一种猪细小病毒与乙型脑炎二联亚单位疫苗及其制备方法和应用与流程

本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种猪细小病毒与乙型脑炎二联亚单位疫苗及其制备方法和应用。

背景技术：

猪细小病毒(porcineparvovirus，ppv)为细小病毒科细小病毒属成员，是一种小的无包膜病毒，具有单链dna基因组结构，病毒粒子直径约20nm，基因组约5.2kb。ppv有两个开放阅读框(orf)，包括非结构蛋白(ns1)和主要结构蛋白(vp2)，vp2蛋白是诱导产生中和抗体的主要靶点，该病毒是引起猪繁殖障碍的主要疫病。该病主要表现为胚胎和胎儿的感染和死亡，特别是初产母猪发生死胎、畸形胎和木乃伊胎，但母猪本身无明显的症状。本病毒对外界理化因素有很强的抵抗力，对脂溶剂(如乙醚、氯仿等)有抵抗力；对酸、甲醛蒸汽和紫外线均有一定抵抗力；但是在0.5％漂白粉或氢氧化钠溶液中5min即可被杀死。

乙脑病毒(japaneseencephalitisvirus，jev)属于虫媒病毒黄病毒科黄病毒属，呈球状，核酸为单链rna，基因组全长11kb，外层有包膜，包膜表面有血凝素，直径40nm，内有衣壳蛋白(c)与核酸构成的核心，外披以含脂质的囊膜，表面有囊膜糖蛋白(e)刺突，即病毒血凝素，e蛋白包裹在病毒的表面，决定着病毒的毒力和宿主范围，可刺激产生中和抗体，囊膜内尚有内膜蛋白(m)，参与病毒的装配。妊娠母猪感染后发生流产和产死胎，公猪发生睾丸炎，还可引起肥育猪持续高热和新生仔猪脑炎，乙脑病毒对热抵抗力弱，乙醚、1:1000去氧胆酸钠以及常用消毒剂均可灭活病毒。在酸性条件下不稳定，适宜ph8.5～9.0。

这两种病毒都是引起母猪繁殖障碍的重要传染病，流行于猪群当中，主要引起母猪发生死胎、畸形胎和木乃伊胎，给猪场造成极大的经理损失，严重制约养猪业发展。目前现有技术防控此类传染病主要依靠疫苗接种，但近年来，猪多种病原体混合感染的现象越来越普遍，使得病情越来越复杂，不但给临床诊断和防控带来了极大困难，也给猪场带来了巨大的经济损失。目前，对于这两种疾病的防治主要是分别免疫ppv灭活疫苗和jev弱毒单苗，在规模化猪场，增加了免疫次数，增加了对猪体刺激，使猪体产生应激反应；此外乙型脑炎病毒疫苗为活疫苗，频繁多次使用增强了疫苗毒力返强的可能性。

技术实现要素：

为了至少解决一种现有技术存在的问题，本发明提供一种猪细小病毒与乙型脑炎二联亚单位疫苗及其制备方法和应用。

第一方面，本发明提供免疫原性组合物，包括：猪细小病毒vp2蛋白和乙型脑炎e蛋白；

所述猪细小病毒vp2蛋白和乙型脑炎e蛋白为利用seqidno：1和seqidno：2所示序列在昆虫-杆状病毒真核表达系统表达得到。

本方案使用杆状病毒表达系统对ppvvp2和jeve蛋白进行表达，为猪细小病毒vp2与乙型脑炎病毒e蛋白二联基因工程疫苗的制备提供技术基础。bac-to-bac杆状病毒表达系统在体外使用tn7转座子作用使外源基因插入到杆状病毒的基因组上，操作方便，快速有效，是目前使用最广泛的表达系统。同时昆虫细胞大规模悬浮培养技术成熟与应用，使得杆状病毒表达系统的应用更加广泛。杆状病毒载体表达系统使用p10启动子或ph启动子，将外源目的基因以单拷贝或者多拷贝形式插入到启动子下游，通过酶切酶连的方法获得重组杆状病毒，这种重组杆状病毒在昆虫细胞或虫体内感染的同时，使外源基因得到高效表达。

除此之外，本发明根据杆状病毒密码子的偏爱性，优化了ppvvp2和jeve蛋白，之后进一步在其氨基端引入acmnpvgp64信号肽序列，在羧基端引入8*his标签肽序列，有效提高了两者的表达水平。

进一步地，所述猪细小病毒vp2蛋白和所述乙型脑炎e蛋白的摩尔比为0.5～1.5:1～2。

进一步地，所述猪细小病毒vp2蛋白的含量为20～40μg/ml，所述乙型脑炎e蛋白的含量为40～60μg/ml。

进一步地，所述真核表达系统中使用pfastdual载体构建重组穿梭载体，和/或，所述真核表达系统中使用昆虫细胞highfive^tm进行目的蛋白的表达。

第二方面，本发明提供一种猪细小病毒与乙型脑炎二联亚单位疫苗，包括所述免疫原性组合物和佐剂。

进一步地，所述所述佐剂为isa15vg佐剂，所述猪细小病毒vp2蛋白和乙型脑炎e蛋白的质量总和与所述佐剂的质量比为3～5:1。

第三方面，本发明提供所述猪细小病毒与乙型脑炎二联亚单位疫苗的制备方法，包括：

将seqidno：1和seqidno：2所示序列的dna分子构建至重组载体上，通过昆虫-杆状病毒真核表达系统表达得到猪细小病毒vp2蛋白和乙型脑炎e蛋白，配以佐剂制备成二联亚单位疫苗。

进一步地，所述制备方法包括：

(1)将seqidno：1和seqidno：2所示序列的dna分子构建至pfastdual载体上得到重组质粒pfastdual-ppvvp2和pfastdual-jeve；

(2)将重组质粒pfastdual-ppvvp2和pfastdual-jeve分别转染至大肠杆菌感受态细胞dh10bac中制备得到重组杆粒rbac-ppvvp2和rbac-jeve；

(3)利用脂质体转染发将重组杆粒rbac-ppvvp2和rbac-jeve分别转染至sf9昆虫细胞中于25～29℃培养48-72h后收集细胞培养上清液得到重组杆状病毒，再将重组杆状病毒接种于昆虫细胞highfive^tm中进行目的蛋白ppvvp2和jeve的表达；

(4)将步骤(3)表达得到的目的蛋白ppvvp2和jeve配以佐剂制备成二联亚单位疫苗。

本发明进一步提供所述免疫原性组合物在制备用于猪细小病毒，和/或，乙型脑炎的免疫的药物中的应用。

进一步地，所述免疫原性组合物在所述药物中的含量为70～90μg/ml，一头份为2ml。

本发明具备如下有益效果：

本发明对编码猪细小病毒vp2蛋白和乙型脑炎e蛋白的核苷酸序列的核苷酸序列进行了优化，并结合了特殊信号肽gp64，有效提高了目的蛋白猪细小病毒vp2蛋白和乙型脑炎e蛋白的分泌表达水平，并且目的蛋白的结构与功能和天然状态完全一致，表达量高，且最大程度地保留了其免疫原性。

本发明进一步将猪细小病毒vp2蛋白和乙型脑炎e蛋白配以佐剂制成二联疫苗，实验验证具有较好的免疫原性和安全性，超过了现有的猪细小病毒灭活疫苗和乙型脑炎弱毒疫苗，可以很好地应用到猪细小病毒和乙型脑炎的免疫中。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的酶切鉴定的结果图；其中左图为pfastdual-ppvvp2的酶切鉴定结果，右图为pfastdual-jeve的酶切鉴定结果；两者中1号泳道为dl15000marker，2号泳道为酶切条带；

图2为本发明实施例1提供的经过纯化后的目的蛋白检测结果；其中，左图为ppvvp2，泳道1为sf9细胞对照，泳道2为gp64-vp2，泳道3为vp2，右图为jeve；

图3为本发明实施例2提供的猪细小病毒vp2与乙脑病毒e蛋白二联亚单位疫苗接种小鼠后ppvvp2hi抗体和jeve中和抗体检测的结果；

图4为本发明实施2提供的猪细小病毒vp2与乙脑病毒e蛋白二联亚单位疫苗在接种了猪后与ppv灭活疫苗的ppvvp2hi抗体水平对比结果以及与jeve弱毒疫苗的jeve中和抗体水平对比结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

(一)、构建重组转移载体pfastbac-ppvvp2和pfastbac-jeve

1.获取目的基因ppv-vp2，jev-e

根据昆虫细胞highfive^tm的偏爱性，人工合成1836bp的ppv-vp2和1467bp的jev-e，并在其氨基端引入acmnpvgp64信号肽序列，在羧基端引入8*his标签肽序列，为目的蛋白的亲和纯化奠定基础。合成的基因序列见seqidno:1和seqidno:2。合成的目的基因ppv-vp2和jev-e置于质粒载体puc-18(invitrogen公司)上，即以puc-ppvvp2和puc-jeve的形式取得。

2.构建重组转移载体pfastbac-ppvvp2和pfastbac-jeve

采用常规重组质粒构建流程和方法构建重组转移载体pfastbac-ppvvp2和pfastbac-jeve：

①酶切：本实施例采用bamhi、ecori两个酶(购自takara)切位点，对人工合成基因ppvvp2和jeve从puc-ppvvp2和puc-jeve上进行双酶切；同时用相同的内切酶对转移载体pfastdual进行酶切。体系如下：

表1转移载体pfastdual的酶切体系

酶切后用琼脂糖核酸电泳分离片段，并切胶回收。

②连接：

表2连接体系

③转化：将连接产物转入大肠杆菌感受态dh10b中，涂平板。

④提取重组质粒pfastdual-ppvvp2和pfastdual-jeve：从平板上挑取单克隆菌落，采用质粒抽提试剂盒提取质粒，bamhi、ecori进行酶切鉴定，酶切鉴定结果见附图1。

(二)、构建重组杆状病毒ac-ppvvp2及ac-jeve

1、获得重组穿梭载体：

取4μl重组转移质粒pfastdual-ppvvp2和pfastdual-jeve分别转入100μl大肠杆菌感受态dh10bac(购自gibcobrl)中，冰浴30min后，42℃热激90sec，再冰浴3min，加入900μl无抗性的soc，37℃复苏4h，涂布于三抗(卡那霉素、庆大霉素和四环素)lb平板中，37℃培养24-48h，通过蓝白斑筛选纯化阳性菌落、提取重组杆粒rbac-ppvvp2和rbac-jeve，提取方法：无菌挑取阳性白色菌落于三抗lb液体培养基中，培养12-16h，收集菌体用0.3ml溶液i(50mmol/l葡萄糖，10mmol/ledta，25mmol/ltris-cl(ph8.0))重悬，加入0.3ml溶液ii(0.2mol/lnaoh，1％sds)轻微混匀，室温静置5min，缓慢加入0.3ml溶液iii(3mol/lch3cook，ph5.0)混匀，冰浴5-10min，14000r/min离心10min，上清加到0.5ml异丙醇中，混匀冰浴5-10min，室温14000r/min离心15min，70％乙醇洗涤沉淀，干燥后溶于40μl无菌水中，立即使用或-20℃保存。

2、获得重组杆状病毒：

利用脂质体转染法，将提取的重组穿梭载体转染到sf9昆虫细胞中，于27℃培养，48-72h后细胞病变，收集细胞培养上清即可获得重组杆状病毒，立即使用或将收获的重组杆状病毒置于-80℃避光保存。转染方法按照脂质体说明书(cellfectiniireagent购自invitrogen)进行。

(三)、目的蛋白ppvvp2和jeve的表达与纯化

1、目的蛋白ppvvp2和jeve的表达：

将收获的重组杆状病毒接种于悬浮培养的昆虫细胞highfivetm(购自invitrogen)中，接毒剂量为0.1moi，细胞密度为0.8*106/ml，细胞体积为400ml。72-96h后收获细胞培养上清进行westernblot检测目的蛋白ppvvp2和jeve的表达。

2、目的蛋白的纯化：

纯化方法采用常规镍柱亲和层析法。具体操作步骤如下：取接毒后72-96h的highfivetm细胞培养上清，10000rpm离心去除细胞和细胞碎片，用0.45μm的滤膜过滤除去细小杂质；过滤后的上清与镍柱进行结合过柱；洗杂缓冲液(50mm咪唑，20mmtris，200mmnacl)过柱洗杂；洗脱缓冲液(300mm咪唑，20mmtris，200mmnacl)过柱洗脱；洗脱液用透析缓冲液(20mmtris，200mmnacl)4℃透析过夜，得到目的蛋白。进行westernblot检测纯化后的蛋白，并同时按照上述方法表达了不携带gp64信号肽的ppvvp2进行对比。检测结果见附图2，其中a对比了携带信号肽gp64和不携带信号肽gp64的ppvvp2的表达水平，b为jeve的检测结果。

实施例2

(一)、猪细小病毒vp2与乙脑病毒e蛋白二联基因工程疫苗的制备

本实施例将实施例1纯化得到的ppvvp2和jeve蛋白测定浓度后过滤，二者等量混匀，再与isa15vg佐剂(购自seppic公司)按照4:1的比例乳化制备成亚单位二联疫苗，使每毫升疫苗中的ppvvp2和jeve抗原含量均为40ug，置于4℃保存待用。

(二)、猪细小病毒vp2与乙脑病毒e蛋白二联基因工程疫苗安全性评价

购买16-18g雌性balb/c小鼠10只，分为a、b两组，每组5只。a组每只小鼠皮下注射0.3ml步骤(一)制得的vp2与e蛋白二联疫苗；b组每只小鼠注射0.3ml透析缓冲液(20mmtris，200mmnacl)；连续观察14天，两组小鼠状态相同且均无异常反应，此结果表明该疫苗对小鼠是安全的。

购买约2月龄ppv和jev阴性猪6头，随机分成a、b两组，每组3头。a组每头猪免疫1头份，颈部肌肉注射2ml步骤(一)制得的vp2与e蛋白二联疫苗，3周后进行第二次免疫；b组不免疫，作为阴性对照。连续观察至第二次免疫后28日，观察期内免疫猪健康状况良好，与非免疫猪一致，未出现因疫苗注射引起的任何局部或全身不良反应，此结果表明该疫苗对本体动物猪是安全的。

(三)、猪细小病毒vp2与乙脑病毒e蛋白二联亚单位疫苗有效性评价

1.猪细小病毒vp2与乙脑病毒e蛋白二联亚单位疫苗在小鼠体内进行有效性评价

购买6-8周龄的雌性balb/c小鼠20只，随机分成a、b两组，每组10只。a组每只小鼠背部皮下注射0.2ml，2周后加强免疫一次，b组不免疫。分别在首免2周，二免两周，二免四周采血分离血清进行血凝效价测定和中和抗体测定，ppvvp2hi抗体水平检测和jeve中和抗体检测见图3。

2.猪细小病毒vp2与乙脑病毒e蛋白二联亚单位疫苗在猪体内进行有效性评价

为了进一步评价上述制备二联亚单位疫苗对本体动物猪的免疫效力，选购约2月龄ppv和jev阴性猪16头，随机分成4组，每组4头。第1组每头猪免疫1头份(2ml)猪细小病毒vp2与乙脑病毒e蛋白二联亚单位疫苗，第2组每头猪免疫1头份ppv灭活疫苗(由武汉科前-科细宁-猪细小病毒灭活疫苗wh-1株制得，可市售购得)，第3组每头猪免疫1头份jev弱毒疫苗(由武汉科前-科乙宁-猪乙型脑炎活疫苗sa-14-14-2株制得，可市售购得)，均颈部肌肉注射，3周后进行第二次免疫；b组不免疫，作为阴性对照。首免后7天14天,28天和42天进行前腔静脉采血，进行hi效价检测和中和抗体检测。检测结果见附图4。结果表明该疫苗良好的免疫原性，能够激发机体产生保护性中和抗体，并且本发明的猪细小病毒vp2与乙脑病毒e蛋白二联亚单位疫苗免疫后产生的抗体水平与jev弱毒单苗的免疫效果相当，优于ppv灭活疫苗的免疫效果。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>武汉科前生物股份有限公司

<120>一种猪细小病毒与乙型脑炎二联亚单位疫苗及其制备方法和应用

<130>khp201114918.7

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1836

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<211>1467

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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