抗VEGF抗体和抗ANG2抗体在制备治疗具有Ras突变的肿瘤的药物中的应用的制作方法

本发明涉及医学药物技术领域，特别是涉及抗vegf抗体和抗ang2抗体在制备治疗具有ras突变的肿瘤的药物中的应用。

背景技术：

血管内皮生长因子(vegf)可在体内诱导血管新生。血管的发生过程对于肿瘤的生长和转移起着重要作用，由于vegf在血管发生中起着重要的调节作用，在肿瘤组织内、外都可以大量分泌vegf；并且vegf表达在大多数恶性肿瘤中上调。血管生成素(ang)在前列腺癌、乳腺癌、肺癌及肝癌等多种肿瘤中高表达，其机制涉及影响细胞凋亡信号通路、刺激rrna转录等方面，其中，ang2通过使血管去稳定而促进肿瘤血管发生和生长。因此，将抗vegf抗体和抗ang2抗体用于治疗肿瘤，甚至是恶性肿瘤具有重要意义。

但是，在实际临床过程中，抗vegf抗体和抗ang2抗体并不是对每一种高表达vegf或ang2的肿瘤都起到作用，有些肿瘤会对抗vegf抗体和抗ang2抗体产生耐药性，因此某些肿瘤对抗vegf抗体和抗ang2抗体的耐药性也限制了抗vegf抗体的应用。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供了抗vegf抗体和抗ang2抗体在制备治疗具有ras突变的肿瘤的药物中的应用。抗vegf抗体和抗ang2抗体联合使用，用于治疗具有ras突变的肿瘤的药物中，抗vegf抗体和抗ang2抗体起到协同作用，有效提高治疗效果。

第一方面，本发明提供了抗vegf抗体和抗ang2抗体在制备治疗具有ras突变的肿瘤的药物中的应用。

在本发明中，ras基因首先在harvery鼠肉瘤病毒(ha-msv)和kirsten鼠肉瘤病毒(ki-msv)的子代基因中被发现，在这种子代病毒中发现含有来源于宿主细胞的基因组的新基因序列，此后人们将这种宿主细胞基因称为ras基因。kras基因突变与肺癌、胰脏癌和大肠癌的发生有着密切的关系，52％的肺腺癌病人有kras基因的突变。本申请人经过实验发现当肿瘤没有发生ras突变时，抗vegf抗体和抗ang2抗体单独使用时，有的可以起到治疗肿瘤的效果，但也有无法治疗肿瘤的现象；当肿瘤发生ras突变时，抗vegf抗体和/或抗ang2抗体单独使用时无法起到治疗肿瘤的效果，即肿瘤对抗vegf抗体和抗ang2抗体的单独使用起到了耐药性，但是，当抗vegf抗体和抗ang2抗体联合使用时，发生协同作用，可以起到治疗肿瘤的效果。因此，本发明提供了抗vegf抗体和抗ang2抗体在制备治疗具有ras突变的肿瘤的药物中的应用，为进一步提高肿瘤的治疗效果提供了新的思路。

可选的，所述药物中所述抗vegf抗体和所述抗ang2抗体的质量比为1：(0.1-10)。进一步的，所述药物中所述抗vegf抗体和所述抗ang2抗体的质量比为1：(0.2-8)。具体的，所述药物中所述抗vegf抗体和所述抗ang2抗体的质量比可以但不限于为1：0.5、1：0.75、1：1、1：3、或1：6。

可选的，所述抗vegf抗体包括单链抗体的功能片段、双链抗体的功能片段、嵌合抗体的功能片段、人源化抗体的功能片段中的至少一种。即，所述抗vegf抗体可以但不限于包括单链抗体的功能片段或整个片段、双链抗体的功能片段或整个片段、嵌合抗体的功能片段或整个片段、人源化抗体的功能片段或整个片段。进一步的，所述抗vegf抗体包括贝伐珠单抗、阿柏西普、雷莫芦单抗及雷珠单抗中的至少一种。

可选的，所述抗ang2抗体包括单链抗体的功能片段、双链抗体的功能片段、嵌合抗体的功能片段、人源化抗体的功能片段中的至少一种。即，所述抗ang2抗体可以但不限于包括单链抗体的功能片段或整个片段、双链抗体的功能片段或整个片段、嵌合抗体的功能片段或整个片段、人源化抗体的功能片段或整个片段。

可选的，所述抗vegf抗体和所述抗ang2抗体同时给药或不同时给药。只要所述抗vegf抗体和所述抗ang2抗体可以同时作用肿瘤即可。

可选的，所述药物还包括其他具有或治疗肿瘤的活性成分。进一步的，所述药物包括化疗剂。更进一步的，所述化疗剂包括烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、抗肿瘤动植物成分药、抗肿瘤激素类和铂类化疗药物中的至少一种。具体的，所述烷化剂可以但不限于为环磷酰胺、马里兰、氨烯咪胺或二溴甘露醇；所述抗代谢药可以但不限于为甲氨碟呤、阿糖胞苷或氟尿嘧啶；所述抗肿瘤抗生素可以但不限于为多柔比星、柔红霉素、培洛霉素或表柔比星；所述抗肿瘤动植物成分药可以但不限于为伊立替康、三尖杉酯碱、紫杉醇或榄香烯；所述抗肿瘤激素类可以但不限于为阿他美坦、阿那曲唑、来曲唑或福美坦；所述铂类化疗药物可以但不限于为顺铂、卡铂、奈达铂、洛铂或奥沙利铂。

可选的，所述药物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。

进一步的，所述载体包括溶剂、聚合物和脂质体中的一种或多种，但不限于此。进一步的，所述溶剂包括但不限于水、生理盐水，以及其他非水性溶剂。进一步的，所述聚合物包括聚赖氨酸、聚乙烯亚胺(支状和/或链状)及其改性物、聚酰胺-胺型树枝状高分子(pamam)及其衍生物、聚丙烯亚胺树枝状高分子(ppi)及其衍生物、壳聚糖、聚乳酸-羟基乙酸(plga)、聚乳酸、明胶、环糊精、海藻酸钠、白蛋白和血红蛋白中的一种或多种，但不限于此。进一步的，所述脂质体可以由阳离子类脂、中性辅助类脂、胆固醇、磷脂(如豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、脑磷脂等)自组装而成，也可以由二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg)穿插于磷脂分子形成的磷脂层中形成。

在本发明中，抗vegf抗体和抗ang2抗体可以分散或吸附在上述载体中而形成分散体系，抗vegf抗体和抗ang2抗体可以分散或吸附在同一载体上，也可以分散或吸附在不同载体上。

进一步的，所述辅料包括稀释剂、赋形剂和稳定剂中的一种或多种。

在本发明中，所述稀释剂的主要作用为填充片剂的重量或体积从而便于压片。进一步的，所述稀释剂包括淀粉类、糖类、纤维素类和无机盐中的一种或多种。在本发明中，所述赋形剂是指在药物中的除了主要药物活性成以外的附加物。进一步的，所述赋形剂包括如片剂中的黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂，丸剂中的酒、醋、药汁等，半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分，液体制剂中的矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等。在本发明中，所述稳定剂的主要作用是为了稳定药物中的各个成分，所述稳定剂可以但不限于为防腐剂、抗氧剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂等。

可选的，所述药物包括汤剂、散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、口服剂和颗粒剂中的一种或多种。所述药物的形式取决于在实际中的应用。

可选的，所述药物通过口服或注射的方式施用。进一步的，所述注射通过腹膜内注射、皮下注射、肌肉注射或静脉注射的方式施用。

可选的，所述抗vegf抗体每天用量为(0.3-15)mg/kg体重。进一步的，所述抗vegf抗体每天用量为(0.5-10)mg/kg体重。

可选的，所述抗ang2抗体每天用量为(0.3-15)mg/kg体重。进一步的，所述抗ang2抗体每天用量为(0.5-10)mg/kg体重。

可选的，所述肿瘤包括胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌、膀胱癌、宫颈癌、前列腺癌、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、肾癌、食道癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、星形细胞瘤、神经母细胞瘤和神经胶质瘤中的至少一种。

在本发明中，抗vegf抗体和抗ang2抗体联合使用，用于制备治疗具有ras突变的肿瘤的药物中，可以有效提高治疗效果。

第二方面，本发明提供了一种药物组合物，用于制备治疗具有ras突变的肿瘤的药物中，包括抗vegf抗体和抗ang2抗体。

可选的，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。进一步的，所述载体包括溶剂、聚合物和脂质体中的一种或多种。进一步的，所述辅料包括稀释剂、赋形剂和稳定剂中的一种或多种。具体的载体和/或辅料的选择与第一方面相同，在此不再赘述。

可选的，所述药物组合物中所述抗vegf抗体和所述抗ang2抗体的质量比为1：(0.1-10)。

可选的，所述抗vegf抗体包括单链抗体的功能片段、双链抗体的功能片段、嵌合抗体的功能片段、人源化抗体的功能片段中的至少一种。进一步的，所述抗vegf抗体包括贝伐珠单抗、阿柏西普、雷莫芦单抗及雷珠单抗中的至少一种。

可选的，所述抗ang2抗体包括单链抗体的功能片段、双链抗体的功能片段、嵌合抗体的功能片段、人源化抗体的功能片段中的至少一种。

可选的，所述药物组合物还包括其他具有或治疗肿瘤的活性成分。进一步的，所述药物包括化疗剂。更进一步的，所述化疗剂包括烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、抗肿瘤动植物成分药、抗肿瘤激素类和铂类化疗药物中的至少一种。

本发明提供的药物组合物可以用于制备治疗具有ras突变的肿瘤的药物中，以提高具有ras突变的肿瘤的治疗效果。

本发明实施例的优点将会在下面的说明书中部分阐明，一部分根据说明书是显而易见的，或者可以通过本发明实施例的实施而获知。

附图说明

图1a为移植t241肿瘤细胞后的小鼠肿瘤体积结果图；

图1b为移植t241-kras肿瘤细胞后的小鼠肿瘤体积结果图；

图2a为移植mc38肿瘤细胞后的小鼠肿瘤体积结果图；

图2b为移植mc38-kras肿瘤细胞后的小鼠肿瘤体积结果图；

图3为移植a549肿瘤细胞后的小鼠肿瘤体积结果图；

图4为移植ht29肿瘤细胞后的小鼠肿瘤体积结果图。

具体实施方式

以下所述是本发明实施例的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。

实施例1

提供t241肿瘤细胞和引入ras突变的t241-kras肿瘤细胞。将细胞分别在含有100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素(目录号sv30010，hyclone)、2mml-谷氨酰胺(目录号sh30034.01，hyclone)的10％fbs-dmem(目录号sh30243.01，hyclone)培养基中进行培养。

本申请的动物实验使用6-8周龄的雄性c57bl/6小鼠，将小鼠维持在标准的动物饲养条件下，并且饲喂标准饮食。将混悬在30μl、pbs中的1×10⁶个t241肿瘤细胞，以及混悬在30μl、pbs中的1×10⁶个t241-kras肿瘤细胞，分别皮下植入到不同的c57bl/6小鼠中。每隔一天用卡尺测量肿瘤大小，并根据标准公式计算皮下移植的t241肿瘤体积。

当肿瘤达到一定大小后，将5mg/kg的兔抗小鼠单克隆vegf特异性中和抗体(货号bd0801，由先声制药公司(中国江苏南京)提供)作为本申请所用的抗vegf抗体，每周2次经腹膜内注射到一部分肿瘤小鼠中。将5mg/kg的兔抗小鼠单克隆ang2特异性中和抗体作为本申请所用的抗ang2抗体，每周2次经腹膜内注射到一部分肿瘤小鼠中。将5mg/kg的兔抗小鼠单克隆vegf特异性中和抗体，与5mg/kg的兔抗小鼠单克隆ang2特异性中和抗体作为本申请所用的联合药物，每周2次经腹膜内注射到一部分肿瘤小鼠中。同时，对剩下的肿瘤小鼠注射非免疫兔igg同种型(目录号10500c，invitrogen公司)作为对照。一定时间后，对小鼠进行检查。结果如图1a和图1b所示。

图1a为移植t241肿瘤细胞后的小鼠肿瘤体积结果图，图1b为移植t241-kras肿瘤细胞后的小鼠肿瘤体积结果图，vt表示注射非免疫兔igg后的肿瘤体积结果，anti-vegf表示注射抗vegf抗体后的肿瘤体积结果，anti-ang2表示注射抗ang2抗体后的肿瘤体积结果，anti-vegf+anti-ang2表示注射抗vegf抗体和抗ang2抗体后的肿瘤体积结果。图1a中，抗vegf抗体能较好的抑制肿瘤体积，抗ang2抗体抑制肿瘤体积的效果不明显，联合使用后抑制肿瘤体积的效果与单独使用抗vegf抗体相差不大，表明不具有ras突变的肿瘤对抗vegf抗体不产生耐药性，而联合使用也没有协同效果。图1b中单独使用抗vegf抗体和抗ang2抗体不能抑制肿瘤体积，联合使用时可以明显减小肿瘤体积，表明具有ras突变的肿瘤对抗vegf抗体和抗ang2抗体的单独使用产生耐药性，而联合使用时不具有耐药性，且抑制效果明显。

实施例2

提供mc38肿瘤细胞和引入ras突变的mc38-kras肿瘤细胞。本申请中的鼠mc38结肠癌细胞系由西班牙纳瓦拉pamplona纳瓦拉大学应用医学研究中心基因治疗部的rubénhernández博士友好提供。进行如实施例1相同的皮下移植和给药实验，一定时间后，对小鼠进行检查。结果如图2a和图2b所示。

图2a为移植mc38肿瘤细胞后的小鼠肿瘤体积结果图，图2b为移植mc38-kras肿瘤细胞后的小鼠肿瘤体积结果图，vt表示注射非免疫兔igg后的肿瘤体积结果，anti-vegf表示注射抗vegf抗体后的肿瘤体积结果，anti-ang2表示注射抗ang2抗体后的肿瘤体积结果，anti-vegf+anti-ang2表示注射抗vegf抗体和抗ang2抗体后的肿瘤体积结果。图2a中，抗vegf抗体能较好的抑制肿瘤体积，联合使用后抑制肿瘤体积的效果与单独使用抗vegf抗体相差不大，表明不具有ras突变的肿瘤对抗vegf抗体无耐药性，联合使用也没有协同效果。图2b中单独使用抗vegf抗体和抗ang2抗体不能抑制肿瘤体积，联合使用时可以明显减小肿瘤体积，表明具有ras突变的肿瘤对抗vegf抗体和抗ang2抗体的单独使用产生耐药性，而联合使用时不具有耐药性，且抑制效果明显。

实施例3

提供a549肿瘤细胞(含ras突变)，进行如实施例1相同的皮下移植和给药实验，一定时间后，对小鼠进行检查，结果如图3所示。图3为移植a549肿瘤细胞后的小鼠肿瘤体积结果图，vt表示注射非免疫兔igg后的肿瘤体积结果，anti-vegf表示注射抗vegf抗体后的肿瘤体积结果，anti-ang2表示注射抗ang2抗体后的肿瘤体积结果，anti-vegf+anti-ang2表示注射抗vegf抗体和抗ang2抗体后的肿瘤体积结果。图3中，抗vegf抗体和抗ang2抗体的单独时不具有抑制肿瘤体积的效果，联合使用后可以有效抑制肿瘤体积且效果明显。

对比例1

提供ht29肿瘤细胞(不含ras突变)，进行如实施例1相同的皮下移植和给药实验，一定时间后，对小鼠进行检查，结果如图4所示。图4为移植ht29肿瘤细胞后的小鼠肿瘤体积结果图，vt表示注射非免疫兔igg后的肿瘤体积结果，anti-vegf表示注射抗vegf抗体后的肿瘤体积结果，anti-ang2表示注射抗ang2抗体后的肿瘤体积结果，anti-vegf+anti-ang2表示注射抗vegf抗体和抗ang2抗体后的肿瘤体积结果。图4中，抗vegf抗体能较好的抑制肿瘤体积，联合使用后抑制肿瘤体积的效果与单独使用抗vegf抗体相差不大，表明不具有ras突变的肿瘤对抗vegf抗体无耐药性，联合使用也没有协同效果。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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