一种治疗维罗非尼耐药的黑色素瘤的联合用药物及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域，尤其是bmx抑制剂在逆转维罗非尼耐药中的应用。

背景技术：

维罗非尼（vemurafenib，plx4032）是一种强效选择性braf(v600e)抑制剂，它选择性地与brafv600e激酶的atp活性位点结合，抑制其活性，阻断有丝分裂原活化蛋白激酶(mapk)信号通路，抑制致癌基因活性，从而遏制肿瘤增殖。2017年3月，中国食品药品监督管理局批准维罗非尼在中国上市，用于治疗brafv600e突变的黑色素瘤患者。国内黑素瘤治疗指南（2018版）中注明维罗非尼是治疗晚期brafv600e突变黑色素瘤的一线标准治疗方案。与传统治疗黑色素瘤药物达卡巴嗪维相比，维罗非尼可以口服用药，起效时间缩短，无进展生存时间（pfs）延长半年，显著提高了brafv600突变黑色素瘤患者生存率。但在临床用药中其内在和获得性耐药限制了维罗非尼的应用，文献报道黑色素瘤患者在接受维罗非尼治疗6-8个月后往往对其产生耐药，严重影响了黑色素瘤患者的预后。临床上尝试mek抑制剂与维罗非尼联用克服维罗非尼耐药，但效果不理想，寻找新的药物联用组合对于治疗维罗非尼耐药的肿瘤具有积极意义。

bmx属于tec激酶家族的非受体酪氨酸激酶，近几年作为抗肿瘤靶点引起人们的广泛关注。chmfl-bmx-078是一种高效的，选择性的，不可逆的，ii型bmx激酶抑制剂。目前该抑制剂抗肿瘤作用报道较少，对黑素瘤的影响至今未见文献报道。

技术实现要素：

为了解决目前临床上出现的维罗非尼耐药问题，本发明提供了一种治疗维罗非尼耐药的联合用药。

本发明的技术方案是：

本发明提供了一种治疗维罗非尼耐药的黑色素瘤的联合用药，所述联合用药为braf抑制剂维罗非尼与bmx抑制剂联用。

优选的，现有技术中所述bmx抑制剂共有两种，经过试验对比和验证，所述bmx抑制剂chmfl-bmx-078对维罗非尼耐药细胞株具有明显的作用。

优选的，所述联合用药中bmx抑制剂与维罗非尼的摩尔用量比为：维罗非尼：bmx抑制剂=（8-12）:1。

优选的，所述联合用药中bmx抑制剂与维罗非尼的摩尔用量比为：维罗非尼：bmx抑制剂=10:1。

本发明还提供了braf抑制剂维罗非尼与bmx抑制剂联用在制备治疗维罗非尼耐药的黑色素瘤药物中的应用。

优选的，所述bmx抑制剂为chmfl-bmx-078，其细胞用量是0.05-20μm，后期选择抑制率大约30%的作用浓度0.5μm作为两者联用的作用浓度；所述braf抑制剂为维罗非尼，其细胞用量是0.1-10μm，后期选择两者联用的作用浓度为5μm。

与现有技术相比，本发明的优势是：

本发明还提供了一种治疗黑色素瘤耐药的药物组合物，它是以bmx抑制剂和braf抑制剂联合使用，逆转维罗非尼耐药。

本发明联合使用bmx抑制剂和braf抑制剂可有效逆转维罗非尼耐药的黑色素瘤细胞增殖，其抑制效果明显优于bmx抑制剂或braf抑制剂单独使用。

本发明为治疗耐维罗非尼的黑色素瘤提供了新的工具，可以采用联合用药的方式，协同抑制黑色素瘤耐药株的生长，应用范围广泛，前景良好。

以下结合附图和具体实施方式对本发明的详细结构作进一步描述。

附图说明

图1bmx抑制剂体外抑制耐维罗非尼黑色素瘤细胞增殖a，cck8检测细胞数量；黑色素瘤耐维罗非尼细胞株a375-r分别用相应浓度的bmx抑制剂chmfl-bmx-078处理72h，cck-8检测细胞存活率。*p＜0.05；**p＜0.01。b，克隆形成实验；800个/孔黑色素瘤耐药株a375-r用相应浓度的bmx抑制剂chmfl-bmx-078处理，每两天换液一次，7天后，经多聚甲醛固定，结晶紫染色，观察克隆形成情况。c，edu检测细胞增殖；黑色素瘤耐药株a375-r分别经相应浓度的bmx抑制剂chmfl-bmx-078处理，edu检测细胞的增殖。

图2与黑素瘤细胞亲本株相比，维罗非尼耐药株对bmx抑制剂对更敏感黑色素瘤亲本株a375、维罗非尼耐药株a375-r分别用相应浓度的bmx抑制剂chmfl-bmx-078处理72h，cck-8检测细胞存活率。*p＜0.05；**p＜0.01。

图3与表皮细胞相比，bmx抑制剂对维罗非尼耐药株毒性更强黑色素瘤耐药株a375-r、表皮细胞hacat分别用相应浓度的bmx抑制剂chmfl-bmx-078处理72h，cck-8检测细胞存活率。*p＜0.05；**p＜0.01。

图4维罗非尼和bmx抑制剂联合使用显著抑制维罗非尼耐药株细胞增殖a，cck8检测细胞数量；黑色素瘤耐药株a375-r分别经bmx抑制剂chmfl-bmx-078、维罗非尼（vemurafenib）、bmx抑制剂chmfl-bmx-078+维罗非尼（vemurafenib）处理，72h后，cck-8检测细胞存活率。*p＜0.05；**p＜0.01。b，edu检测细胞增殖；黑色素瘤耐药株a375-r分别经bmx抑制剂chmfl-bmx-078、维罗非尼（vemurafenib）、bmx抑制剂chmfl-bmx-078+维罗非尼（vemurafenib）处理，edu检测细胞的增殖。c，克隆形成实验检测细胞增殖；黑色素瘤耐药株a375-r分别用相应浓度bmx抑制剂chmfl-bmx-078、维罗非尼（vemurafenib）、bmx抑制剂chmfl-bmx-078+维罗非尼（vemurafenib）处理，每两天换液一次，7天后，多聚甲醛固定，结晶紫染色，观察克隆形成情况。d，维罗非尼和bmx抑制剂联合使用抑制p-erk的表达；黑色素瘤耐药株a375-r分别用维罗非尼、bmx抑制剂，两者联用处理48h，westernblot检测erk和p-erk的蛋白表达水平，β-actin作为内参。

图5维罗非尼与bmx抑制剂联用的协同效果优于与ack1抑制剂联用黑色素瘤耐药株a375-r分别用0.5μmbmx抑制剂chmfl-bmx-078，4μmack1抑制剂aim-100与相应浓度维罗非尼（vemurafenib）联合作用72h，cck-8检测细胞存活率。*/#p＜0.05；**/##p＜0.01。采用compusyn软件分析联合治疗的协同作用，联合指数(ci)=1表示加性效应，ci<1表示增效，ci>1表示拮抗。

说明：附图中，vem代表维罗非尼；chmfl代表bmx抑制剂chmfl-bmx-078；*/#表示显著差异(p＜0.05)；**/##表示极显著差异(p＜0.01)；***/###表示非常显著的差异(p＜0.001)。

具体实施方式

实验例1bmx抑制剂在体外抑制维罗非尼耐药细胞增殖。

维罗非尼耐药株：a375-维罗非尼耐药株（a375-r）；

bmx抑制剂：chmfl-bmx-078。

1.实验方法

1.1实验处理：使用溶媒剂（dmso）、bmx抑制剂（chmfl-bmx-078）处理维罗非尼耐药细胞株。

1.2检测：

（1）cck8检测细胞数量变化

实验处理3天后，采用cck8检测。

（2）观察细胞克隆形成

实验处理7天后，使用结晶紫染色，观察克隆数量。

（3）edu检测细胞增殖

经相应浓度chmfl-bmx-078处理后，edu检测细胞增殖。

2.实验结果

如图1-a所示，bmx抑制剂显著抑制耐维罗非尼黑色素瘤细胞的增殖，并呈现浓度依赖性。

如图1-b所示，bmx抑制剂显著抑制细胞克隆的形成。

如图1-c所示，bmx抑制剂显著抑制细胞的增殖。

3.结论

bmx抑制剂可以抑制耐维罗非尼细胞株的增值。

实验例2bmx抑制剂对维罗非尼敏感株和耐药株的细胞毒性比较

本实验所用的细胞：brafv600突变黑色素瘤细胞：a375；维罗非尼耐药株：a375-维罗非尼耐药株（a375-r）。

bmx抑制剂：chmfl-bmx-078。

1.实验方法

1.1实验处理：使用溶媒剂（dmso）、bmx抑制剂(0.05-20μm)分别处理不同的细胞。

1.2检测：

（1）cck8检测细胞数量变化；

实验处理3天后，采用cck8检测

2.实验结果

如图2所示，相比于brafv600e突变黑色素瘤细胞a375，bmx抑制对耐维罗非尼的黑色素瘤细胞毒性更强。

3.结论

bmx抑制剂对维罗非尼耐药株的细胞毒作用更强。

实验例3比较bmx抑制剂对维罗非尼耐药株和永生化表皮细胞hacat的细胞毒性

本实验所用的细胞：人类永生化表皮细胞-hacat；维罗非尼耐药株：a375-维罗非尼耐药株（a375-r）。

bmx抑制剂：chmfl-bmx-078。

1.实验方法

1.1实验处理：使用溶媒剂（dmso）、bmx抑制剂(0.05-20μm)分别处理不同的细胞。

1.2检测：

（1）cck8检测细胞数量变化；

实验处理3天后，采用cck8检测

2.实验结果

如图3所示，bmx抑制剂对人表皮细胞hacat的毒性作用更低。

3.结论

bmx抑制剂对表皮细胞毒性较低，提示该药的副作用可能较小。

实验例4维罗非尼联合bmx抑制剂在体外抑制耐维罗非尼细胞株增殖

本实验所用的细胞：a375-维罗非尼耐药株（a375-r）

braf抑制剂：维罗非尼（vemurafenib）。

bmx抑制剂：chmfl-bmx-078

1.实验方法

1.1实验处理：分别使用dmso(对照)、维罗非尼(5μm)、chmfl-bmx-078(0.5μm)、维罗非尼联合chmfl-bmx-078处理维罗非尼耐药细胞株。

1.2检测：

(1)cck8检测细胞数量变化

实验处理3天后，采用cck8检测。

(2)edu检测细胞增殖

实验处理2天后，使用edu检测细胞增殖。

(3)观察细胞克隆形成

实验处理7天后，使用结晶紫染色，观察克隆数量。

(4)蛋白免疫印迹

实验处理48h后，提取细胞总蛋白，进行蛋白免疫印迹，检测p-erk(维罗非尼耐药相关蛋白)、erk和tubulin(作为内参)。

2.实验结果

如图4-a所示，bmx抑制剂+维罗非尼组的相对细胞增殖比例显著低于其他组别。

如图4-b所示，bmx抑制剂+维罗非尼组的相对细胞增殖明显少于其他组别。

如图4-c所示，bmx抑制剂+维罗非尼组的相对细胞克隆数也明显少于其他组别。

蛋白免疫印迹显示，维罗非尼和chmfl-bmx-078单独使用对p-erk并没有显著抑制作用，两者联用可以显著抑制p-erk(图4-d)，表明两者联用可以克服维罗非尼耐药。

3.结论

联合使用维罗非尼和chmfl-bmx-078可以逆转维罗非尼耐药。

实验例5比较rtk蛋白ack1抑制剂、bmx抑制剂与维罗非尼联用抗肿瘤效果

本实验所用的细胞：a375-维罗非尼耐药株（a375-r）

braf抑制剂：维罗非尼（vemurafenib）

bmx抑制剂：chmfl-bmx-078

ack1抑制剂：aim-100

1.实验方法

1.1实验处理：分别使用溶媒剂（dmso）、bmx抑制剂(0.5μm)、ack1抑制剂(4μm)联合不同浓度维罗非尼（0-10μm）处理细胞

1.2检测：

（1）cck8检测细胞数量变化

实验处理3天后，采用cck8检测。

2.实验结果

如图5所示，ack1抑制剂与维罗非尼联用的联合指数ci分别为（2.72、0.76、0.53、0.64、0.81），bmx抑制剂与维罗非尼联用的联合指数ci分别为（0.10、0.09、0.09、0.11、0.13），联合指数(ci)=1表示加性效应，ci<1表示增效，ci>1表示拮抗，bmx抑制剂与维罗非尼联用的联合指数ci更小，表明bmx抑制剂与维罗非尼联用的协同效果更好。

3.结论

此实施例中，我们所用的ack1抑制剂浓度（4μm）明显高于bmx抑制剂的浓度（0.5μm），但是结果显示维罗非尼与bmx抑制剂联用的协同抗肿瘤效果明显优于与ack1抑制剂联用，证明维罗非尼与bmx抑制剂联用具有显著的优势。

以上所述为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围不局限于此，任何熟悉技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明权利要求的保护范围之内。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除