一种EGFR与CDK4/6小分子靶向药组合物及其应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及egfr小分子抑制剂erlotinib及cdk4/6小分子抑制剂palbociclib联合用药在抑制肿瘤细胞生长中的应用，特别是在制备抑制结直肠癌细胞生长药物中的应用。

背景技术：

根据2020年最新美国癌症协会发布的全球癌症报告显示，结直肠癌无论是发病率还是致死率都高居第三位，可见其凶险。在我国，结直肠癌的发病人数占全部恶性肿瘤发病人数的38.8%，每年男性新发病例约为22.5万，女性新发病例约为16.3万。随着时代的进步，饮食结构的改善，结直肠癌发病率和死亡率逐年上升，增速约为每年4.2%，远超2%的而且新发结直肠癌患者的年龄呈现年轻化趋势。结直肠癌的早期发现率较低，往往疾病到发现开始治疗多半是中晚期并且可能伴随浸润或转移。有部分有家族遗传史，结肠息肉遗传史，炎症性肠病的病人属于结直肠癌高风险人群。结直肠癌作为一种高发病率高死亡率的恶性肿瘤，探索其发病机制和有效的治疗方案对延长患者生存期、提高患者生存质量具有重要意义。

结直肠癌诊断后相对早期的标准治疗方案是手术切除病灶后再联合放疗和化疗，但是对于已经转移的晚期结直肠癌和常规治疗后复发进展的病人，治疗策略是靶向治疗或者免疫治疗。近两年，随着肿瘤分子靶向研究的不断深入，基因组测试和靶向药物的开发且不断优化，晚期结直肠癌患者可以通过基因检测获得个性化的靶向治疗方案，从而获得更长的生存时间。目前晚期结直肠癌的生存时间由之前的一年不到提升至3年，并且有20%的患者可以生存5年甚至更长时间。根据tcga(thecancergenomeatlas)绘制的结直肠癌基因组图谱，发现80%的结直肠癌中rtk/ras信号通路发生基因改变，包括egfr(epidermalgrowthfactorreceptor)家族的扩增和突变，其中erbb2和erbb3的激活性突变高达13%和20%。以及kras和braf发生激活性突变都将导致肿瘤细胞的异常增殖。其中针对egfr靶点的单抗药物是西妥昔单抗和帕尼单抗，分别于2004年和2006年经fda（foodanddrugadministration）批准用于治疗egfr表达阳性的远处转移晚期结直肠癌。但是egfr突变后结构发生改变，大分子单抗药物无法与其识别结合发挥疗效，因此针对这部分的病人更适用于使用egfr小分子抑制剂来进行治疗。近期有研究报道，结直肠癌中rb信号通路扩增，转录因子e2f释放增多使得细胞周期亢进，细胞不受控的增殖。cdk4/6抑制剂通过cdk4/6-rb信号通路诱导细胞周期阻滞，进而抑制细胞增殖。因为在乳腺癌临床试验中的出色表现，cdk4/6抑制剂被fda加速批准通过配合激素疗法应用于乳腺癌中。

erlotinib是i类egfr小分子抑制剂，选择性地和可逆地抑制细胞内egfr相关酪氨酸激酶的自磷酸化。erlotinib抑制纯化egfr酪氨酸激酶和完整细胞内egfr的自磷酸化，ic50值分别为2nmol/l和20nmol/l。erlotinib竞争结合egfr胞内结构域上的atp结合位点，导致下游信号传导途径的抑制，这些途径参与血管生成和细胞增殖。erlotinib作为一种egfr抑制剂在egfr信号通路高频率激活突变的结直肠癌中，将其用作潜在的研究药物具有重要的临床意义。

palbociclib是一种针对cyclindependentkinase4(cdk4)(ic50,0.011mol/l)和cdk6(ic50,0.016mol/l)的高度特异性抑制剂。palbociclib通过cdk4/6-rb信号通路诱导细胞周期停滞，恢复细胞周期控制，进而抑制细胞增殖。细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependentkinase，cdk）是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，作为细胞内重要的信号转导分子，和周期素（cyclin）形成cdk-cyclin复合物，参与细胞的生长、增殖、休眠或者凋亡的调节。细胞周期失控是肿瘤的一个标志性特征，cdk4/6的特异性激活与肿瘤的增殖密切相关，大约80%的人类肿瘤中存在cyclind-cdk4/6-ink4-rb通路的异常，研究数据显示结直肠癌中发现有rb信号通路扩增。将cdk4/6作为抗肿瘤靶点的优势在于cdk4/6抑制剂不表现出“pan-cdk抑制剂”的细胞毒性如骨髓抑制和肠道反应等，而且能够增强细胞对药物的敏感性，具有更强的药物靶向性。

我们在多种结直肠癌细胞系以及病人来源的组织样本中联合使用erlotinib和palbociclib，也显示出了显著的协同抑制作用。在协同抑制机制的研究中我们发现两者能通过诱导肿瘤细胞凋亡、周期阻滞和衰老发生从而抑制肿瘤细胞生长。

技术实现要素：

解决的技术问题：本发明提供了一种egfr与cdk4/6小分子靶向药组合物及其应用，本发明所述方案可以特异性抑制结直肠癌细胞生长，能提高egfr小分子抑制剂在抑制肿瘤细胞生长中的疗效。

技术方案：一种egfr与cdk4/6小分子靶向药组合物，由以下两种靶向药物：egfr小分子抑制剂和cdk4/6小分子抑制剂组成。

上述egfr小分子抑制剂为erlotinib；cdk4/6小分子抑制剂为palbociclib。

在细胞系与pdo实验中所述erlotinib浓度不超过20μm，palbociclib浓度不超过2μm。

在pdx模型中所述erlotinib浓度不超过50mg/kg，palbociclib浓度不超过25mg/kg。

上述egfr与cdk4/6小分子靶向药组合物在制备抑制肿瘤细胞生长药物中的应用。

上述癌症为结直肠癌。

有益效果：本发明提供了一种egfr与cdk4/6小分子靶向药组合物，两者联用既能改善egfr抑制剂的药物敏感性，又能发挥cdk4/6抑制剂在抗肿瘤方面的作用，协同增强了egfr抑制剂的治疗效果。经实验证明，在结直肠癌细胞中，erlotinib与palbociclib联用能通过诱导细胞凋亡、周期阻滞和衰老发生从而抑制细胞增殖，并且在病人来源的pdo和pdx模型中，两药的协同抑制作用依然表现显著。本发明小分子抑制剂组合物和药物制剂能应用于制备抗肿瘤药物中，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为不同浓度palbociclib对多种结直肠癌细胞系短期增殖和长期生长的影响图；除耐药细胞系dld1和hct15外，1μm浓度的palbociclib对大部分脑胶质瘤细胞的长期生长产生了显著的抑制作用。

图2为不同浓度palbociclib对ht29、hct116、dld1、hct15和lovo细胞信号通路的影响图；不同浓度palbociclib处理crc细胞系24小时后，细胞内phospho-rb（ser807/811）、foxm1、phospho-akt（thr308）水平呈浓度梯度下降，而phospho-akt（ser473）水平呈浓度梯度上升，说明cdk4/6-rb信号通路被抑制，而akt/mtor信号通路主要是通过抑制了苏氨酸308位点。相同浓度下，敏感细胞系ht29较耐药细胞系dld1和hct15信号通路抑制明显。

图3为不同浓度组合的erlotinib和palbociclib在多种结直肠癌细胞中的联合作用图；erlotinib和palbociclib在不同浓度组合下处理细胞72小时，用compusyn软件计算两药协同指数，图中横线表示ci=1，ci<1时表示两药有协同作用；结果显示在ht29、hct116和lovo细胞系中具有协同抑制作用。

图4为不同浓度的erlotinib和palbociclib单药，以及两药不同浓度组合在多种结直肠癌细胞系中对细胞长期生长的影响图；在ht29、hct116和lovo细胞系中erlotinib和palbociclib两药联用对细胞长期生长的抑制作用显著强于两个药物单药的抑制作用。

图5为erlotinib和palbociclib单药以及两药联合作用下对细胞凋亡的影响图；ht29和hct116细胞经1μmerlotinib、0.2μmpalbociclib单独或者联合处理72小时后，两药联合处理较单药处理组，细胞凋亡水平增加。

图6为erlotinib和palbociclib单药以及两药联合作用下对细胞周期的影响图；周期同步化处理后，ht29、hct116和lovo细胞经5μmerlotinib、0.5μmpalbociclib单独或者联合处理72小时，两药联合处理较单药处理组，细胞周期g1期阻滞显著增加。

图7为β-半乳糖苷酶染色实验检测erlotinib和palbociclib单药以及两药联合作用下对细胞衰老的影响图；ht29和hct116细胞经erlotinib和palbociclib单独或者联合处理72小时后，将细胞固定后在37℃下β-半乳糖苷酶染色16小时。与单药组作用相比联合组衰老染色显著加强。

图8为ros荧光染色(a)和流式细胞仪检测erlotinib和palbociclib单药以及两药联合作用下对细胞氧化应激的影响图(b)；ht29细胞经不同浓度的erlotinib和palbociclib单独或者联合处理72小时后，两药联合作用时，ht29细胞氧化应激程度比单药更强。

图9为erlotinib和palbociclib在p44病人组织类器官中的两药联合作用图；p44类器官经10μmerlotinib和1μmpalbociclib单独或者联合处理72小时后，两药联合作用时，对类器官生长的抑制作用显著强于两个药物单药的抑制作用。

图10为erlotinib和palbociclib在p44和p328病人组织移植瘤中对肿瘤生长的影响图；将p44和p328病人的结直肠癌组织移植于nod-prkdcem26il2rgem26/gpt(ncg)小鼠，构建pdx模型。当肿瘤大小至100mm³后，灌胃给药25mg/kg的erlotinib和25mg/kg的palbociclib。2周后对所有小鼠的肿瘤大小拍照。

图11为erlotinib和palbociclib在p44pdx小鼠模型中连续给药对肿瘤生长、小鼠生存和体重的影像图；p44pdx经25mg/kg的erlotinib和25mg/kg的palbociclib单独或者联合治疗后，两药联合作用时，对肿瘤生长的抑制作用、小鼠的生存期都显著强于两个药物单药的作用，而对小鼠体重的影响没有明显差异。

图12为erlotinib和palbociclib在p328pdx小鼠模型中连续给药对肿瘤生长和小鼠体重的影像图；p328pdx经50mg/kg的erlotinib和25mg/kg的palbociclib单独或者联合治疗后，两药联合作用时，对肿瘤生长的抑制作用都显著强于两个药物单药的作用，而对小鼠体重的影响没有明显差异。

具体实施方式

下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

本发明的目的在于寻找能与egfr抑制剂在结直肠癌上联合应用的药物，改善egfr抑制剂在治疗结直肠癌上的疗效，降低用药剂量和减少副作用的发生，以提高肿瘤患者的生存期。研究表明不同的药物联合使用可以达到多靶点不同信号通路上的抑制效果，在恶性肿瘤的治疗中，联合用药已经成为一种趋势。不同的药物联合使用可能会产生一定的协同作用，从而降低单独用药的剂量，减少药物毒性在体内的积累，避免不良反应的叠加，增加药物的疗效。

申请人开始选择结直肠癌是因为它是一种难治型的实体瘤，虽然egfr表达阳性的病人可以选择egfr靶点的单抗药物，但是针对部分带有egfr突变的病人只能使用小分子抑制剂。erlotinib作为一种egfr抑制剂在egfr突变的非小细胞肺癌和胰腺癌中被批准使用，并且在其他癌种中有大量的基础和临床研究。我们希望找到一种有效的小分子抑制剂，将其与erlotinib联用，减少erlotinib的药剂量和毒性，提高erlotinib的疗效，延迟耐药性的产生。因此我们尝试在结直肠癌上使用cdk4/6抑制剂palbociclib，评估其对结直肠癌的生长抑制作用，并与erlotinib联合使用后观察疗效。首先我们在多种结直肠癌细胞系上测试了palbociclib对肿瘤细胞的短期增殖和长期生长的疗效，以及用药后信号通路的改变。接着又与erlotinib联合使用后，通过alamarblue和克隆形成实验证明了不同浓度组合下对肿瘤的协同抑制作用。在探究两药发生协同作用的机制原理时发现，erlotinib和palbociclib两药联用对诱导细胞凋亡、细胞周期阻滞和衰老发生显著强于两个药物单药的作用。以及与衰老相关的氧化应激ros的产生，两药联合作用也比单药更多。基于细胞系上erlotinib和palbociclib良好的协同作用，我们尝试在病人样本上检测联合应用的疗效。最后，无论是在pdo还是pdx模型上对于肿瘤的生长抑制作用，erlotinib和palbociclib两药联用都较单药的疗效更为显著，且延长了小鼠的生存期，同时连续测量小鼠体重发现各组之间没有明显差异，提示erlotinib和palbociclib在协同作用的浓度下是剂量安全的，毒副作用在可控范围内。

本发明提供了一种egfr小分子抑制剂与cdk4/6小分子抑制剂组合物和药物制剂在制备抗结直肠肿瘤药物中的应用。

本发明对erlotinib和palbociclib的来源不做特殊限制，采用本领域技术人员熟知的即可，如市售来源，或者采用本领域常规技术制备即可。

进一步的，所述egfr抑制剂和药学上可接收的载体形成的第一制剂，及cdk4/6抑制剂和药学上可接收的载体形成的第二制剂。

更进一步的，所述erlotinib浓度为0至20μm；palbociclib浓度为0至2μm。

本发明还提供所述的药物组合物与药学上可接收的辅料。

优选的，所述药物制剂的剂型为注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、溶胶剂、冻干粉针剂、胶浆剂、气雾剂、微囊、微球、脂质体、胶束、缓释制剂或控释制剂。

下面将结合本发明说明书附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例只是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域技术人员应当理解，对本发明的具体实施例进行修改或者对部分技术特征进行同等替换，而不脱离本发明技术方案的精神，均应涵盖在本发明保护的范围中。

实施例1

采用alamarblue检测palbociclib单药在结直肠癌细胞系的增殖情况，并计算出ic50值，具体实施方案如下：

1、前一天将ht29、hct116、dld1、hct15和lovo按照1000个细胞每孔种于96孔板中，每种细胞每个浓度铺3个复孔，并设置对照组。

2、配制palbociclib单药浓度1nm、10nm、100nm、300nm、500nm、1μm、2μm、4μm、8μm、10μm的药液。

3、步骤1中细胞贴壁后吸弃旧培养基，再每孔加入100μl完全培养基和10μlalamarblue的混合液，在37℃5%二氧化碳的细胞培养箱中孵育4h后，采用化学发光仪在激发光波长534nm和发射光波长584nm的条件下检测吸光度并记录每孔数据，记录为day0数据。

4、将测完day0数据的细胞吸弃含alamarblue的混合液，再每孔加入步骤2配制的药物，第三天alamarblue检测细胞生长，方法如步骤2，记录为day3数据。

5、将day3的数据减去day0的数据后，再将各个浓度的数值除以对照组的数值获得每个细胞再各个浓度下的相对增殖率，根据所有浓度的相对增殖率获得palbociclib在各个细胞系的ic50值。

采用克隆形成实验检测多种结直肠癌细胞系在palbociclib单药作用下长期生长情况，具体实施方案如下：

1、将5种结直肠癌细胞系ht29、hct116、dld1、hct15和lovo以每孔400个细胞的量种于12孔板中。

2、配制50nm、100nm、200nm、500nm、1μm和2μm浓度的palbociclib，并设置一组空白对照2‰浓度dmso。

3、48h后待步骤1中的细胞贴壁，每孔加2ml步骤2中配制的药物，3天换药一次，连续培养14天后，撤药3天。

4、撤药3天后去除培养基，pbs洗2遍，去离子水洗1遍，4%多聚甲醛固定15min，去离子水洗1遍，1×姬姆萨染液避光染色30min，去离子水洗3遍，拍照保存。

如图1所示，在多种结直肠癌细胞系上，不同浓度的palbociclib对其短期增殖和长期生长产生了显著的抑制作用。

实施例2

采用westernblot检测ht29、dld1、hct15结直肠癌细胞系在不同浓度palbociclib单药处理下信号通路的变化，具体实施方案如下：

1、将ht29、dld1、hct15细胞系提前一天按6ⅹ10⁵/皿铺在6cm皿中，每种细胞铺6个皿。

2、配制单药palbociclib浓度10nm、50nm、100nm、500nm、1μm。

3、细胞铺好后24h每皿加入5ml步骤2中的药物，对照组加含有2‰浓度的dmso，处理24h。

4、药物处理24h后用pbs将细胞洗两遍，沥干，每皿加入200μl细胞裂解液，用刮子将裂解好的细胞收集到1.5mlep管中，再在4℃裂解半小时,13000rpm离心15min取上清，保存于-80℃。

5、用bca法测量每个样品蛋白含量。

6、配制10%浓度的聚丙烯酰胺凝胶用于蛋白分离，蛋白样品每孔上样20ug，100v恒压电泳，直至溴酚蓝消失，250ma湿转2h，3%bsa封闭3个小时，一抗4℃孵育6h，1ⅹtbst洗膜3次，每次10min，二抗室温孵育1h，1ⅹtbst洗膜3次，每次10min，ecl显色液显色曝光。

如图2所示，当palbociclib浓度为1μm时，ht29、dld1、hct15中p-rb(ser807/811)表达显著下降，表明rb活性得到有效抑制；而且1μm浓度palbociclib能有效抑制p-akt(thr308)的表达，对细胞生长也应该产生了重要的抑制作用。

实施例3

采用alamarblue检测erlotinib和palbociclib单药以及两药联用下细胞增殖情况，并计算出ci值，具体实施方案如下：

1、前一天将ht29、hct116和lovo细胞按照1000个细胞每孔种于96孔板中，每种细胞每个浓度铺3个复孔，并设置对照组。

2、配制单药palbociclib50nm、100nm、250nm、500nm、1μm和2μm；单药erlotinib500nm、1μm、2.5μm、5μm、10μm和20μm；以及两种药物所有浓度的任一组合浓度。

3、步骤1中细胞贴壁后吸弃旧培养基，再每孔加入100μl完全培养基和10μlalamarblue的混合液，在37℃5%二氧化碳的细胞培养箱中孵育4h后，采用化学发光仪在激发光波长534nm和发射光波长584nm的条件下检测吸光度并记录每孔数据，记录为day0数据。

4、将测完day0数据的细胞吸弃含alamarblue的混合液，再每孔加入步骤2配制的药物，第三天alamarblue检测细胞生长，方法如步骤2，记录为day3数据。

5、将所得各个浓度相对增殖率做柱状图，使用compusyn软件计算两药协同指数，然后分析作图。

如图3所示，erlotinib和palbociclib的组合浓度随着浓度的上升相对同一单药的增殖率明显下降。使用compusyn软件计算两药协同指数，图中横线表示ci=1，当ci>1时两药有拮抗作用；ci=1时两药有加和作用；ci<1时两药有协同作用。erlotinib和palbociclib在结直肠癌细胞系中具有较强的协同抑制作用。

实施例4

采用克隆形成实验检测多种结直肠癌细胞系在erlotinib单药，palbociclib单药以及erlotinib与palbociclib联用情况下多种结直肠癌细胞长期生长情况，具体实施方案如下：

1、提前一天将ht29、hct116和lovo细胞按400个细胞每孔种于12孔板中。

2、配制单药erlotinib500nm、1μm、2μm、5μm、10μm、20μm；单药palbociclib50nm、100nm、200nm、500nm、1μm、2μm。参考图3的结果，在不同细胞系上采用不同的浓度组合。

3、待步骤1中的细胞完全贴壁后，将步骤2中的药物加到贴壁的细胞中，每三天换液一次，加药培养14天，撤药3天后染色。

4、撤药3天后去除培养基，pbs洗2遍，去离子水洗1遍，4%多聚甲醛固定15min，去离子水洗1遍，1×姬姆萨染液避光染色30min，去离子水洗3遍，拍照保存。

如图4所示，在ht29、hct116和lovo细胞系中erlotinib与palbociclib两药联用对细胞长期生长的抑制作用显著强于两个药物单药的抑制作用。

实施例5

采用annexinv-fitc检测erlotinib与palbociclib单药和双药作用下的ht29和hct116细胞凋亡情况。具体实施方案如下：

1、将ht29和hct116细胞按照1×10⁵个每孔种于6孔板中，设置对照组，erlotinib单药组，palbociclib单药组，erlotinib和palbociclib两药联合组；每组设置3个复孔；并且提前预约流式细胞仪。

2、配制单药erlotinib1μm、palbociclib200nm以及erlotinib1μm+palbociclib200nm。

3、待细胞贴壁后加入步骤2中的培养基，培养3天。

4、将6孔板内培养基完全转移至15ml离心管中，pbs洗涤细胞两遍，并转移至15ml离心管。

5、加入300μl胰酶，摇匀后37℃消化细胞，用1ml完全培养基终止，并转移至15ml离心管，再用1ml完全培养基洗涤一遍，转至离心管中1500rpm，离心5min后吸弃上清，再用1ml预冷的pbs洗涤细胞，300g，4度离心5min，重复一次；吸弃pbs，加入100μl1xbindingbuffer重悬细胞，加入2.5μlannexinv-fitc和5μlpistainingsolution，轻轻混匀；避光室温孵育15min，每隔5min混匀一次；加入400μl1×bindingbuffer，混匀后放置于冰上，等待流式检测（1小时内完成）对试验数据进行分析统计。

如图5所示，单药erlotinib1μm作用时ht29和hct116细胞凋亡率仅在5%左右，单药palbociclib200nm作用时ht29和hct116细胞凋亡率约为8%，但是当两药联合作用时ht29和hct116凋亡率达到12%左右，两药联合作用引起细胞凋亡数量显著高于单药作用，p<0.05差异有统计学意义。

实施例6

采用流式检测erlotinib与palbociclib单药和双药作用下的ht29、hct116和dld1细胞周期分布情况。具体实施方案如下：

1、将ht29、hct116和dld1细胞按照1×10⁵个每孔种于6孔板中，设置对照组，erlotinib单药组，palbociclib单药组，erlotinib和palbociclib两药联合组；每组设置3个复孔；并且提前预约流式检测。

2、配制单药erlotinib5μm、palbociclib500nm以及erlotinib5μm+palbociclib500nm。

3、待细胞贴壁后将培养基换成无血清培养基培养24小时进行周期同步化。24小时后重新加入步骤2中的培养基，培养3天。

4、将6孔板内培养基吸弃，pbs洗涤细胞两遍，加入300μl胰酶，摇匀后37℃消化细胞，用1ml完全培养基终止，并转移至15ml离心管，再用1ml完全培养基洗涤一遍，转至离心管中1500rpm，离心5min后吸弃上清，用1ml预冷的pbs洗涤细胞，再次离心后用1ml预冷的pbs重悬细胞。最后在涡旋仪上低速涡旋，缓慢滴加3ml预冷的无水乙醇将细胞固定。将样品放置-20℃，送流式检测后对试验数据进行分析统计。

如图6所示，5μmerlotinib单药作用时，ht29、hct116和dld1细胞中处于g1期的细胞占所有细胞的比例约60%；500nmpalbociclib单药作用时，ht29、hct116和dld1细胞中处于g1期的细胞占所有细胞的比例约80%；但是当两药联合作用时3种细胞处于g1期的细胞占所有细胞的比例达到90%，与单药组作用相比细胞g1期阻滞显著加强。p<0.05,差异有统计学意义。

实施例7

使用β-半乳糖苷酶染色实检测β-半乳糖苷酶阳性细胞，以此检测ht29和hct116细胞的衰老情况。具体实施方案如下：

1、将ht29和hct116细胞按照1×10⁵个每孔种于6孔板中，设置对照组，erlotinib单药组，palbociclib单药组，erlotinib和palbociclib两药联合组；每组设置3个复孔。

2、配制单药erlotinib1μm、5μm、10μm，palbociclib200nm、500nm、1μm以及erlotinib1μm+palbociclib200nm、erlotinib5μm+palbociclib500nm和erlotinib10μm+palbociclib1μm。

3、待细胞贴壁后加入步骤2中的培养基，培养3天。

4、将6孔板内培养基吸弃，pbs洗涤细胞两遍后，用固定液b覆盖细胞，室温下孵育15分钟。去除固定液后，用洗涤缓冲液a洗涤三次，每孔加入染色液(染色液d:x-gal溶液e=19:1)覆盖细胞表面，37℃孵育16h。去除染色剂，pbs洗涤三次后拍照保存。

如图7所示，当erlotinib和palbociclib两药联合作用时，β-半乳糖苷酶染色阳性的细胞较单药染色阳性的细胞占总数的比例更高，染色面积更大。说明两药联合作用时，ht29和hct116细胞发生衰老的程度更强。

实施例8

采用ros荧光染色和流式细胞仪检测erlotinib和palbociclib单药以及两药联合作用下对细胞氧化应激的影响。具体实施方案如下：

1、将ht29细胞按照1×10⁵个每孔种于6孔板以及按照5×10⁴个每孔种于24孔板中，设置对照组，erlotinib单药组，palbociclib单药组，erlotinib和palbociclib两药联合组；每组设置3个复孔；并且提前预约流式检测。

2、配制单药erlotinib5μm、10μm；palbociclib1μm、3μm以及erlotinib5μm+palbociclib1μm、erlotinib5μm+palbociclib3μm、erlotinib10μm+palbociclib1μm和erlotinib10μm+palbociclib3μm。

3、待步骤1中的细胞完全贴壁后，将步骤2中的药物加到贴壁的细胞中，培养3天。

4、将6孔板和24孔板的培养基吸弃，加入含有荧光探针20,70-二氯荧光素二乙酸(dcfh-da)的培养基覆盖细胞在37℃孵育30分钟。

5、将6孔板内培养基吸弃，pbs洗涤细胞两遍，加入300μl胰酶，摇匀后37℃消化细胞，用1ml完全培养基终止，并转移至15ml离心管，再用1ml完全培养基洗涤一遍，转至离心管中1500rpm，离心5min后吸弃上清，用1ml预冷的pbs洗涤细胞，再次离心后用200μl的无血清培养基重悬，送流式使用激发波长为488nm，发射波长为525nm检测氧化后的dcf的峰值，后对试验数据进行分析统计。

6、将24孔板内培养基吸弃，pbs洗涤细胞两遍，重新加入无血清培养基，使用荧光显微镜拍照保存。

如图8所示，当erlotinib和palbociclib两药联合作用时，流式检测ros阳性的细胞较单药阳性的细胞含量更多；荧光拍照观察到联合用药组ros荧光比单药组更强。说明两药联合作用时，ht29细胞发生氧化应激的程度更强。

实施例9

将erlotinib和palbociclib联合用药，观察它们在病人组织类器官中是否有协同抑制作用。具体实施方案如下：

1、将p44号病人crc组织块破碎成5mm³的小块，用pbs加抗生素冲洗8次。

2、组织碎片用1mg/ml胶原酶a在37℃下消化30分钟，随后在4℃下400g离心5分钟。去除上清后用pbs重悬沉淀，然后在冰上用移液枪机械混匀。

3、将分离的细胞碎片通过70μm的细胞过滤器，离心并重悬于基质凝胶中，以1×10⁶个细胞每毫升的浓度，在24孔板中每孔滴入25μl，置于37℃培养箱中使基质凝胶固化10分钟。

4、每孔加入500μl的类器官培养基放入37℃5%二氧化碳的细胞培养箱中培养。

5、配制单药erlotinib10μm；palbociclib1μm以及erlotinib10μm+palbociclib1μm的培养液。

6、模型建立成功后，将步骤5中的药物加到每个类器官的培养孔中。结果在高清晰度显微镜下拍摄。在每个实验中，至少有三个重复孔的独立实验得到了结果。

如图9所示p44类器官经10μmerlotinib和1μmpalbociclib单独或者联合处理72小时后，两药联合作用时，对类器官生长的抑制作用显著强于两个药物单药的抑制作用。图中结果显示erlotinib和palbociclib在病人组织类器官中中具有协同抑制作用。

实施例10

将erlotinib和palbociclib在病人组织移植瘤中联合用药，观察它们对肿瘤生长的影响是否有协同抑制作用。具体实施方案如下：

1、将p44、p328号病人crc组织块破碎成5mm³的小块，用pbs加抗生素冲洗8次。

2、将3至4周龄的nod-prkdcem26il2rgem26/gpt(ncg)小鼠麻醉后，然后消毒小鼠皮肤切开，将组织块皮下植入右腹股沟后再进行伤口缝合。观察小鼠的术后状态。

3、密切观察肿瘤逐渐生长体积变大后，模型构建成功。当肿瘤体积达到80-120mm³时，将小鼠随机分为4组，每个小组包括5-10只小鼠，分别是对照组、erlotinib、palbociclib和联合给药组。

4、配置erlotinib2mg/ml以25mg/kg的剂量口服灌胃给药；palbociclib2mg/ml以25mg/kg的剂量口服灌胃给药或两药联合治疗。采用每周灌胃5天，至少4周的治疗方案。

5、治疗结束后，将所有小鼠的肿瘤按组排列拍照记录。

如图10所示erlotinib和palbociclib在p44和p328病人组织移植瘤中，联合治疗的肿瘤大小明显小于单药组和对照组。图中结果显示erlotinib和palbociclib在病人组织移植瘤中单药具有抑制肿瘤生长的作用，两药联合对移植瘤具有协同抑制作用。

实施例11

将erlotinib和palbociclib在p44病人组织移植瘤中联合用药，观察它们对肿瘤生长、小鼠生存和体重的影响。具体实施方案如下：

1、构建p44pdx模型后，按实施例10的治疗方案给药治疗。

2、监测肿瘤生长情况，直到肿瘤达到2000mm³的最大法定伦理体积，或者如果它们的健康状况因肿瘤进展或药物毒性以外的原因而恶化，将小鼠安乐死，收集肿瘤和器官。每隔一天使用电子游标卡尺测量肿瘤体积，计算公式：长度×(宽度²)×0.5。

3、每2天给小鼠称重，收集小鼠体重数据。

如图11所示erlotinib和palbociclib在p44病人组织移植瘤中，联合治疗的肿瘤大小明显小于单药组和对照组，且生存周期更长。而小鼠的体重没有差异。图中结果显示erlotinib和palbociclib在p44病人组织移植瘤中单药具有抑制肿瘤生长的作用，两药联合对移植瘤具有协同抑制作用；延长小鼠的生存周期。小鼠对联合治疗剂量耐受，没有出现明显的毒副作用。

实施例12

将erlotinib和palbociclib在p328病人组织移植瘤中联合用药，观察它们对肿瘤生长和小鼠体重的影响。具体实施方案如下：

1、构建p328pdx模型后，按实施例10的治疗方案给药治疗。

2、监测肿瘤生长情况，直到肿瘤达到2000mm³的最大法定伦理体积，或者如果它们的健康状况因肿瘤进展或药物毒性以外的原因而恶化，将小鼠安乐死，收集肿瘤和器官。每隔一天使用电子游标卡尺测量肿瘤体积，计算公式：长度×(宽度²)×0.5。

3、每2天给小鼠称重，收集小鼠体重数据。

如图12所示erlotinib和palbociclib在p328病人组织移植瘤中，联合治疗的肿瘤大小明显小于单药组和对照组，而小鼠的体重没有差异。图中结果显示erlotinib和palbociclib在p328病人组织移植瘤中单药具有抑制肿瘤生长的作用，两药联合对移植瘤具有协同抑制作用。小鼠对联合治疗剂量耐受，没有出现明显的毒副作用。

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