MrgD作为靶点在制备治疗和/或预防心肌肥大和心脏纤维化疾病的药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及mrgd作为靶点在制备治疗和/或预防心肌肥大和心脏纤维化疾病的药物中的应用。

背景技术：

在高血压或主动脉瓣狭窄等疾病中，作为心脏对各种生理或病理性机械应激和神经体液刺激的适应性反应，病理性心肌肥大虽可使左心室壁应力的增加正常化，但最终可能导致已被认为是全世界最常见死亡原因之一的失代偿性心力衰竭。近些年，由于人口老龄化以及冠心病、高血压、糖尿病等疾病患病率的上升，加上早期干预心室重构的不足，有专家估计我国心衰的患病率已达1.3％，使得我国已成为世界上拥有最大心衰患者群的国家之一。而心衰患者反复住院，5年生存率不及50％，这都给社会和家庭带来了沉重的医疗负担。

心肌肥大和纤维化作为高血压性心脏病心脏重构过程中的主要标志，可导致心肌胶原沉积增加以及其功能和结构的紊乱。最近的研究和临床试验表明，肾素-血管紧张素-醛固酮系统(raas)可能在心脏重塑的过程中发挥了重要的病理生理作用。而raas系统中一个重要的八肽——血管紧张素ii(angiotensinii,angii)，能通过氧化应激、细胞凋亡和炎症反应等关键分子机制参与心肌纤维化的进程，而在体内和体外发挥刺激心肌肥大的作用。

现有技术中，虽然临床上已有针对raas等心脏纤维化发病机制的治疗方法，但总体而言，传统药物治疗效果有限且不稳定，并且药物治疗通常具有一定副作用。因此，寻找一种早期有效干预心室重构的方法具有重要的临床意义。

raas系统中一些新的生物化合物也被报道对angii诱导的纤维形成具有负性调节作用。其中，ang-(1-7)作为一种内源性激素，可通过直接减少心肌胶原的沉积以及抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，从而治疗甚至预防高血压或angii诱导的心肌肥大和纤维化。此外，由于与ang-(1-7)具有相似的分子结构，alamandine被认为与ang-(1-7)一样，展现其抗增殖和纤维化的特性。

功率超声通过聚焦超声波能量对组织和细胞产生热效应、机械效应和空化效应，从而可以进一步改变其生物学功能。目前，热效应被认为是大功率聚焦超声的主要机制。但是，在没有理想超声声窗的情况下，使用大功率超声很难避免热效应对周围正常组织的影响。2005年，ibsens等人发现低功率超声能够在不破坏细胞结构的情况下，激活线虫体内的神经元细胞，从而改变其行为特征，这也首次证明了低功率超声可以通过调节细胞的蛋白表达及功能发挥生物学效应。目前，低强度脉冲超声(lipus)作为一种安全、无创、剂量可调的新型超声技术，主要通过机械效应来调节炎症反应和激活细胞内下游信号通路，而在临床上被广泛应用于包括软骨组织损伤等多种疾病的治疗。

技术实现要素：

有鉴于现有对心肌肥大和纤维化治疗的不足，本发明的目的在于提供了一种g蛋白偶联受体——mrgd在防治心肌肥大和纤维化疾病中的应用。

本发明的另一目的是提供抑制或沉默mrgd的药物或设备的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种g蛋白偶联受体mrgd作为靶点在制备治疗和/或预防体内心脏重塑、心肌肥大和/或心脏纤维化疾病的药物中的应用。

抑制或沉默mrgd表达的物质在制备治疗和/或预防体内心脏重塑、心肌肥大和/或心脏纤维化疾病的药物中的应用。

作为本发明的一种优选，所述抑制或沉默mrgd表达的物质为抑制或沉默mrgd表达的腺相关病毒adeno-associatedvirus。

抑制或沉默mrgd表达的物质可用于防治多种心脏纤维化疾病、病症和状况，包括但不局限于血管紧张素ii诱导的心脏纤维化。

在一些实施例中，本发明抑制或沉默mrgd表达的物质可用于治疗或预防angii诱导的体外心肌肥大和纤维化。

在一些实施例中，本发明抑制或沉默mrgd表达的物质可用于治疗或预防angii诱导的体内心脏重塑和心肌纤维化。

一种治疗和/或预防心肌肥大和心脏纤维化疾病的药物，其特征在于包含抑制或沉默mrgd表达的物质，优选抑制或沉默mrgd表达的腺相关病毒adeno-associatedvirus。

下调mrgd在心肌细胞或成纤维细胞中表达的设备在制备治疗和/或预防心肌肥大和心脏纤维化疾病的仪器中的应用。

作为本发明的一种优选，所述的下调mrgd在心肌细胞或成纤维细胞中表达的设备为低强度脉冲超声系统；低强度脉冲超声系统施放低强度脉冲超声的治疗有效声强范围约是76—128mw/cm²。

在一些实施例中，其中所述低强度脉冲超声以治疗有效声强进行施放，使得所述心脏纤维化疾病、病症或状况或者其他有关疾病、病症或状况的至少一种症状或特征在强度、严重程度或频率上降低，或者推迟发生。

根据本发明给予的特定治疗声强可以改变，例如依据所需结果的性质和/或程度、根据超声方式和/或时间的细节，和/或根据一种或多种特性(如体重、年龄、个人病史、基因特性、生活方式参数、心脏缺陷的严重程度和/或心脏缺陷的风险水平等，或其组合)。这些超声的声强可由本领域的普通技术人员确定。在一些实施方式中，根据标准临床技术确定适当的治疗声强。或者或此外，在一些实施方式中，适当的治疗声强是通过使用一种或多种体外或体内检测法来确定的，以辅助鉴别所需的或最佳的剂量范围或给药量。

定义

为了使本发明更加易于理解，首先对某些术语进行了定义。

动物：本文中使用的术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方式中，“动物”指处于任何发育阶段的人。在一些实施方式中，“动物”指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施方式中，非人动物为哺乳动物(如，啮齿类动物、小鼠、大鼠、兔、猴、犬、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施方式中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖类、鱼、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方式中，动物可以是转基因动物、基因工程改造的动物和/或克隆体。

近似或约：本文中使用的术语“近似”或“约”适用于一个或多个目标值，是指与规定的参考值近似的数值。在某些实施方式中，除另有说明或从上下文中显而易见(除了当这些数字将超过可能数值的100％时)，术语“近似”或“约”是指在所述参考值的任意方向(高于或低于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小幅度以内的数值范围。在本申请中，术语“约”和“近似”所表达的意义相同。

包含：本文中使用的术语“包含”以及该术语的变体，如“包括”和“含有”，并不旨在排除其他添加物、成分、整体或步骤。

改善、增加或减少：本文中使用的术语“改善”、“增加”或“减少”，或在语法上等同的术语，是指与基线测量结果相关的数值，所述基线测量如本申请所述的在开始治疗前相同个体的测量，或在未接受本申请所述的治疗的对照对象(或多个对照对象)中的测量。“对照对象”是指与接受治疗的对象患有相同形式的疾病、并与接受治疗的对象年龄相仿的对象。

体外：本文使用的术语“体外”是指在人工环境如在试管或反应器、在细胞培养物等中发生的事件，而非在多细胞生物体中发生的事件。

体内：本文使用的术语“体内”是指在多细胞生物体(例如人体和非人动物)中发生的事件。在基于细胞的系统中，此术语可用于表示在活细胞(相对于如体外系统)中发生的事件。

预防：本文中使用的术语“预防”或“防止”，当与疾病、病症和/或状况的发生连用时是指发生疾病、病症和/状况的风险下调。见对“风险”的定义

对象：本文中使用的术语“对象”是指人或任何非人动物(如小鼠、大鼠、兔、犬、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包括产前和产后的形态。在许多实施方式中，对象是人类。对象可为患者，即去往医师处诊断或治疗疾病的人。本文中使用的术语“对象”与“个体”或“患者”的用法可互换。对象可以患有或易患有某种疾病或病症，但可能显示或可能未显示出所述疾病或病症的症状。

治疗声功率：本文中使用的术语超声治疗的“治疗声功率”是指给予遭受或易患疾病、病症和/或状况的对象的量足以治疗、诊断、预防和/或延迟所述疾病、病症和/或状况的症状的发作。

治疗：本文中使用的术语“治疗”“处理”或“医治”是指用于使特定疾病、病症和/或状况的一种或多种症状或特征部分或完全减轻、改善、缓解、抑制、预防、延迟发作、减轻严重程度和/或降低发生率的任何方法。可以向未显示出疾病体征和/或仅显示出疾病早期体征的对象给予治疗，以降低对象发生与疾病相关的病理学的风险。可以向易患心脏纤维化病症的对象给予治疗以预防纤维化病症。

腺相关病毒adeno-associatedvirus(aav)抑制或沉默mrgd表达

本发明中的腺相关病毒(aav-shrna-mrgd)在体外实验中使用浓度为2e+7tu/ml。在血管紧张素ii诱导前，使用该病毒转染细胞6～8h。

低强度脉冲超声治疗系统

本发明中的一种以mrgd为靶点的用于防治心肌肥大和纤维化疾病的低强度脉冲超声治疗系统包括信号发生器、宽带功率放大器和平面/聚焦换能器(探头)；所述信号发生器、宽带功率放大器和平面/聚焦换能器(探头)之间通过线缆连接；所述信号发生器被设置为用于产生驱动信号来驱动所述换能器发出低强度脉冲超声；所述宽带功率放大器被设置为用于协调放大不同频率的信号；所述平面/聚焦换能器(探头)被设置为用于放置在治疗对象的治疗部位进行治疗。

上述的平面/聚焦换能器(探头)包括探头外壳和超声机构，所述超声机构被封装固定在所述探头外壳内。

上述的平面/聚焦换能器(探头)的超声机构，其中包括一个超声晶元阵列和晶元封装体；所述超声晶元阵列用于产生覆盖一定治疗范围的低强度脉冲超声；所述超声晶元阵列被封装在所述晶元封装体内，晶元封装体采用吸声材料，用于吸收向后方反射的超声。

上述的平面/聚焦换能器(探头)的探头外壳，其直径为6-8cm，优选7cm，从而使得超声机构与治疗部位之间的距离能够维持在7cm左右的远场范围内。

上述聚焦换能器用于实验动物和人体超声，使用时，探头上涂抹有超声耦合剂后，再压至治疗部位，从而保证探头能够与治疗对象的治疗部位进行良好的贴合。

上述平面换能器用于体外细胞超声，在使用时，平面换能器内装满有去气体化水，从而保证探头能够与细胞培养皿进行良好的贴合。

上述去气体化水经过脱气装置处理而来，能保证超声传导效率的稳定和一致。

上述用于防治心脏纤维化疾病的低强度脉冲超声治疗系统，其中所述主机包括人机接口、arm处理器、fpga芯片、高压脉冲发射电路、电热驱动电路。

上述人机接口用于用户与所述主机之间的交互，所述用户通过所述人机交互接口输入治疗参数，所述arm处理器根据所述治疗参数控制治疗流程，所述治疗参数包括：探头频率、电压、循环周期数、脉冲重复频率、占空比、治疗时间。

上述fpga芯片根据所述arm处理器的命令，通过内部锁相环产生一定声强、占空比和重复频率的脉冲控制信号，以驱动所述高压脉冲发射电路发射高压调制脉冲，从而驱动所述探头发射出低强度脉冲超声。

上述防治心脏纤维化疾病的低强度脉冲超声治疗系统使用100cycle的超声循环周期数。经过热电偶温度计测温，结果如图1显示，在该超声循环周期数下，平面换能器中去气体水的温度不随超声时间和强度的增加而明显增加。

发明人的研究和实验表明，沉默或抑制mrgd的表达能显著减轻心肌肥大和纤维化的程度。本发明更提供了低强度脉冲超声(lipus)，这一以mrgd作为治疗靶点的治疗方法，对防治angii诱导的心肌肥大和纤维化具有良好的效果。并且其具有非侵入、无创伤、无电离辐射、能够局部治疗的特点。据发明人了解，目前市场上尚没有利用mrgd作为靶点防治相关疾病的方法，更欠缺与之相关的治疗设备。现有治疗以药物治疗为主，但是药物治疗效果有限且不稳定，因此，本发明具有重要的临床意义

附图说明

图1在100cycle超声循环周期数下，平面换能器中去气体水的温度不随超声时间和强度的增加而明显增加。

图2本发明中低强度脉冲超声系统结构和体外工作示意图；

图3本发明中低强度脉冲超声系统结构和体内工作示意图；

图4：实施例1中rt-pcr结果。

图5：实施例2中westernblot结果。

图6：实施例3中rt-pcr结果。

图7：实施例3中westernblot结果。

图8：实施例4中心脏超声结果。

图9：实施例4中心脏组织he染色结果。

图10：实施例4中心脏组织masson染色和天狼星红染色结果。

图11：实施例4中westernblot结果。

图12：实施例4中rt-pcr结果。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，下述的实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1:在原代心肌细胞中转染aav-shrna-mrgd(委托吉凯基因构建，上海，中国)，能改善血管紧张素ii诱导的体外心肌肥大。

选用1-3日龄的sprague-dawley(sd)大鼠。乳鼠取材后，将获取的心脏放入含有1％p/s的1×pbs(ph7.4)中，剪去心房，反复洗涤，至心室内无血渍，洗涤液澄清为止。将心室肌用眼科剪剪成1mm³大小组织块，加入消化液15ml，37℃摇床消化5min后，吸取上层混悬液遗弃。余下组织加入消化液20ml，37℃摇床消化15min；吸取上层混悬液，终止反应；剩余沉淀物再加消化液消化3-5次，直至组织块完全消化。收集中止后的消化液于离心管中，1200rpm，离心5min，弃去上清，加入培养液重悬。计数细胞，调整细胞密度以5×10⁵个/ml，接种入培养皿。

细胞消化液每100ml包括10ml的10×ads溶液、90mlpbs、60mg胶原酶ii和40mg胰酶。10×ads溶液每1升含有1.38gna2hpo4,2.05gmgso4.7h2o,4gkcl,6g葡萄糖，47.6ghepes，68gnacl，并调整ph到7.35-7.45。

在体外分离培养大鼠原代心肌细胞。将细胞随机分为sham组、angii组、shrna-mrgd组和shrna-mrgd+angii组。sham组不进行加药处理。angii组(即疾病模型组)只进行angii加药处理。shrna-mrgd组只进行腺相关病毒转染处理。shrna-mrgd+angii组(即治疗组)按序进行病毒转染和angii加药处理。疾病模型组和治疗组使用1×10^-6molangii诱导心肌细胞48小时构建angii诱导的心肌肥大体外模型。治疗组细胞长至60～70％时，转染aav-shrna-mrgd病毒6～8h，转染浓度为2e+7tu/ml。之后换成完全培养基继续培养。在angii诱导结束后，对四组细胞同时提取rna，进行以下分析。

rt-pcr

使用trizol法从匀浆后的心脏样品中提取总rna，随后用takara-primescript^tmrt-pcr试剂盒进行0.5μgrna的逆转录反应。反应在37℃进行45分钟，然后在85℃进行5秒。将逆转录反应得到的10μlcdna加入到400dμldh20中稀释后，使用greenmastermix来进行rt-pcr。上述每个pcr反应均设置三个复孔，待扩增结束后，先对产物的溶解曲线进行分析，再用2^-δct方程计算pcr产物的量，不同组组织mrna的表达量分别与正常对照组进行比较，内参为gapdh。结束后使用prism软件4的bonferroni多重比较试验进行统计学分析。p值<0.05时认为具有统计学显著性。对anp、bnp和α-mhc的表达水平进行评价。

rt-pcr结果

anp的mrna表达：如图4所示，与正常组相比，模型组中anp的mrna表达水平显著上调(pvalue<0.001)。与模型组相比，治疗组中anp的mrna表达水平显著下调(pvalue<0.01)。

bnp的mrna表达：如图4所示，与正常组相比，模型组中bnp的mrna表达水平显著上调(pvalue<0.001)。与模型组相比，治疗组中bnp的mrna表达水平显著下调(pvalue<0.001)。

α-mhc的mrna表达：如图4所示，与正常组相比，模型组中α-mhc的mrna表达水平显著下调(pvalue<0.01)。与模型组相比，治疗组中α-mhc的mrna表达水平显著上调(pvalue<0.01)。

rt-pcr的结果显示，利用腺相关病毒aav-shrna-mrgd抑制mrgd的表达能一定程度上改善angii诱导的体外心肌肥大。此实施例证明抑制mrgd的表达可改善血管紧张素ii诱导的体外心肌肥大。

实施例2:在原代心脏成纤维细胞中转染aav-shrna-mrgd，能改善血管紧张素ii诱导的体外心脏纤维化。

在体外分离培养大鼠原代心脏成纤维细胞(方法同实施例1)。将细胞随机分为sham组、angii组、shrna-mrgd组和shrna-mrgd+angii组。sham组不进行加药处理。angii组(即疾病模型组)只进行angii加药处理。shrna-mrgd组只进行腺相关病毒转染处理。shrna-mrgd+angii组(即治疗组)按序进行病毒转染和angii加药处理。疾病模型组和治疗组使用1×10^-6mol的angii诱导导心肌细胞48小时构建angii诱导的心肌纤维化体外模型。治疗组细胞长至60～70％时，转染aav-shrna-mrgd病毒6～8h，转染浓度为2e+7tu/ml。之后换成完全培养基继续培养。在angii诱导结束后，对四组细胞同时提取蛋白和rna，进行以下分析。

westernblot：

使用加有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的lysisbuffer裂解30mg匀浆后的心脏组织，用二喹啉甲酸(bca)法测定蛋白浓度。经sds-page电泳、转模、封闭后，依次孵育一抗、二抗。最后在凝胶电泳成像系统中用ecl显色液进行曝片，曝光后用imagej软件定量蛋白表达量，不同组组织蛋白表达量分别与正常对照组进行比较，内参为gapdh。结束后使用prism软件4的bonferroni多重比较试验进行统计学分析。p值<0.05时认为具有统计学显著性。

rt-pcr

使用trizol法从匀浆后的心脏样品中提取总rna，随后用takara-primescript^tmrt-pcr试剂盒进行0.5μgrna的逆转录反应。反应在37℃进行45分钟，然后在85℃进行5秒。将逆转录反应得到的10μlcdna加入到400dμldh20中稀释后，使用greenmastermix来进行rt-pcr。上述每个pcr反应均设置三个复孔，待扩增结束后，先对产物的溶解曲线进行分析，再用2^-δct方程计算pcr产物的量，不同组组织mrna的表达量分别与正常对照组进行比较，内参为gapdh。结束后使用prism软件4的bonferroni多重比较试验进行统计学分析。p值<0.05时认为具有统计学显著性。

westernblot结果

collageni的蛋白表达：如图5所示，与正常组相比，模型组中mrgd、collageni、α-sma和tgf-β的蛋白表达水平显著上调(pvalue<0.05)。与模型组相比，治疗组中collageni、α-sma和tgf-β的蛋白表达水平显著下调(pvalue<0.05)。

westernblot的结果显示，利用腺相关病毒aav-shrna-mrgd抑制mrgd的表达能一定程度上改善angii诱导的体外心脏纤维化。此实施例证明抑制mrgd的表达可改善血管紧张素ii诱导的体外心脏纤维化。

实施例3:血管紧张素ii诱导的体外心脏原代成纤维细胞纤维化的改善

在体外分离培养大鼠原代心脏成纤维细胞(方法同实施例1)。将细胞随机分为sham组、angii组、lipus1+angii组、lipus2+angii组和lipus3+angii组。sham组不进行超声和加药处理。angii组(即疾病模型组)只进行angii加药处理。使用1×10^-6mol的angii诱导心脏原代成纤维细胞48小时构建angii诱导的心脏纤维化体外模型。lipus1/2/3+angii组(即治疗组)按序进行超声和加药处理。lipus1+angii组使用的低强度脉冲超声声强为76mw/cm²。lipus2+angii组使用的低强度脉冲超声声强为100mw/cm²。lipus3+angii组使用的低强度脉冲超声声强为128mw/cm²。

种植于6cm培养皿的心脏原代成纤维细胞被固定在平面换能器上，换能器和培养皿之间倒入脱气水，使得两者之间没有空气介质，随后进行特定频率(0.5mhz)不同输出声强的超声辐照。低强度脉冲超声共超声辐照3次，每次20min，每两次超声辐照间隔4小时，在最后一次辐照后加angii诱导48小时。在angii诱导结束后，对四组细胞同时提取蛋白和rna，进行以下分析。

westernblot：

使用加有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的lysisbuffer裂解30mg匀浆后的心脏组织，用二喹啉甲酸(bca)法测定蛋白浓度。经sds-page电泳、转模、封闭后，依次孵育一抗、二抗。最后在凝胶电泳成像系统中用ecl显色液进行曝片，曝光后用imagej软件定量蛋白表达量，不同组组织蛋白表达量分别与正常对照组进行比较，内参为gapdh。结束后使用prism软件4的bonferroni多重比较试验进行统计学分析。p值<0.05时认为具有统计学显著性。

rt-pcr：

使用trizol法从匀浆后的心脏样品中提取总rna，随后用takara-primescript^tmrt-pcr试剂盒进行0.5μgrna的逆转录反应。反应在37℃进行45分钟，然后在85℃进行5秒。将逆转录反应得到的10μlcdna加入到400dμldh20中稀释后，使用greenmastermix来进行rt-pcr。上述每个pcr反应均设置三个复孔，待扩增结束后，先对产物的溶解曲线进行分析，再用2^-δct方程计算pcr产物的量，不同组组织mrna的表达量分别与正常对照组进行比较，内参为gapdh。结束后使用prism软件4的bonferroni多重比较试验进行统计学分析。p值<0.05时认为具有统计学显著性

rt-pcr结果

mrgd的mrna表达：如图6所示，与正常组相比，模型组中mrgd的mrna表达水平显著上调(pvalue<0.05)。与模型组相比，各治疗组中mrgd的mrna表达水平显著下调(pvalue<0.001)。

collageni的mrna表达：如图6所示，与正常组相比，模型组中collageni的mrna表达水平显著上调(pvalue<0.01)。与模型组相比，lipus1与lipus2组中collageni的mrna表达水平不存在显著差异，但是lipus3组中collageni的mrna表达水平显著下调(pvalue<0.05)。

α-sma的mrna表达：如图6所示，与正常组相比，模型组中α-sma的蛋白表达水平显著上调(pvalue<0.01)。与模型组相比，三个治疗组中α-sma的蛋白表达水平皆显著下调(pvalue<0.05)。

tgf-β的mrna表达：如图6所示，与正常组相比，模型组中tgf-β的mrna表达水平显著上调(pvalue<0.01)。与模型组相比，三个治疗组中tgf-β的mrna表达水平皆显著下调(pvalue(lipus1)<0.05，pvalue(lipus2/3)<0.001)，且随着治疗组超声声功率的增加，tgf-βmrna表达水平的下调有增加趋势。

westernblot结果

collageni的蛋白表达：如图7所示，与正常组相比，模型组中collageni的蛋白表达水平显著上调(pvalue<0.0001)。与模型组相比，lipus1与lipus2组中collageni的蛋白表达水平不存在显著差异，但是lipus3组中collageni的蛋白表达水平显著下调(pvalue<0.05)。

α-sma的蛋白表达：如图7所示，与正常组相比，模型组中α-sma的蛋白表达水平显著上调(pvalue<0.001)。与模型组相比，三个治疗组中α-sma的蛋白表达水平皆显著下调(pvalue<0.0001)，且随着治疗组超声声功率的增加，α-sma下调的程度逐渐增加。

tgf-β的蛋白表达：如图7所示，与正常组相比，模型组中tgf-β的蛋白表达水平显著上调(pvalue<0.0001)。与模型组相比，三个治疗组中tgf-β的蛋白表达水平皆显著下调(pvalue(lipus1/2)<0.001，pvalue(lipus3)<0.0001)，且随着治疗组超声声功率的增加，tgf-β蛋白表达水平的下调有增加趋势。

westernblot和rt-pcr结果显示，低强度脉冲超声能够在降低mrgd表达的前提下，通过声功率依赖性的方式一定程度上减少angii诱导的体外心脏纤维化，即随着超声声功率的增加，该低强度脉冲超声治疗系统的抗心脏纤维化作用将逐渐增强。此实施例证明低强度脉冲超声(lipus)可用于改善血管紧张素ii诱导的体外心脏原代成纤维细胞纤维化。

实施例4:血管紧张素ii诱导的小鼠心脏重塑和心肌纤维化的改善

本实施例选用获自中国维通利华公司的spf级c57bl/6小鼠，随机分组后进行试验。本研究中使用的所有动物均饲养和照护在温度(23±2℃)、湿度(45±10％)、光照(12小时人工光照和黑暗循环；光照从8:00至20:00)和空气交换的受控条件下，在spf设施中供养动物。在实验室中保持高压(20±4pa)以预防设施内污染。无限制地提供灭菌的固体hfd，放置在笼顶的金属盖中。使用带有橡胶塞和吸管的水瓶无限制提供蒸馏水。水瓶每周替换一次，清洁后在高压灭菌器中灭菌并再次使用。

小鼠分sham组、lipus组、angii组和lipus+angii组。sham组不进行超声和加药处理。lipus组(即超声对照组)只进行超声处理。angii组(即模型组)只进行angii加药处理。lipus+angii组(即治疗组)按序进行超声和加药处理。使用alzetosmoticpumps持续泵出angii，诱导小鼠形成慢性心脏重塑和心肌纤维化模型。本实施例angii使用方法为皮下埋泵，angii泵持续准确地送出药剂，所用泵为alzetosmoticpumps植入式微渗透压泵。使用angii诱导剂量为2.5mg/kg/day，共诱导28天建构小鼠体内心脏重塑和心脏纤维化模型。

在动物心前区进行特定频率(0.5mhz)和特定输出声强(128mw/cm²)的lipus辐照。具体方法为:

小鼠在angii埋泵诱导前，每2天超声辐照一次，每次辐照20min，共3次。

小鼠在angii埋泵诱导后，每2天超声辐照一次，每次辐照20min，共9次。

聚焦换能器下方涂抹上超声耦合剂，再压至小鼠心前区，从而加强超声传导，使整个治疗区域能够接收均匀的超声声强。

小鼠诱导28天后进行心脏超声，分析心脏心衰和心脏重塑水平。心脏超声后称重，使用二氧化碳窒息法处死，立即取材。取材时，收集心脏，立即浸没在冰冷的(4℃)0.9％nacl中，然后进行形态学分析。获得左心室组织活检样品，并立即在液氮中速冻，并且在-80℃储存以供后续分析。

随机选择用于心脏组织病理学实验的小鼠。将心脏组织在福尔马林缓冲液中固定至少一周，然后将固定的心脏切片转移至70％的etoh中进行后续的石蜡包埋，切成5μm切片。使用苏木素和伊红(he)染色并结合天狼星红染色来定量分析心脏纤维化。

随机选择用于心脏组织分子生物实验(westernblot和rt-pcr)的小鼠。从冻存的心脏样品中选取相同部位，提取组织蛋白和rna，分析心脏纤维化程度。

心脏超声:使用小动物心脏多普勒超声机器检测小鼠左心室功能，包括lvfs(左室短轴缩短分数)、lvef(左室射血分数)、lvmass(左心室心肌质量)、lvd；s(左室收缩期内径)、lvd；d(左室舒张期内径)，从而分析小鼠心衰和心脏重塑程度。

he(苏木精—伊红)染色:为了分析组织细胞成分与病变的一般形态结构，使用尼康相机以40倍放大倍数来捕获he染色切片的明场图片。

masson染色:为了定量分析纤维化区域，显示组织中胶原纤维以及炎性因子的多少，使用尼康相机以40倍放大倍数来捕捉masson染色切片的明场图像，使用imagej软件定量5个视野/切片中的阳性区域。

天狼星红染色:为了定量分析纤维化区域，使用尼康相机以40倍放大倍数来捕捉天狼星红染色切片的明场图像，使用imagej软件定量5个视野/切片中的阳性区域。

westernblot:使用加有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的lysisbuffer裂解30mg匀浆后的心脏组织，用二喹啉甲酸(bca)法测定蛋白浓度。经sds-page电泳、转模、封闭后，依次孵育一抗、二抗。最后在凝胶电泳成像系统中用ecl显色液进行曝片，曝光后用imagej软件定量蛋白表达量，不同组组织蛋白表达量分别与正常对照组进行比较，内参为gapdh。结束后使用prism软件4的bonferroni多重比较试验进行统计学分析。p值<0.05时认为具有统计学显著性。

rt-pcr:使用trizol法从匀浆后的心脏样品中提取总rna，随后用takara-primescripttmrt-pcr试剂盒进行0.5μgrna的逆转录反应。反应在37℃进行45分钟，然后在85℃进行5秒。将逆转录反应得到的10μlcdna加入到400dμldh20中稀释后，使用greenmastermix来进行rt-pcr。上述每个pcr反应均设置三个复孔，待扩增结束后，先对产物的溶解曲线进行分析，再用2-δct方程计算pcr产物的量，不同组组织mrna的表达量分别与正常对照组进行比较，内参为gapdh。结束后使用prism软件4的bonferroni多重比较试验进行统计学分析。p值<0.05时认为具有统计学显著性。

心脏超声结果:如图8所示，与正常组相比，模型组的lvef和lvfs显著降低(pvalue<0.0001)，而超声对照组和治疗组的lvef和lvfs没有明显差异。与模型组相比，治疗组lvef和lvfs明显恢复(pvalue<0.01)；另外，与正常组相比，模型组的lvmass和lvd；s显著上升(pvalue<0.01)，而超声对照组和治疗组的lvef和lvfs没有明显差异。与模型组相比，治疗组lvef和lvfs明显恢复(pvalue<0.05)。

心重/体重比(hw/tw(mg/g))结果:如图8所示，与正常组相比，模型组和治疗组的心重/体重比显著增加(pvalue<0.0001)，而超声对照组的心重/体重比没有明显差异。与模型组相比，治疗组心重/体重比较之下降(pvalue<0.05)。

he(苏木精—伊红)染色结果:如图9所示，对照组心肌细胞排列整齐，细胞间隙正常，胞核清晰，高倍镜下可见清晰横纹，未见胞体水肿，组织间隙无炎性渗出；模型组心肌细胞失去正常细胞结构形态、排列明显不规则、部分呈水肿和空泡变性，部分出现局灶性坏死，部分心肌纤维出现溶解断裂，心肌细胞间隙明显增宽，可见炎性细胞浸润；治疗组可见心肌细胞变性和坏死，心肌细胞间隙增宽，但程度和范围均较模型组减轻。

天狼星红染色结果:如图10所示，与正常组相比，模型组中天狼星红染色心脏切片的心肌细胞中胶原沉积增加，即模型组中纤维化区域的百分比(天狼星红阳性区域)显著增加(pvalue<0.0001)。与模型组相比，治疗组中的纤维化区显著减少(pvalue<0.0001)。

masson染色结果:如图10所示，与正常组相比，模型组中masson染色心脏切片的心肌细胞中胶原沉积增加，即模型组中纤维化区域的百分比(阳性区域)显著增加(pvalue<0.0001)。与模型组相比，治疗组中的纤维化区显著减少(pvalue<0.0001)。

westernblot结果

mrgd的蛋白表达:如图11所示，与正常组相比，模型组中mrgd的蛋白表达水平显著上调(pvalue<0.01)。与模型组相比，治疗组中collageni的蛋白表达水平显著下调(pvalue<0.001)。

collageni的蛋白表达:如图11所示，与正常组相比，模型组中collageni的蛋白表达水平显著上调(pvalue<0.01)，超声对照组和治疗组的collageni蛋白表达水平无明显差异。与模型组相比，治疗组中collageni的蛋白表达水平显著下调(pvalue<0.001)。

tgf-β的蛋白表达:如图11所示，与正常组相比，模型组中tgf-β的蛋白表达水平显著上调(pvalue<0.01)，超声对照组和治疗组的tgf-β蛋白表达水平无明显差异。与模型组相比，治疗组中tgf-β的蛋白表达水平显著下调(pvalue<0.01)

rt-pcr结果

anp的mrna表达:如图12所示，与正常组相比，模型组中anp的mrna表达水平显著上调(pvalue<0.0001)。与模型组相比，治疗组中anp的mrna表达水平明显下调(pvalue<0.01)。

bnp的mrna表达:如图12所示，与正常组相比，模型组中bnp的mrna表达水平显著上调(pvalue<0.0001)。与模型组相比，治疗组中bnp的mrna表达水平明显下调(pvalue<0.01)。

α-mhc的mrna表达:如图12所示，与正常组相比，模型组中α-mhc的mrna表达水平明显下调(pvalue<0.05)。与模型组相比，治疗组中α-mhc的mrna表达水平较之上调(pvalue<0.05)。

β-mhc的mrna表达:如图12所示，与正常组相比，模型组中β-mhc的蛋白表达水平显著上调(pvalue<0.0001)。与模型组相比，治疗组中β-mhc的mrna表达水平明显下调(pvalue<0.001)

心脏超声、组织形态学和分子生物学结果显示，低强度脉冲超声能够在减少mrgd表达量的前提下，一定程度上减少angii诱导的小鼠心脏重塑和心肌纤维化。此实施例证明低强度脉冲超声(lipus)可用于改善血管紧张素ii诱导的小鼠心脏重塑和心肌纤维化。

结论

综上所述，本发明首次发现mrgd可以作为防治心肌肥大和纤维化的一个新靶点，并创新性使用一种以mrgd为治疗靶点的低强度脉冲超声的方法来防治angii诱导的心肌肥大和纤维化。该治疗方案安全、稳定、有效，无创无痛、成本低廉、无需专用手术室，易于实现临床转化。可以用于预防冠心病、高血压、糖尿病等引起的早期心脏纤维化的进展，使广大患者获益，并减轻社会医疗负担。

应理解，以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，所以本发明的内容不局限于上述实施例中。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

应理解，本发明仅以举例方式加以描述并可同时在本发明的范围和精神内进行修改。以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的试验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

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