⅰ的医药新用途，特别涉及胡黄连苷ⅰ在制备防治肝纤维化的药物中的应用。
背景技术：
：胡黄连(picrorhizascrophulariiflorapennell)为玄参科多年生草本植物，多年生草本，有毛。与黄连名称相似，且均为苦寒清热燥湿之品，善除胃肠湿热，同为治湿热泻痢之良药。现代药理研究表明，胡黄连具有保肝、利胆、抗真菌等作用。针对胡黄连的保肝利胆作用深入研究目前主要针对的是其中的胡黄连总苷或胡黄连ⅱ。胡黄连苷ⅰ(picrosidei)是一种天然的环烯醚萜类成分，存在于胡黄连中，是其主要的活性物质之一，其化学式为c24h28o11，分子量为492.47，目前针对胡黄连苷ⅰ(picrosidei)研究是比较缺乏的。肝纤维化是肝硬化的前驱过程，是各种慢性肝病发展到肝硬化的必经病理学过程。肝硬化是严重威胁人类健康的疾病，病人常常因各种并发症及肝功能衰竭而死亡。目前的研究普遍认为肝硬化是不可逆转的慢性进行性肝病，但肝纤维化是可逆性的病理改变。因此，抑制肝纤维化的发生发展是防止慢性肝病发展为肝硬化的关键，而对肝纤维化治疗的研究则具有重要的临床意义。迄今为止，针对肝纤维化机制的大量研究使得人们对肝纤维化的认识日益加深，但目前临床上尚无满意的防止肝纤维化形成和进展的药物。因此，开发一种能够临床上能够顺利防止肝纤维化形成和进展的药物极具现实意义。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术临床上尚无满意的防止肝纤维化形成和进展的药物的缺陷，提供一种能够临床上能够顺利防止肝纤维化形成和进展的药物—为传统的玄参科(scrophulariaceae)胡黄连(picrorhizascrophulariiflorapennell)提取物胡黄连苷ⅰ拓展新的应用领域。本发明将胡黄连苷ⅰ应用于肝纤维化的治疗，发现其具有明显效果，即胡黄连苷ⅰ对抗肝纤维化具有积极作用。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：胡黄连苷ⅰ在制备防治肝纤维化的药物中的应用。其中，胡黄连苷ⅰ提取自玄参科胡黄连属胡黄连，胡黄连苷ⅰ为环烯醚萜类化合物，分子式为：c24h28o11，结构式如下所示：本发明研究发现，胡黄连苷ⅰ不仅能使肝损伤大鼠血清碱性磷酸酶、丙氨酸氨基转移酶(alaninetransaminase，alt)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartatetransaminase，ast)水平显著降低，并且能够显著降低肝中酸性磷酸酶、磷脂、脂质过氧化物的水平，说明其具有很好的抗肝纤维化作用，这是在传统中药物的保肝降酶中的重要发现。此外，本发明首先发现胡黄连苷ⅰ能在逆转肝纤维化引起的小鼠血清转氨酶及肝纤维四项指标(ⅳ型胶原、ⅲ型前胶原氨基端原肽、层粘连蛋白及透明质酸)含量的升高，同时其能减少肝细胞炎症细胞浸润和胶原纤维堆积。其治疗肝纤维化的具体作用机制为：上游cyp8b1上调，下游胆酸、牛磺胆酸下调，胆汁酸代谢被调整；谷胱甘肽水平上调，转谷氨酰胺酶下调，细胞外基质堆积减弱；下游鞘磷脂水平下调，上游鞘氨醇激酶2上调，病理性血管生成过程减弱；甘油磷脂代谢被改善，从而减轻肝脏损伤。作为优选的技术方案：如上所述的应用，所述防治肝纤维化的药物的形式包括：口服的片剂、颗粒剂、胶囊及混悬剂；注射给药的注射剂、粉针剂、脂质体及微乳等临床常用剂型。本发明的防治肝纤维化的药物可与药学上可以接受的任意载体(固体、半固体或液体)配合，制成药学上可以接受的任意剂型(片剂、注射剂、胶囊、口服液)。本发明的保护范围并不仅限于此，此处仅列举部分可行的技术方案，其可采用本领域公知的常规生产方法制成各种剂型，采取口服或注射(包括静脉注射、静脉滴注、腹腔注射、肌肉注射等中的一种或多种)进行肝纤维化及其相关疾病的预防、保护、治疗或科学研究。本发明还提供了一种防治肝纤维化的药物，所述药物含有胡黄连苷ⅰ，所述药物中胡黄连苷ⅰ的含量在一定范围内即胡黄连苷ⅰ的含量为有效量。其使用要求：给药方式为口服，对应患者的体重，其用量为12mg/kg/d胡黄连苷ⅰ；使用对象：肝纤维化患者。有益效果：本发明提供了胡黄连苷ⅰ的新医药用途，具体为其在制备防治肝纤维化的药物中的应用，本发明研究发现，采用胡黄连苷ⅰ不仅能使肝损伤大鼠血清碱性磷酸酶、丙氨酸氨基转移酶(alaninetransaminase，alt)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartatetransaminase，ast)水平显著降低，并且能够显著降低肝中酸性磷酸酶、磷脂、脂质过氧化物的水平，即说明其具有很好的抗肝纤维化作用，同时其效果良好(与阳性药物组效果相当)，在肝纤维化治疗领域具有较为广阔的应用前景。附图说明图1为小鼠肝组织病理切片的放大示意图(苏木精伊红染色，200×)；图2为小鼠肝组织病理切片的放大示意图(天狼星红染色，200×)；图3为蛋白质印迹条带图；其中，图1和2中的a、b、c及d分别对应空白对照组、模型组、阳性药物组及实验组。具体实施方式下面结合附图，对本发明的具体实施方式做进一步阐述。实施例1胡黄连苷ⅰ治疗小鼠肝纤维化的作用：一、试剂和材料c57bl/6雄性小鼠，清洁级，体重(20～22g)；胡黄连苷ⅰ，生产厂家为南京广润生物科技有限公司。二、实验方法动物实验共设4组，每组12只，按体重随机分组，分为空白组、模型组、阳性药物组和实验组。硫代乙酰胺(溶于生理盐水中，下同)为肝纤维化诱导药物，给药剂量为200mg/kg；s-腺苷甲硫氨酸为阳性药物，剂量为10mg/kg；实验组中胡黄连苷ⅰ为抗肝纤维化候选药物，剂量为75mg/kg。每隔一天对空白对照组小鼠腹腔注射生理盐水，模型组、阳性药物组、实验组小鼠腹腔注射硫代乙酰胺，持续8周。与此同时，从第一周起，每天对空白对照组和模型组小鼠给予生理盐水灌胃，阳性药物组小鼠给予s-腺苷甲硫氨酸灌胃，实验组小鼠给予胡黄连苷ⅰ灌胃，至第8周末。给药与造模结束后，摘取眼球取血，用促凝管收集，离心分离血清，取肝组织备检。三、检测指标1.血清检测肝损伤指标alt、sat、ⅳ型胶原(collagentypeiv，colⅳ)、ⅲ型前胶原氨基端原肽(n-terminalpeptideoftypeiiiprocollagen，pcⅲnp)、层粘连蛋白(laminin，ln)及透明质酸(hyaluronicacid，ha)的含量。2.肝脏h.e染色检测及肝脏天狼星红染色检测(观察肝脏天狼星红染色和红色胶原纤维面积占比比较检测肝脏坏死情况)。3.蛋白质组学研究：肝脏蛋白质定性分析和比较，利用统计学方法筛选各组蛋白的表达差异性和生物信息学分析。另外对肝脏中荧光定量pcr和蛋白质印记检测：转化生长因子β(tgf-β)、组织转谷氨酰胺酶2(tgm2)、波形蛋白(vimentin)、膜联蛋白a2(anxa2)、视黄醇结合蛋白1(rbp1)、半乳糖凝集素3(galectin-3)、cyp8b1、鞘氨醇激酶2(sphk2)和gapdh。四、实验结果1.肝损伤指标alt、sat、ⅳ型胶原(collagentypeiv，colⅳ)、ⅲ型前胶原氨基端原肽(n-terminalpeptideoftypeiiiprocollagen，pcⅲnp)、层粘连蛋白(laminin，ln)及透明质酸(hyaluronicacid，ha)的含量检测结果：a)alt含量：实验组相对于对照组显著降低，空白组(30.67±3.98)iu/l，模型组(107.33±11.09)iu/l，阳性药组(102.33±7.51)iu/l，实验组(63.60±13.81)iu/l。与模型组和阳性药组比较，p<0.05。b)sat含量：实验组相对于对照组显著降低，空白组(125.83±19.24)iu/l，模型组(202.17±13.32)iu/l，阳性药组(176.67±3.79)iu/l，实验组(150.20±14.99)iu/l。与模型组比较，p<0.05。c)colⅳ含量：实验组相对于对照组显著降低，空白组(8.40±0.64)ng/l，模型组(15.02±0.97)ng/l，阳性药组(10.16±0.46)ng/l，实验组(11.43±0.29)ng/l。与模型组比较，p<0.05。d)pcⅲnp实验组相对于对照组显著降低：空白组(4.83±0.39)ng/l，模型组(9.05±0.37)ng/l，阳性药组(5.85±0.60)ng/l，实验组(5.79±0.58)ng/l。与模型组比较，p<0.05。e)ln含量：实验组相对于对照组显著降低，空白组(150.59±9.46)ng/l，模型组(256.15±12.30)ng/l，阳性药组(185.14±9.69)ng/l，实验组(177.88±8.12)ng/l。与模型组比较，p<0.05。f)ha含量：实验组相对于对照组显著降低，空白组(22.92±2.07)ng/l，模型组(46.15±1.32)ng/l，阳性药组(33.73±3.08)ng/l，实验组(35.10±2.89)ng/l。与模型组比较，p<0.05。综上所述，胡黄连苷ⅰ75mg/kg能显著性减轻肝脏的损伤。2.病理学检测结果：a)肝脏h.e染色检测情况：结果见图1所示。肝细胞坏死情况和炎症细胞浸润实验组明显减少，说明胡黄连苷ⅰ用于治疗肝纤维化的肝脏坏死具有显著效果。空白对照组小鼠肝细胞排列整齐，肝索结构清晰，无细胞坏死及炎症反应。模型组小鼠肝组织可见肝细胞广泛轻度水肿，细胞肿胀，中央静脉周围较多肝细胞肿胀坏死，偶见嗜酸性小体，肝细胞胞核异型，大小不一，可见较多核内包涵体，有炎症细胞浸润。阳性药物组可见肝细胞肿胀，胞核异型且大小不一，并多见核内包涵体，未见明显炎症反应。实验组小鼠肝组织中央静脉周围少量肝细胞胞质着色不均匀，少量胞核较大，未见明显炎症反应。由此可见s-腺苷甲硫氨酸及胡黄连苷ⅰ能够有效减少硫代乙酰胺诱导的肝细胞变性及炎症细胞浸润。b)肝脏天狼星红染色检测情况：结果见图2所示。空白对照组小鼠肝组织仅在中央静脉处可见少许胶原纤维，模型组小鼠肝组织可见纵横交错的胶原纤维。给予s-腺苷甲硫氨酸或胡黄连苷ⅰ保护后，胶原纤维面积缩小，高剂量组基本上无纵横交错的红色胶原纤维。利用imagej软件对红色胶原纤维进行面积占比分析，可见空白对照组红色区域面积仅占1.42％，模型组占比显著增加(p＜0.01)，达到6.86％。s-腺苷甲硫氨酸及胡黄连苷ⅰ均显著降低了红色胶原纤维面积占比(p＜0.01)。由此可以看出胡黄连苷ⅰ能够有效降低硫代乙酰胺造成的肝组织中胶原纤维堆积。综上所述，胡黄连苷ⅰ能减少肝细胞变性坏死、炎症细胞浸润，并有效减少肝组织中胶原纤维堆积，显示出一定的肝保护作用，具有一定的抗肝纤维化作用。3.蛋白印记检测和pcr结果表1胡黄连苷i对相关蛋白的影响(n＝5，*p＜0.05，与空白对照组比较；#p＜0.05，与模型组比较)空白组模型组阳性药组实验组anxa20.75±0.161.37±0.17*1.09±0.211.01±0.11#tgf-β10.15±0.030.35±0.09*0.19±0.06#0.16±0.05#cyp8b11.82±0.310.65±0.10*1.1±0.13#0.95±0.11#tgm21.17±0.521.47±0.42*1.52±0.690.95±0.25#vimentin0.36±0.071.51±0.06*0.95±0.11#0.62±0.08#rbp10.41±0.141.36±0.17*0.78±0.07#0.64±0.15#galectin-30.32±0.061.32±0.05*0.71±0.090.40±0.13#sphk21.36±0.110.59±0.15*1.10±0.08#1.23±0.07#表2胡黄连苷ⅰ对相关差异蛋白mrna的影响(n＝5，*p＜0.05，与空白组比较；#p＜0.05，与模型组比较)空白组模型组阳性药组实验组anxa21.89±0.1513.28±1.523.54±0.815.09±1.18tgf-β11.77±0.133.58±0.992.29±0.662.16±0.85cyp8b12.12±0.610.75±0.111.15±0.531.95±0.41tgm213.74±1.7211.17±0.9210.52±1.096.97±1.25vimentin1.46±0.176.11±0.764.05±0.913.12±0.68rbp114.42±0.6414.26±1.2712.98±1.576.24±1.65lgals-314.12±1.5612.21±1.156.24±1.494.27±0.83sphk21.69±0.710.59±0.050.87±0.060.94±0.07结果如图3、表1和2所示，与空白组相比，模型组小鼠肝脏中tgf-β1、谷丙tgm2、vim、anxa2，视黄醇结合蛋白1和galectin-3蛋白及其mrna水平显著升高，而cyp8b1和sphk2蛋白及其mrna水平显著降低(p＜0.05)。胡黄连苷ⅰ能显著降低小鼠肝脏中tgf-β1、tgm2、vim、anxa2、rbp1和galectin-3蛋白及其mrna水平，且显著升高cyp8b1和sphk2蛋白及其mrna水平(p＜0.05)。实验结论：分子生物学研究表明胡黄连苷ⅰ可以调节肝纤维化小鼠肝内组织转谷氨酰胺酶2、波形蛋白、cyp8b1、鞘氨醇激酶2、膜联蛋白a2、视黄醇结合蛋白1、半乳糖凝集素3等蛋白水平。以往的研究也证实上述蛋白与肝纤维化存在相关性。综上所述，胡黄连苷ⅰ能减少肝细胞变性坏死、炎症细胞浸润，并有效减少肝组织中胶原纤维堆积，显示出肝保护作用，具有很好的抗肝纤维化作用。其作用机制是上游cyp8b1上调，下游胆酸、牛磺胆酸下调，胆汁酸代谢被调整；谷胱甘肽水平上调，转谷氨酰胺酶下调，细胞外基质堆积减弱；下游鞘磷脂水平下调，上游鞘氨醇激酶2上调，病理性血管生成过程减弱；甘油磷脂代谢被改善，从而减轻肝脏损伤。实施例2一种胡黄连苷ⅰ的制剂的制备：(1)胡黄连苷ⅰ颗粒剂的制备：取适量胡黄连苷ⅰ，加适量β环糊精、蔗糖和可溶性淀粉(胡黄连苷ⅰ：糊精：蔗糖：可溶性淀粉的质量比为1:2:3:4)，用乙醇制软材，16目筛制颗粒，60℃以下干燥，得胡黄连苷ⅰ颗粒剂，可用于肝纤维化的治疗。(2)胡黄连苷ⅰ片剂的制备：称取处方量胡黄连苷ⅰ、淀粉、糊精、酒石酸混合均匀。用胶头滴管逐滴加入50％乙醇，边加边搅拌，至出现明显的颗粒为止。用16目筛制粒，于60℃条件下干燥15分钟后继续用16目筛进行整粒。将处方量的硬脂酸镁与整粒的颗粒混合均匀，再用单冲压片机压片，使每片片重0.2～0.5g。(3)胡黄连苷ⅰ胶囊的制备：称取处方量胡黄连苷ⅰ，粉碎成细粉，过筛，装入1号空心胶囊，即得胡黄连苷ⅰ胶囊剂，装量量为0.4克。(4)胡黄连苷ⅰ口服液的制备：取胡黄连苷ⅰ，粉碎成细粉，称取10克，加入500倍量水，混匀，加入矫味剂0.2％甘露醇、0.3％甜菊糖，防腐剂0.1％山梨酸钾，加蒸馏水定容到10000ml，混匀，灭菌，分装，20ml/瓶。虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应该理解，这些仅是举例说明，在不违背本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改。当前第1页1 2 3 

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