干预NLRP3炎症小体在制备治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的应用的制作方法

本发明涉及免疫治疗技术领域，更具体地，涉及干预nlrp3炎症小体在制备治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的应用。

背景技术：

冠状病毒病2019(covid-19)是由急性呼吸综合症冠状病毒2(sars-cov-2)引起的一种呼吸系统疾病，已成为大流行病。大多数covid-19患者表现出轻度至中度症状，但约15％进展为严重的肺炎，约5％最终发展为急性呼吸窘迫综合征(ards)，败血性休克和/或多器官功能衰竭。临床治疗的主要内容包括对症管理和氧气治疗，并为呼吸衰竭患者提供机械通气。尽管正在积极测试包括核苷酸类似物remdesivir在内的几种抗病毒药物对抗covid-19的效果，但尚未存在治疗covid-19的有效药。

新冠病毒肺炎的发病机理主要在于：免疫细胞产生的“炎症风暴”造成机体病理损伤。研究表明：nlrp3炎症小体促进il-1β的成熟和分泌以及细胞焦亡，在放大新冠病毒炎症因子风暴的过程中发挥重要作用，但是其激活具体机制尚不清楚。目前新型冠状病毒感染已经危及全球，全球新冠肺炎累计确认病例已经突破766万，累计死亡病例超过42万。最主要的原因之一就是缺少早期有效的药物治疗。因此，开发治疗新型冠状病毒肺炎的药物治疗方案十分迫切。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种治疗新型冠状病毒肺炎的靶点。

本发明的第二个目的是提供一种用于治疗新型冠状病毒肺炎的药物。

本发明的目的是通过以下方案实现：

一种用于治疗新型冠状病毒肺炎的靶点，所述靶点为nlrp3炎症小体。

本发明的研究构思如下：nlrp3蛋白是nod样受体家族的重要成员，是细胞内识别病原相关分子模式和危险信号相关分子模式的重要受体。nlrp3通过募集asc形成具有活性的炎症小体复合体，招募pro-caspase-1自剪切形成成熟的caspase-1(p20)进而剪切pro-il-1β成为成熟的il-1β(p20)。同时，nlrp3炎症小体的激活会诱导细胞一种炎症性细胞死亡即细胞焦亡。在自身免疫性疾病和炎症性疾病中发挥重要功能。本发明首先研究了新型冠状病毒m蛋白在nlrp3炎症小体激活中发挥的作用，结果发现新型冠状病毒m蛋白可以与nlrp3发生相互作用，并且新型冠状病毒m蛋白与nlrp3炎症小体的相互作用是正向的，nlrp3炎症小体促进il-1β的成熟和分泌以及细胞的焦亡，从而引发体内强烈的炎症反应，即加重新型冠状病毒肺炎病人的病情。

由此发明人再通过细胞实验构建新冠m蛋白过表达的巨噬细胞，继而发现过表达新冠m蛋白细胞因子il-1β的分泌增多，细胞焦亡增加，由此确定nlrp3炎症小体是治疗新型冠状病毒肺炎的靶点。

因此，本发明还提供一种用于治疗新型冠状病毒肺炎的药物，所述药物用于抑制nlrp3炎症小体的激活。

现有技术中已经存在一些能够抑制nlrp3炎症小体激活的物质，例如cy-09，mcc950和tranilast等，在一些具体的实施方式中，本发明所述药物包括mcc950抑制剂。

因此，本发明还提供mcc950抑制剂在制备治疗新型冠状病毒肺炎的药物的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明首次将nlrp3炎症小体作为免疫治疗新冠肺炎的靶点。利用nlrp3炎症小体的特异抑制剂及其免疫治疗方法可以实现对新冠肺炎的免疫治疗，其方法具有减缓炎性因子风暴的优点，适于新冠肺炎的综合治疗。

附图说明

图1a显示293t细胞新冠病毒结构蛋白s，e，m，n与nlrp3的相互作用；图1b显示a549细胞新冠病毒结构蛋白m与nlrp3的相互作用；图1c显示293t细胞新冠病毒结构蛋白m与nlrp3的免疫荧光共定位；图1d为thp1细胞新冠病毒结构蛋白e，m，n对nlrp3炎症小体激活的影响；图1e为thp1细胞新冠病毒结构蛋白e，m，n对细胞乳酸脱氢酶释放的影响；

图2a为thp1细胞mcc950抑制剂对新冠病毒m蛋白激活炎症小体的影响；图2b为thp1细胞mcc950抑制剂对新冠病毒m蛋白诱导细胞乳酸脱氢酶释放的影响；图2c为293t细胞mcc950抑制剂对新冠病毒m蛋白激活炎症小体的影响；图2d为a549细胞mcc950抑制剂对新冠病毒m蛋白诱导的asc聚集的影响。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1新冠病毒结构蛋白对炎症小体影响的研究

将293t细胞转染表达不同的新冠病毒蛋白的质粒s，e，m，n。收集细胞裂解液利用flag珠子与细胞裂解液共孵育，四度过夜孵育，洗脱，wb进行检测分析，结果如图1a所示，图1a结果表明，新冠病毒m蛋白与nlrp3有直接相互作用，其它结构蛋白与nlrp3没有直接相互作用。

将a549细胞转染表达新冠蛋白m的质粒，利用flag珠子与细胞裂解液共孵育，四度过夜孵育，洗脱，wb进行检测分析，结果如图1b所示，图1b结果表明，a549细胞中表达的新冠m蛋白可以与nlrp3相互作用。

将293t细胞转染表达带flag标签新冠病毒蛋白m的质粒，带ha标签表达nlrp3蛋白的质粒。用不同的免疫荧光二抗进行染色，共聚焦显微镜观察，结果如图1c所示，图1c免疫荧光结果表明，nlrp3与新冠m蛋白存在共定位。

将thp1细胞转染表达不同的新冠病毒蛋白的质粒e，m，n。收集细胞裂解液和细胞培养上清，wb检测不同分子的表达，结果如图1d所示，图1d结果表明，thp1细胞中新冠m蛋白可以激活nlrp3炎症小体，促进caspase-1和il-1β的成熟和分泌。同时，gsdmd-n的剪切增加，即新冠m蛋白激活nlrp3炎症小体促进细胞焦亡。

将thp1细胞转染表达不同的新冠病毒蛋白的质粒e，m，n。收集细胞培养上清，试剂盒检测乳酸脱氢酶释放，结果如图1e所示，图1e结果表明，新冠m蛋白促进thp1细胞乳酸脱氢酶的释放，即新冠m蛋白明显促进细胞死亡。

综上，可以得出结论：新冠m蛋白能够与nlrp3直接相互作用，促进nlrp3炎症小体的激活，il-1β细胞因子的成熟和释放以及细胞的焦亡。

实施例2nlrp3抑制剂mcc950对新冠病毒m蛋白激活nlrp3炎症小体的影响

将thp1细胞转染表达新冠病毒m蛋白的质粒，同时加入mcc950抑制剂处理。收集细胞裂解液和细胞培养上清，wb检测不同分子的表达，结果如图2a所示，图2a结果表明，mcc950抑制剂抑制新冠m蛋白激活的nlrp3炎症小体，抑制细胞因子il-1β的成熟和释放以及细胞焦亡。

将thp1细胞转染表达新冠病毒m蛋白的质粒，同时加入mcc950抑制剂处理。收集细胞培养上清，试剂盒检测乳酸脱氢酶释放，结果如图2b所示，图2b结果表明，mcc950抑制剂抑制新冠m蛋白诱导的乳酸脱氢酶的释放，即mcc950抑制新冠m蛋白诱导的细胞的死亡。

将293t细胞表达nlrp3炎症小体不同组份nlrp3，caspase-1，il-1β和asc，重建nlrp3炎症小体系统，同时加入mcc950抑制剂。收集细胞裂解液和细胞培养上清，wb检测不同分子的表达，结果如图2c所示，图2c结果表明，293t细胞中，mcc950抑制剂抑制新冠m蛋白激活的nlrp3炎症小体，抑制细胞因子il-1β的成熟和释放以及细胞焦亡。

将a549细胞转染表达新冠病毒m蛋白的质粒，同时加入mcc950抑制剂。收集细胞裂解液，加入葡聚糖硫酸钠(dss)37摄氏度交联，wb检测ass的聚集，结果如图2d所示，图2d结果表明，a549细胞中新冠m蛋白促进asc的聚集，mcc950抑制剂抑制m蛋白诱导的asc的聚集。

综上，可以得出结论：mcc950抑制剂抑制新冠m蛋白诱导的nlrp3炎症小体的激活，il-1β的成熟和释放，细胞焦亡以及asc的聚集。

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