一种纳米光热治疗药物及其制备方法与流程

本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种纳米光热治疗药物及其制备方法。

背景技术：

数据统计表明，癌症已经超过心脏病成为全球死亡的主要原因。目前癌症的治疗方法主要为手术、放疗和化疗，但这三种疗法在治疗癌症的同时会杀死正常细胞，破坏免疫系统和增加癌症二次发病的风险。光热治疗主要依靠各种人工合成材料(如金纳米棒、碳纳米材料、硫化铜、钯纳米片、近红外荧光染料、高分子聚合物等)吸收近红外光转化为热量而杀死肿瘤细胞。光热疗法由于其高选择性、低侵入性、手术简便、恢复快、并发症少等优势，已经逐渐成为癌症治疗的重要技术。

然而，无机纳米光热材料的生物相容性差，且存在体内代谢问题和严重的长期毒性，这使得其很难获得国际医疗审核机构(如fda)的批准，因此难以应用于临床。聚多巴胺材料生物相容性好、体内可降解，并且具有良好的光热转换性能，是光热治疗试剂的良好选择。但聚多巴胺材料作为外源性材料，进入人体会引起免疫系统的识别并被快速清除，导致到达肿瘤部位的有效材料浓度大大降低。研究表明，肿瘤细胞在暴露于高温环境时，会迅速产生大量热休克蛋白(heatshockprotein,hsp)来抵御高温带来的热损伤，这是肿瘤细胞的一种自我保护机制。

因此，本发明发明人制备了一种纳米光热治疗药物，该药物可抑制热休克蛋白的合成，有效降低肿瘤细胞的耐热性，提升肿瘤光热治疗的效果，同时可有效规避免疫系统对常规纳米颗粒的识别和清除，提高体内循环滞留时间，还能够通过同源粘附机制特异性靶向同源肿瘤细胞，从而被高效摄取，降低使用量，避免过量药物产生的毒性。本发明的药物具有广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种纳米光热治疗药物。

本发明的另一目的在于提供上述纳米光热治疗药物的制备方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种纳米光热治疗药物，由纳米药物颗粒内核和外层的癌细胞膜构成；所述的纳米药物颗粒是热休克蛋白抑制剂和负载热休克蛋白抑制剂的聚多巴胺纳米球组成的纳米药物体系。

所述的癌细胞膜是处于对数生长期的，需要治疗的癌症的同源肿瘤细胞细胞膜。

所述的热休克蛋白抑制剂为格尔德霉素。

所述的聚多巴胺纳米球是通过将盐酸多巴胺和氨水在去离子水中搅拌反应后得到。

所述的氨水的浓度为25％～28％。

所述的盐酸多巴胺与所述的氨水的用量优选为1～10mg：0.5～5μl；更优选为1mg：5μl。

所述的去离子水的用量优选为按其与所述的盐酸多巴胺的配比为1～4ml：2～10mg计算。

所述的聚多巴胺纳米球与热休克蛋白抑制剂分别采用有机溶剂和去离子水溶解、分散，得到热休克蛋白抑制剂溶液与聚多巴胺纳米球溶液。

所述的有机溶剂为二甲基亚砜(dmso)。

所述的聚多巴胺纳米球溶液与热休克蛋白抑制剂溶液体积比为10～5：5～1，溶质的质量比为10～5：6～3；溶液体积比优选为9：1，溶质的质量比优选为7：6。

所述的纳米药物颗粒与癌细胞膜的用量为质量比1：1～2；优选为质量比1：1～1.2。

上述纳米光热治疗药物的制备方法，包括如下步骤：

(1)聚多巴胺纳米球(pda)的合成：将盐酸多巴胺和氨水与溶剂混合，搅拌反应，离心，收集沉淀，洗涤，得到聚多巴胺纳米球；

步骤(1)中所述的氨水的浓度优选为25％～28％。

步骤(1)中所述的盐酸多巴胺与所述的氨水的用量优选为1～3mg：0.5～2.5μl；更优选为1mg：1μl。

步骤(1)中所述的溶剂优选为去离子水。

步骤(1)中所述的溶剂的用量优选为按其与所述的盐酸多巴胺的配比为1～4ml：2～10mg计算；优选为按其与所述的盐酸多巴胺的配比为1ml：2mg计算。

步骤(1)中所述的搅拌反应为室温下250rpm～1000rpm反应12h～48h；优选为20～25℃条件下400rpm～600rpm反应20h～28h。

步骤(1)中所述的离心为8000rpm～16000rpm离心5min～20min；优选为10000rpm～12000rpm离心8min～12min。

步骤(1)中所述的洗涤是将沉淀洗涤至上清液澄清透明。

(2)负载热休克蛋白抑制剂的纳米药物体系(pda/hi)的制备：将热休克蛋白抑制剂和步骤(1)制备得到的聚多巴胺纳米球混合，搅拌反应，离心，得到纳米药物体系；

步骤(2)中所述的热休克蛋白抑制剂与聚多巴胺纳米球混合前分别采用有机溶剂和去离子水溶解、分散，得到热休克蛋白抑制剂溶液与聚多巴胺纳米球溶液。

所述的有机溶剂为二甲基亚砜(dmso)。

所述的聚多巴胺纳米球溶液与热休克蛋白抑制剂溶液体积比为10～5：5～1，溶质的质量比为10～5：6～3；体积比优选为9：1，溶质的质量比优选为7：6。

步骤(2)中所述的热休克蛋白抑制剂为格尔德霉素。

步骤(2)中所述的搅拌反应为20℃～25℃条件下，100rpm～1000rpm搅拌12h～48h；优选为25℃条件下，300rpm～500rpm搅拌20h～28h。

步骤(2)中所述的离心为8000rpm～16000rpm离心5min～20min；优选为12000rpm离心10min。

(3)癌细胞膜包裹的负载热休克蛋白抑制剂的聚多巴胺药物(pda/hi@ccm)的制备：将步骤(2)得到的纳米药物体系与癌细胞膜碎片共混并挤出，得到纳米光热治疗药物。

步骤(3)中所述的纳米药物体系与癌细胞膜碎片的用量为质量比1：1～2；优选为质量比1：1～1.2。

步骤(3)中所述的挤出包括以下步骤：将纳米药物体系与癌细胞膜碎片按比例混合均匀，随后采用聚碳酸酯微孔滤膜过滤，即得到纳米光热治疗药物。

所述的混合均匀是采用涡旋混合。

所述的采用聚碳酸酯微孔滤膜过滤是依次采用规格为1μm、0.85μm和0.45μm的聚碳酸酯微孔滤膜过滤，分别过滤8～15次。

步骤(3)中所述的癌细胞膜碎片是将对数期生长的，需要治疗的癌症的同源肿瘤细胞细胞膜处理得到的碎片。

步骤(3)中所述的癌细胞膜碎片的制备方法为：提取得到细胞膜碎片，溶于纯水或pbs中，超声处理得到均匀的纳米级细胞膜碎片；全程冰浴条件下进行。

步骤(2)和(3)均在避光条件下进行。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明制备等电点与癌细胞膜相近的聚多巴胺，将其负载热休克蛋白抑制剂并包裹癌细胞膜，得到的纳米光热治疗药物pda/hi@ccm处于肿瘤细胞内部的酸性环境中时，pda的表面电荷和包裹在其表面上的癌细胞膜趋于零，并且两者之间的静电相互作用减弱，从而快速释放出热休克蛋白抑制剂。

2、本发明制备的pda/hi@ccm具有出色的光热成像和荧光成像特性，可用于癌症靶向成像和光疗。

3、本发明制备的pda/hi@ccm自靶向肿瘤部位并形成高积累。因此，低剂量的hi可以达到理想的治疗效果，避免了过量使用对健康器官可能产生的毒性。并且本发明的pda/hi@ccm可以很好的降低热休克蛋白抑制剂本身所具有的肝毒性。

4、本发明的制备方法操作简便、产物易得、方法稳定可靠，制得的药物具有良好的生物相容性、特异的肿瘤靶向性、对机体毒副作用小等优点，在肿瘤治疗方面可发挥癌细胞膜免疫逃逸及肿瘤部位自靶向、聚多巴胺的光热治疗、热休克蛋白抑制剂增敏低温光热治疗作用，针对肿瘤细胞的热抗性进行打击治疗。

附图说明

图1是聚多巴胺纳米球(pda)、癌细胞膜碎片(ccm)以及癌细胞膜包裹的负载热休克蛋白抑制剂的聚多巴胺药物(pda/hi@ccm)的粒径图。

图2是聚多巴胺纳米球(pda)和癌细胞膜包裹的负载热休克蛋白抑制剂的聚多巴胺药物(pda/hi@ccm)的透射电镜图；其中，a为pda，b为pda/hi@ccm。

图3是癌细胞膜(ccm，4t1)、聚多巴胺纳米球(pda)、金纳米星(nss)和木质素(lnps)在不同ph条件下电势变化图；其中，a为癌细胞膜，b为金纳米星，c为聚多巴胺纳米球，d为木质素。

图4是癌细胞膜包裹的负载热休克蛋白抑制剂的聚多巴胺药物(pda/hi@ccm)的靶向性分析结果图。

图5是癌细胞膜包裹的负载热休克蛋白抑制剂的聚多巴胺药物(pda/hi@ccm)的体外释药分析结果图。

图6是癌细胞膜包裹的负载热休克蛋白抑制剂的聚多巴胺药物(pda/hi@ccm)的体外细胞暗毒性分析结果图。

图7是癌细胞膜包裹的负载热休克蛋白抑制剂的聚多巴胺药物(pda/hi@ccm)的体外细胞光毒性分析结果图。

图8是整个治疗期间各实验组小鼠肿瘤体积变化图。

图9是治疗第24天，各实验组小鼠离体肿瘤照片图。

图10是治疗第24天，各实验组小鼠心、肝、脾、肺、肾石蜡切片的h&e染色图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

盐酸多巴胺购买于上海麦克林生化科技有限公司，热休克蛋白抑制剂购买于广州左克生物科技公司，细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒购买于碧云天生物技术有限公司。

实施例1聚多巴胺纳米球(pda)的合成

在25ml的去离子水中加入50mg的盐酸多巴胺和250μl浓度为25％(v/v)的浓氨水，室温下，500rpm的转速条件下反应20h～28h，然后12000rpm离心10min，收集沉淀，用去离子水反复洗涤离心并收集沉淀，直至上清液澄清透明，沉淀产物即聚多巴胺纳米球。

实施例2负载热休克蛋白抑制剂的聚多巴胺纳米药物体系(pda/hi)的制备

将6mg热休克蛋白抑制剂溶解于1ml有机溶液dmso中，得到热休克蛋白抑制剂溶液。将7mg实施例1得到的聚多巴胺纳米球分散在9ml去离子水中，得到聚多巴胺纳米球溶液。两种溶液混合，溶液体积比为9:1，溶质质量比为7：6。25℃、300rpm条件下搅拌24h，12000rpm离心10min，收集负载了热休克蛋白抑制剂的聚多巴胺纳米药物体系。

实施例3癌细胞膜(ccm)的提取

采用细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒提取细胞膜。为避免膜上含有或者吸附的蛋白酶使膜蛋白发生变化，以下操作应在冰浴条件下进行。

为了获取细胞膜碎片，将小鼠乳腺癌细胞4t1培养于直径为25cm的细胞培养皿中，随后用细胞刮子将细胞收集起来，700g下离心5min得到细胞沉淀，将其重悬于预冷的1×pbs(0.01m，ph＝7.4)中，700g下离心5min，得到的细胞沉淀再次重悬于低渗的细胞裂解液(包含细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒中的膜蛋白抽提试剂a和1mmpmsf，用量为2000万～5000万个细胞用990μl细胞膜抽取试剂+10μlpmsf进行裂解)中，置于冰水混合物中10～15min。然后，通过细胞冻融的方式破碎细胞，4℃下700g离心10min，将上清液小心收集起来，14,000g离心30min，得到的沉淀即为细胞膜碎片。将其冻干，称重，置于-80℃超低温冰箱中保存。使用前将冻干的膜材料溶解分散于超纯水或1×pbs中。

实施例4癌细胞膜包裹的负载热休克蛋白抑制剂的纳米药物体系(pda/hi@ccm)的制备

先将实施例3提取的细胞膜碎片溶于纯水中，经超声波细胞破碎仪冰浴超声处理，得到分散均匀的纳米级细胞膜碎片(超声功率97.5w，工作时间30min)。然后将实施例2制得的聚多巴胺纳米球与癌细胞膜碎片按照质量比1：1.2的比例涡旋混合均匀，随后先后依次经过1μm，0.85μm和0.45μm聚碳酸酯微孔滤膜分别过滤10次，即得到癌细胞膜包裹的负载热休克蛋白抑制剂的聚多巴胺药物(pda/hi@ccm)。马尔文纳米粒度仪测定该纳米粒子的粒径结果见图1。用透射电镜(tem)表征其形态见图2。图中可观察该药物具有规整的球形结构，粒径为150-200nm左右。

实施例5不同ph条件下，癌细胞膜、聚多巴胺纳米球、金纳米星和木质素的表面电势的变化。

将1ml浓度均为1mg/ml的四种材料(聚多巴胺纳米球为实施例1合成，癌细胞膜是实施例3提取已破碎的细胞膜，具备光热转换作用的木质素购买自德国sigma公司，光热材料金纳米星按照文献步骤合成(zhuetal.2018.increasingthepotentialinteractingareaofnanomedicineenhancesitshomotypiccancertargetingefficacy[j].acsnano.2020,14(3):2557-2560.)分别超声分散均匀于1.5ml去离子水中，用0.1m的盐酸(hcl)调节溶液的ph分别至2、3、4、5、6、7，通过马尔文纳米粒度仪测定其表面电势的变化，从而得到表面电势为0时的ph值。做三组重复实验。结果如图3所示，聚多巴胺的等电点与癌细胞膜的等电点都在ph4～5之间，而木质素与金纳米星的等电点与此区间不符合。因此，选择聚多巴胺作为纳米药物的核心，在肿瘤组织的微酸性环境下，该纳米药物能解组装并释放出药物，而木质素或金纳米星作为纳米药物的核心则不能在酸性环境解组装，释放药物。

实施例6癌细胞膜包裹负载热休克蛋白抑制剂的聚多巴胺药(pda/hi@ccm)的靶向性分析

以小鼠乳腺癌细胞4t1进行实验，小鼠黑色素瘤b16f-10细胞和平滑肌细胞l929为对照。操作步骤如下：将4t1细胞、b16f-10细胞和l929细胞分别接种于共聚焦皿中，每个皿1×10⁵个细胞，每个皿加入完全培养基1.5ml。细胞培养24h贴壁后加入含有用荧光染料cy5标记好的pda/hi@ccm(实施例4得到)的新鲜培养基，继续培养4h，随后吸除掉含材料的旧培养基，并用新鲜的1×pbs洗去多余的材料，随后使用hochest33342染料染细胞核和cellmask^tmgreenplasmamembranestain染料染活细胞的细胞膜，37℃染10min，随后用新鲜的1×pbs洗去多余的染料和浮色，加入多聚甲醛固定40min，固定结束后用新鲜的1×pbs洗去固定液，最后加入1ml1×pbs溶液防止细胞粘连。将上述共聚焦培养皿置于激光共聚焦下观察并拍摄照片。肿瘤靶向性结果如图4所示，蓝色代表细胞核hochest33342的荧光，红色代表pda/hi@ccm的荧光，绿色代表活细胞细胞膜cellmask^tmgreenplasmamembranestain的荧光。由于pda/hi@ccm有了癌细胞4t1细胞细胞膜的外壳包覆，此药物可以有效的提高对同种肿瘤细胞的靶向性，由图4可看出pda/hi@ccm与4t1细胞发生了特异性结合(荧光强度较强)，而pda/hi@ccm与b16f-10细胞和l929细胞的结合性差(荧光强度弱)。

实施例7癌细胞膜包裹的负载热休克蛋白抑制剂的聚多巴胺药(pda/hi@ccm)的体外释药分析

采用透析方法评价该纳米体系的体外释药行为，释放介质为ph＝7.4的磷酸盐缓冲液(1×pbs)和ph＝5.2的醋酸盐缓冲液(1×abs)。将实施例4得到的pda/hi@ccm装入透析袋(截留分子量为1000kda)中，随后将其分别加入到装有磷酸盐缓冲液和醋酸盐缓冲液中，并放置在37℃恒温水浴锅中进行透析，160rpm振荡研究pda/hi@ccm的释药行为。分别于0、1、2、4、6、8、12、24、36、48、72、96h时间点将缓冲液吸出5ml，随后加入5ml新鲜的缓冲液，保持缓冲液体积不变，将取出的缓冲液用紫外分光光度计测定并计算累计释放率。从图5可看出，在ph5.0的醋酸盐缓冲液环境下，pda/hi@ccm的累计释放明显高于在ph7.4的1×pbs环境下的累计释放率。因此在肿瘤细胞偏酸性的环境下，pda/hi@ccm能快速有效的释放热休克蛋白抑制剂，在肿瘤细胞受到光照升温时，阻止肿瘤细胞表达热休克蛋白，提高光热治疗对肿瘤细胞的杀伤效果。

实施例8癌细胞膜包裹的负载热休克蛋白抑制剂的聚多巴胺纳米材料(pda/hi@ccm)的细胞毒性分析

(1)利用cck8法检测细胞活性的方法来评价实施例4得到的pda/hi@ccm对4t1细胞和l929细胞的体外暗毒性。具体操作步骤如下：首先分别将4t1细胞和l929细胞以1×10⁴个/孔的密度接种于96孔板中，然后将其置于二氧化碳培养箱中培养贴壁过夜(4t1细胞采用rpmi1640培养基，l929细胞采用dmem高糖培养基)。随后，吸出原有的培养基，换上新鲜的含有不同浓度的pda/hi@ccm的完全培养基。整个实验过程没有激光照射。所选的pda/hi@ccm的浓度以hi的浓度为准，hi浓度范围为5～80μg/ml(梯度设置：5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml)，每个浓度有3个平行；纯细胞组设为阳性对照组。让细胞与材料在细胞培养箱中共同孵育24h，孵育结束后，除去培养基，用1×pbs将细胞洗涤两次，向各孔中加入100μl的新鲜培养基(含有体积比为10％的cck-8)。置于培养箱中孵育一段时间，最后使用酶标仪检测并记录在450nm波长处的吸光度，通过以下公式计算细胞存活率：

(％)＝(od450sample-od450background)/(od450control-od450background)×100％；

其中od450sample是加入pda/hi@ccm的细胞吸光度值，od450control是不加材料的细胞吸光度值，od450background是不加材料和细胞的空白背景吸光度值。

数据基于三个独立平行样，表示为平均值±标准偏差(sd)。

(2)利用cck-8法检测细胞活性的方法来评价pda/hi@ccm对4t1细胞和l929细胞的体外光毒性。具体操作步骤如下：首先分别将4t1细胞和l929细胞以1*10⁴个/孔的密度接种于96孔板中，然后将其置于二氧化碳培养箱中培养贴壁过夜。随后，吸出原有的培养基，换上新鲜的含有不同浓度的pda/hi@ccm的完全培养基。细胞与pda/hi@ccm孵育4h后，置于808nm、1.0w/cm²近红外光下照射5min。照射结束后，将细胞放回细胞培养箱，继续培养至24h。培养结束后，吸走含有材料的培养基，用1×pbs将细胞洗涤两次后并向各孔中加入100μl的新鲜培养基(含有10％cck-8)。置于培养箱中孵育20-40min，最后使用酶标仪检测并记录在450nm波长处的吸光度。所选的pda/hi@ccm的浓度以hi的浓度为准，hi的浓度范围为5-80μg/ml(梯度设置：5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml)。每个浓度设置3个平行；其中纯细胞组设为阳性对照组。通过以下公式计算细胞存活率：

(％)＝(od450sample-od450background)/(od450control-od450background)×100％；

其中od450sample是加入pda/hi@ccm的细胞吸光度值，od450control是不加材料的细胞吸光度值，od450background是不加材料和细胞的空白背景吸光度值。

数据基于三个独立平行样，表示为平均值±标准偏差(sd)。

暗毒性分析结果如图6所示，pda/hi@ccm对4t1细胞和l929细胞均具有较低的体外细胞暗毒性。

光毒性结果如图7所示，在激光照射下，pda/hi@ccm对4t1和l929细胞均产生剂量依赖性细胞毒性，与l929细胞相比，在4t1细胞中显示出更明显的细胞毒性，这表明pda/hi@ccm具有出色的细胞选择性，朝向(同源靶向)同型癌细胞4t1细胞。

对比图6和7，在近红外光照刺激下，热休克蛋白抑制剂有了明显的释放，细胞毒性明显增加。

实施例9癌细胞膜包裹的负载热休克蛋白抑制剂的聚多巴胺纳米材料(pda/hi@ccm)的体内抗肿瘤活性研究

小鼠4t1肿瘤模型建立步骤具体如下：将预先培养好的乳腺癌细胞(4t1)用胰酶消化后离心，用适量1×pbs重悬，以5×10⁵个/100μl的细胞密度接种100μl到balb/c小白鼠(购买自北京维通利华实验动物技术有限公司)的右后肢处，每天观测肿瘤大小，至小鼠的肿瘤体积均达100mm³左右时，再进行下一步实验。

将4t1肿瘤模型小鼠随机分为5组，每组5只。各实验组为：1×pbs、pda/hi@ccm+nir、pda/hi@ccm、pda@ccm+nir、pda+nir；nir代表置于808nm、1.0w/cm²近红外光下照射5min。实验组尾静脉注射药物，注入量是以热休克蛋白抑制剂hi的注入量10mg/kg小鼠为准。从第一天开始给药，每隔一天给药并光照一次，共治疗3次。同时，每两天记录肿瘤体积。肿瘤体积定义为：v＝w²l/2，其中w和l分别指肿瘤的最长和最短直径。

治疗结束后继续观察19天，然后对所有小鼠实施安乐死，收集肿瘤，称重并拍照。并收集心脏，肝脏，脾脏，肺脏和肾脏等主要器官，浸入组织固定剂中，进行常规石蜡包埋，组织切片，然后将切片用苏木精-伊红(h&e)染色分析，并使用光学显微镜拍照。整个治疗期间，各组小鼠的肿瘤体积变化如图8所示。整个治疗周期结束后，离体的各组小鼠的肿瘤如图9所示。从图8可以直观的看到，与pbs组相比，pda+nir组和pda@ccm+nir组均显示出一定程度的肿瘤抑制能力，这主要是由于epr效应和ptt效应。正如预期的，pda/hi@ccm+nir治疗组具有最佳的治疗效果，甚至完全消除了部分小鼠的肿瘤，证明了本发明的pda/hi@ccm在激光照射下可达到良好的抑制肿瘤效果。图9所示，24天后各实验组小鼠离体肿瘤符合预期结果，证实了pda/hi@ccm+nir组具有出色的抗肿瘤功效。各组小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾)的h&e染色的结果如图10所示，与对照组相比，pda/hi@ccm+nir组未观察到主要器官的病理变化。进一步证实了pda/hi@ccm的系统毒性可以忽略且大大改善了hi的肝毒性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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