基于慢病毒外壳修饰和mRNA递送的SARS-CoV-2疫苗及其制备方法与流程

2021-01-08 11:01:24|

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本发明属于生物技术领域，具体涉及一种sars-cov-2mrna疫苗的制备方法，尤其涉及一种慢病毒载体制备冠状病毒sars-cov-2mrna疫苗的方法。

背景技术：

疫苗是预防病毒、细菌等引起感染性疾病的有效方法。常见的疫苗平台有减毒疫苗、灭活病毒、重组蛋白、多肽、病毒载体递送的基因、dna和mrna等。传统的减毒和灭活疫苗等疫苗的制作工艺复杂，生产速度慢，安全级别要求高，无法快速应对紧急疫情。病毒载体和dna疫苗则有整合到基因组的风险。所以亟待开发安全有效，可快速生产的疫苗制备方法。

mrna疫苗作为新一代疫苗的方式逐渐成为研究热点。mrna疫苗是将抗原的信使rna输送到体内，在体内表达抗原。抗原与体内的受体结合引发特异性免疫反应并产生抗体。mrna疫苗既可以应用于感染性疾病，也可以应用于非感染性疾病。已经有公司开展了针对肿瘤的mrna疫苗i/ii期临床。mrna疫苗有以下优势：(1)mrna疫苗设计简单，可以快速生产新出现病毒的抗原mrna。(2)mrna疫苗较为安全。与dna疫苗相比，mrna疫苗没有整合到基因组的风险。

mrna需要借助载体才能进入细胞，发挥作用。现有最常用的mrna疫苗的递送方式是脂质体递送。2019年新型冠状病毒sars-cov-2疫情爆发之后，moderna公司研制的疫苗mrna-1273是全球首个进入临床试验的mrna疫苗。mrna-1273是由脂质体包裹spike蛋白的mrna制成。然而脂质体递送方法感染细胞的效率较低，而感染效率对疫苗的成功有着关键的作用。

在先专利文献申请号为201810533437.x的中国发明专利申请公开了一种慢病毒载体及其递送外源rna的方法；利用rna结合蛋白和其所识别的rna序列相互结合的原理，将rna结合蛋白整合至慢病毒gagpol长链蛋白的骨架，并将其所识别的rna序列连接到外源目的rna,从而使目的rna在慢病毒颗粒的组装过程中被包装进慢病毒颗粒。但该方法仅仅递送rna，较难诱导产生针对构象表位的中和抗体。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种慢病毒载体制备冠状病毒sars-cov-2mrna疫苗的方法。生产一种兼具有效性和安全性的sars-cov-2疫苗。本发明既是一种mrna疫苗，也是一种蛋白疫苗。本发明通过慢病毒颗粒包裹sars-cov-2的棘突蛋白spike的mrna。在此基础上，通过用spike蛋白对慢病毒颗粒表面的装饰，从而模拟新冠病毒的外表，以三维结构的形式呈递spike的蛋白，诱导机体产生针对构象表位的中和抗体。

本发明利用慢病毒颗粒作为递送载体，(1)慢病毒颗粒有囊膜蛋白，可将mrna包裹在囊膜颗粒中，避免mrna被核酸酶降解；(2)慢病毒颗粒具有高效的感染细胞的能力，大大提高了疫苗进入细胞的效率；(3)慢病毒载体进入细胞后将mrna释放至细胞质中，高效地表达病毒抗原；(4)本发明的慢病毒颗粒外表装饰有spike蛋白，可以将spike蛋白以稳定的三维结构形式呈递给抗原呈递细胞。

本发明利用rna结合蛋白与其所识别的rna茎环结构的相互作用，将含该种可识别的rna序列的spike蛋白mrna包装进慢病毒颗粒。与此同时，spike蛋白作为一种棘突蛋白可以组装进慢病毒的包膜结构上。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种基于慢病毒外壳修饰和mrna递送的sars-cov-2疫苗，所述sars-cov-2疫苗是慢病毒颗粒作为外壳包裹sars-cov-2的棘突蛋白spike的mrna得到。

优选地，所述慢病毒颗粒的包膜上装饰有sars-cov-2的棘突蛋白spike；所述棘突蛋白spike的基因是密码子优化后和氨基酸突变后的基因，序列如seqidno.9所示。

优选地，所述慢病毒颗粒的包膜上还装饰有包膜蛋白vsv-g，表达所述包膜蛋白vsv-g的质粒的序列如seqidno.1所示。

优选地，所述棘突蛋白spike的mrna由sars-cov-2的棘突蛋白spike基因转录得到；所述棘突蛋白spike的基因是经过密码子优化以及氨基酸突变后的基因，序列如seqidno.9所示。

本发明还提供了一种sars-cov-2疫苗的制备方法，通过将疫苗生产质粒转染入病毒生产细胞；收集上清，浓缩，制备而得。

优选地，所述制备方法的具体步骤如下：

s1、将表达vsv-g膜蛋白的质粒、表达含rna结合蛋白的慢病毒gagpol长链蛋白的质粒、表达含慢病毒gagpol长链蛋白的质粒、表达含rna结合蛋白所识别的茎环结构和棘突蛋白spikemrna的质粒共转染病毒生产细胞；所述茎环结构置于棘突蛋白spikemrna的表达框内；所述棘突蛋白spikemrna由sars-cov-2的棘突蛋白spike基因转录得到；

s2、收集含病毒颗粒的上清，浓缩，得到含棘突蛋白spike的mrna、并在外壳装饰有棘突蛋白spike的慢病毒颗粒。

优选地，所述表达含rna结合蛋白的慢病毒gagpol长链蛋白的质粒是通过将rna结合蛋白整合至第三代慢病毒gagpol长链蛋白的n-端制成，所述rna结合蛋白为ms2衣壳蛋白；

所述ms2衣壳蛋白的基因序列如seqidno.5所示，表达含rna结合蛋白的慢病毒gagpol长链蛋白的质粒序列如seqidno.4所示。

优选地，所述表达含rna结合蛋白所识别的茎环结构的棘突蛋白spikemrna的质粒是通过将rna结合蛋白所识别的茎环结构的rna序列与棘突蛋白spike的mrna序列融合而得到，所得质粒的序列如seqidno.11所示。

优选地，所述含rna结合蛋白所识别的茎环结构在spikemrna的表达框中，茎环结构的rna序列如seqidno.8所示。

优选地，所述病毒生产细胞选自293t细胞、293ftx细胞、hek293细胞；

所述表达含慢病毒gagpol长链蛋白的质粒序列如seqidno.2所示。

本发明所述的sars-cov-2疫苗是由慢病毒载体递送棘突蛋白spike的mrna和蛋白本身。以此方法制备的慢病毒载体还可以通过递送sars、mers、hiv等其它病毒的抗原蛋白的mrna来制备相应的疫苗。

本发明以慢病毒颗粒作为递送载体的sars-cov-2疫苗可用于实现预防新型冠状病毒sars-cov-2感染的用途。

与已有的脂质体作为递送介质的sars-cov-2mrna疫苗相比，本发明具有如下的有益效果：

(1)本发明的sars-cov-2mrna疫苗是由慢病毒颗粒携带spike蛋白的mrna,其感染细胞的效率增加。

(2)本发明sars-cov-2mrna疫苗的慢病毒颗粒的囊膜结构上含有spike蛋白，从而模拟新冠病毒的外表，以三维结构的形式呈递spike的蛋白，诱导机体产生更有效的中和抗体。

(3)本发明利用慢病毒颗粒作为递送载体，慢病毒颗粒有囊膜蛋白，还可将mrna包裹在囊膜颗粒中，避免mrna被核酸酶降解；慢病毒载体进入细胞后将mrna释放至细胞质中，可高效地表达病毒抗原。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为：sars-cov-2疫苗的spikemrna表达质粒的构造；

图2为：sars-cov2mrna疫苗的包装策略；

图3为：sars-cov-2疫苗包装的spike蛋白情况；

图4为：sars-cov-2疫苗感染293t细胞，所携带的mrna表达的spike蛋白情况；

图5为：sars-cov-2疫苗接种小鼠，产生中和抗体。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

以下对本发明中涉及的一些术语进行解释：慢病毒载体是由hiv-1改造而来的一种不能自我复制的病毒载体。慢病毒载体可以高效地感染分裂细胞和非分裂细胞，是生物学研究和基因治疗常用的载体。目前，慢病毒载体已经发展到第三代，安全性越来越高。spike蛋白是冠状病毒的棘突蛋白，能与细胞表面受体结合而感染细胞。spike蛋白可引起机体免疫产生对应的抗体，以此原理设计疫苗是常用的方法。

本发明的目的是：将sars-cov-2的spike蛋白mrna包装进慢病毒载体。

本发明的原理是：利用rna结合蛋白与其所识别的rna茎环结构的相互作用，将融合了该种可识别的rna序列的spike蛋白mrna包装进慢病毒颗粒。

本发明的特点是：慢病毒载体将sars-cov-2的spike蛋白mrna递送进细胞表达spike蛋白；spike蛋白作为棘突蛋白可以组装进慢病毒的包膜结构上，可作为抗原与细胞受体结合。

实施例1、sars-cov-2mrna疫苗的质粒构造方法及包装策略

本实施例涉及sars-cov-2mrna疫苗制备方法；spikemrna表达质粒的构造如图1所示，sars-cov-2mrna疫苗的包装策略如图2所示。具体步骤包括：

步骤1：将表达膜蛋白的质粒(如vsv-g)、表达慢病毒gagpol长链蛋白的质粒、表达含rna结合蛋白的慢病毒gagpol长链蛋白的质粒、表达带rna结合蛋白所识别的茎环结构和棘突蛋白spikemrna的质粒共转染病毒生产细胞(如293t)。其中，

(1)表达膜蛋白vsv-g的质粒是公知质粒pmd2g，其质粒序列如seqidno.1所示。

(2)表达含慢病毒gagpol长链蛋白的质粒是公知质粒pmdlg/prre的整合酶缺陷型，其质粒序列如seqidno.2所示。辅助质粒是公知质粒prsv-rev的质粒序列如seqidno.3所示。辅助质粒prsv-rev与pmdlg/prre的整合酶缺陷型质粒一起转染进病毒生产细胞用于疫苗的制备。

(3)表达含rna结合蛋白的慢病毒gagpol长链蛋白的质粒是通过将ms2衣壳蛋白与慢病毒gagpol长链蛋白融合而得到。所述表达含rna结合蛋白的慢病毒gagpol长链蛋白的质粒序列如seqidno.4所示。

所述ms2衣壳蛋白的基因序列如seqidno.5所示，其编码的蛋白可与gagpol长链蛋白相连，置于该gagpol长链蛋白的n-端。

该质粒的制备方案如下：

①根据基因序列seqidno.5所示合成ms2蛋白的基因；

②pcr扩增ms2蛋白的基因，引物序列为f:5'-tagcaccggtcgccaccatggcctctaattttactca-3'(seqidno.13),r:5'-tagctccggactgcacaatcggatagttctggctgtatatcccgctgttggcgg-3'(seqidno.14)；

③采用限制性内切酶agei和acciii分别酶切步骤②扩增的pcr产物(即插入片段)和载体质粒pgfp-ph-gagpol-d64v(序列如seqidno.6所示)；

④用t4连接酶连接步骤③酶切后的载体质粒pgfp-ph-gagpol-d64v和插入片段后转化，抽提质粒，具体转化，抽提质粒的步骤为：连接体系经过感受态xl1-blue细胞转化、挑取单克隆和摇菌，最后用质粒抽提试剂盒抽提质粒。

⑤用引物5'-attgacgcaaatgggcggtag-3'(seqidno.15)进行一代测序验证，结果与设计的质粒序列一致时，即得表达含rna结合蛋白的慢病毒gagpol长链蛋白的质粒，并进行后续步骤。

(4)表达含rna结合蛋白所识别的茎环结构和棘突蛋白spikemrna的质粒(pcmv-ncov-s-6xms2-mut-flag)是通过将ms2衣壳蛋白所识别的茎环结构的rna序列与sars-cov-2spike蛋白的mrna序列融合而得到，质粒结构参见图1，pcmv-ncov-s-6xms2-mut-flag序列如seqidno.11所示。

其中，ms2衣壳蛋白所识别的rna序列如seqidno.7所示，该序列可以以单次或者多次重复的方式与外源目的rna连接从而形成含有单个或多个茎环结构的外源目的rna序列。本实施例用的6次重复(每个rna序列的两端都有连接序列)的序列是由基因合成所得，序列如seqidno.8所示。

所述spike蛋白的mrna序列由sars-cov-2的棘突蛋白spike基因转录得到；所述sars-cov-2spike蛋白基因是经过了密码子优化后由基因合成所得，并引入氨基酸突变(k1003p和v1004p)。所得基因序列如seqidno.9所示。

表达含rna结合蛋白所识别的茎环结构和棘突蛋白spikemrna的质粒制备方案如下：

①根据基因序列seqidno.8合成rna结合蛋白所识别的rna茎环结构序列；根据基因序列seqidno.9所示合成sars-cov-2spike蛋白的基因，所述基因可转录棘突蛋白spikemrna；

②pcr扩增sars-cov-2spike蛋白的基因，引物序列为f:5'-tagcccgcggacgcgtgccaccatggactggacctggatcct-3'(seqidno.16)，r：5'-ttacttatcgtcatcgtctt-3'(seqidno.17)；

pcr扩增茎环结构rna的基因序列，引物为f：5'-aagacgatgacgataagtaaaccggtcttgcagcacatacatgag-3'(seqidno.18)和r：5'-tagcccgcgggccaagcttaaggtgcacac-3'(seqidno.19)。

③融合pcr：将步骤②扩增得到的两段基因融合成一条，引物为：f:5'-tagcacgcgtgccaccatggactggacctggatcct-3'(seqidno.20)，r：5'-tagcccgcgggccaagcttaaggtgcacac-3'(seqidno.21)。

④采用限制性内切酶sacii分别酶切步骤③融合后的pcr产物(即插入片段)和载体质粒pcmv-gfp(序列如seqidno.10所示)；

⑤用t4连接酶连接步骤④的载体质粒和插入片段后转化，抽提质粒，具体转化，抽提质粒的步骤为：连接体系经过感受态xl1-blue细胞转化、挑取单克隆和摇菌，最后用质粒抽提试剂盒抽提质粒。

⑥用引物f:5'-attgacgcaaatgggcggtag-3'(seqidno.15)和r:5'-gtttattgcagcttataatg-3'(seqidno.22)进行一代测序验证，结果与设计的质粒序列一致时，即得表达含rna结合蛋白所识别的茎环结构和棘突蛋白spikemrna的质粒(pcmv-ncov-s-6xms2-mut-flag)，并进行后续步骤。

步骤2：收集含病毒颗粒的上清，通过高速离心或者hplc等方法进行浓缩，得到高滴度的含mrna的慢病毒颗粒，即sars-cov-2mrna疫苗。

本发明中介绍的mrna疫苗制备方法可以用于制备sars-cov-2mrna疫苗，也可以制备其它病毒的疫苗。

实施例2、sars-cov-2mrna疫苗包装的spike蛋白情况

具体步骤同实施例1，所用的sars-cov-2spike蛋白基因c-末端含有1个拷贝的flag蛋白的基因。得到高滴度sars-cov-2mrna疫苗的慢病毒颗粒后，用慢病毒滴度试剂盒检测p24含量。取p24300ng进行westernblot(免疫印迹试验)。显示spike蛋白条带位置的一抗用鼠源的anti-flag；显示p24蛋白条带位置的一抗用鼠源的anti-p24,二抗用anti-mouseigg。去糖基化酶用pngasef。结果见图3，显示本实施例方法制备的sars-cov-2mrna疫苗(vsp-s-mut表示)含有spike蛋白的s2亚基(spike蛋白在病毒成熟时被剪切使得s1亚基和s2亚基分开，本实施例中，flag在spike蛋白的c-端，所以检测到s2亚基)，且spike蛋白的含量比含有未突变spike基因的sars-cov-2mrna疫苗颗粒(vsp-s表示，其制备方法与实施例1基本相同，不同之处仅在于：表达含rna结合蛋白所识别的茎环结构和棘突蛋白spikemrna的质粒制备中，采用的sars-cov-2spike蛋白基因没有进行氨基酸突变)的多。

图3中还对比了核酸载体分别含有spike蛋白基因(未突变/突变)的普通慢病毒(idlv-s/idlv-s-mut，其制备方法与实施例1基本相同，不同的是将表达膜蛋白的质粒(如vsv-g)、表达慢病毒gagpol长链蛋白的质粒、表达spike蛋白基因(未突变/突变)的慢病毒载体质粒共转染进细胞生产而得。其中，表达spike蛋白基因(氨基酸突变)的慢病毒载体质粒(是由spike蛋白基因(氨基酸突变)替换了慢病毒载体质粒pccl-pgk-egfp中的gfp基因所得，基因序列如seqidno.12所示)不能或很少携带spike蛋白。去糖基化处理后得到真实s2亚基(约80kda)。普通慢病毒颗粒idlv作为阴性对照。

实施例3、sars-cov-2疫苗感染293t细胞，所携带的mrna表达的spike蛋白情况

在48孔板里种293t细胞，4×10⁴个/孔。24小时后分别感染p24300ngsars-cov-2mrna疫苗(实施例2制备的vsp-s-mut)，含有未突变spike基因的sars-cov-2mrna疫苗(实施例2制备的vsp-s)以及核酸载体含有spike蛋白基因(未突变/突变)的普通慢病毒(idlv-s,idlv-s-mut)。同时293t细胞各转染2ug质粒pcmv-ncov-s-6xms2-flag和pcmv-ncov-s-6xms2-mut-flag。转染和感染各种制备好的慢病毒载体和质粒36小时后收细胞进行westernblot(免疫印迹试验)。所用抗体同实施例2。图4显示，本实施例方法制备的sars-cov-2mrna疫苗(vsp-s-mut)可以感染细胞，并表达大量的spike蛋白。未被转染和感染的293t细胞作为空白对照。

实施例4、sars-cov-2疫苗接种小鼠，产生中和抗体

足垫注射1.5ugp24的sars-cov-2疫苗到小鼠体内(vsp-s-mut)，14天后取血清检测中和抗体。注射pbs的小鼠(placebo)作为对照。用包装了荧光素酶(luciferase)的sars-cov-2假病毒(自行制备，制备方法参考文献：lul,liuq,zhuy,chank-h,qinl,liy,etal.structure-baseddiscoveryofmiddleeastrespiratorysyndromecoronavirusfusioninhibitor.2014；5(1):1-12.)的荧光信号值评价中和效果。假病毒被抗体中和后无法进入细胞表达荧光。ec50(能中和50％假病毒的血清稀释倍数)作为衡量指标。图5显示，在注射sars-cov-2疫苗的小鼠的高稀释浓度的血清中检测到了中和抗体。

本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>上海交通大学

<120>基于慢病毒外壳修饰和mrna递送的sars-cov-2疫苗及其制备方法

<130>kag43762

<160>22

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>5824

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2