一种氟硼二吡咯-钆缀合物纳米诊疗试剂的制备及应用的制作方法

本发明属于化学生物学领域，研究内容是基于磁共振成像剂共价修饰的氟硼二吡咯（bodipy）染料分子，通过与高分子聚合物共组装形成纳米结构，用于肿瘤的多模态成像与光热治疗。

背景技术：

多模态成像具有重要的临床应用潜力，其能够结合不同成像方式的优点，可以同时获得多种成像信息，从而提高临床判断的准确性。作为临床诊断最常用的技术，磁共振（mr）成像具有优异组织穿透深度，高的软组织对比度和时空分辨率。但是，mr成像具有自身的缺点，例如相对较低的灵敏度和较长的检测时间。光声（pa）成像具有快速实时扫描，高的灵敏度和较深的组织穿透力（最大≈5cm）的优点。因此，可以将pa成像与mr成像结合，mr成像可以对术前和术中的宏观轮廓进行扫描，而pa成像可以提供高灵敏度和高分辨率的组织结构和分子信息。因此，双模态成像系统将整合pa和mr成像的优势，实现高灵敏度和空间分辨率的成像效果。近年来，已报道了许多pa和mr成像体系。然而，许多纳米复合材料是无机材料，其在生命系统中的毒性和清除率常常受到关注。同时，在许多有机材料组成的多模态系统中，每个组件只完成其自身的成像功能，不同组件之间很少能够相互提升成像功能。

通过控制有机发色团以滑动堆积方式形成j聚集体，可以实现不同于单体的光物理特性的提升，包括吸收光谱的显著红移，摩尔消光系数的增强和吸收光谱变窄。因此，j聚集体在生物医学和光电设备领域中越来越受到关注。除了这些吸引人的光学特性外，j聚集还可以驱动染料的自组装形成高度有序的结构，在超分子化学和活性聚合领域得到了广泛的研究。在生物医学领域，大多数基于j聚集体的应用（例如生物成像，生物传感和光疗）仅利用了其优异的光物理特性。但是很少利用j聚集诱导的高度有序的结构来改善材料性能或开发新功能。另一方面，通过超分子方法控制诸如催化剂，识别单元、荧光团、磁共振（mr）造影剂等官能团的组装或空间分布，是一种增强纳米材料性能的有效策略。

bodipy分子作为一种常见的荧光染料，其可以通过简单的方法形成j聚集体。但是由于其差的水溶性，在生命体中的应用常常受到限制。因此，本发明选择mr成像常用的造影剂dota-gd（iii）作为亲水性官能团，通过共价键与bodipy结合。bodipy染料与亲水性gd（iii）螯合物共价结合后，在水中可以形成稳定的j聚集体纳米结构，进而实现mr信号增强与光热特性的提升。这项发明为j聚集体的功能化应用提供了新的思路。

技术实现要素：

本发明涉及一种氟硼二吡咯-钆(bd-gd)缀合物纳米诊疗试剂的制备及应用，该诊疗试剂由bd-gd和聚合物peg113-b-pcl8(p)组成。首先，将氟硼二吡咯分子与水溶性磁共振成像(mri)造影剂alk-dota-gd共价连接，得到bd-gd缀合物。然后，将聚合物p与bd-gd共组装，形成了在水中稳定且粒径可控的纳米组装体。相对于bd-gd单分子而言，制备的纳米组装体吸收红移了138纳米、摩尔消光系数增加了近2倍、光热转换效率达到71.5%，可用于近红外光声成像和光热治疗；同时，相比于alk-dota-gd，纳米组装体的mri信号增强了1.4倍，实现了增强的mri效果。本发明制备的纳米诊疗试剂在活体肿瘤成像与治疗应用中，实现了增强的光声与磁共振双模态成像与良好的光热治疗效果。

本发明提供的bd-gd分子，其结构式如图1。

本发明提供peg113-b-pcl8（p）聚合物分子，其结构式如图2。

本发明所提供的技术方案如下：

我们首先合成了易于合成的bodipy分子作为j聚集模块，通过click反应与亲水性的磁共振成像剂dota-gd共价连接，在高分子聚合物p作用下制备j聚集纳米组装体。

紫外-可见吸收光谱检测表明：制备得到的j聚集体纳米组装体最大细吸收为815nm，相对于bodipy染料的单分子最大吸收677nm红移了138nm。透射电子显微镜与原子力显微镜检测其形貌为纳米片。纳米组装体在纯水、pbs、dmem、dmem(10%fbs)等溶液中4℃放置一周，紫外吸收无显著变化，具有较好的稳定性。

j聚集体纳米组装体制备方法：取配制的1mg/ml的p水溶液9.5ml，缓慢滴加至的bd-gd(0.5ml，1mg/ml)的dmf溶液中，在900rpm条件下搅拌过夜。之后在95℃加热10min,自然冷却至20℃，转移至超滤管中（10k)，在2000rpm条件下离心1个小时，弃去下层水溶液，在上层加入水并使组装体重新分散，并再次离心。反复操作三次后，将组装体过0.22μm滤膜，4℃保存备用。

对于本发明中提出的j聚集纳米组装体，具有以下突出优势：（1）将疏水性bodipy染料与亲水的dota-gd共价结合，合成的化合物分子在水溶液中形成j聚集体并具有很好的稳定性；（2）纳米组装体吸收光谱红移进入近红外光区，摩尔消光系数增加近一倍，并具有较高的光热转化效率与光稳定性；（3）纳米组装体进一步增强了dota-gd的磁共振成像效果。

综上，本发明中提出的j聚集体纳米组装体的制备以及应用具备以下有益效果：形成的纳米组装体具有较高的光热转化效率与光稳定性；通过利用bodipy染料在水中j聚集，实现了磁共振成像的增强；通过对bodipy染料功能化修饰，增加了聚集体在水中的稳定性。

通过对bodipy染料功能化修饰，实现多模态成像。

附图说明

图1为本发明中所合成的化合物分子结构式。

图2为本发明提供的peg113-b-pcl8（p）聚合物分子结构式。

图3为本发明中所设计分子的合成路线。

图4为本发明中制备的纳米组装体分别在水和dmf中的吸收光谱。

图5为本发明中制备的纳米组装体的形态表征。

图6为本发明中制备的纳米组装体分别在纯水、pbs、dmem、dmem(10%fbs)中的稳定性。

图7为本发明中制备的纳米组装体经过五次光热循环过程中温度的变化情况。

图8为本发明中制备的纳米组装体在820nm波长的光声信号曲线。

图9为本发明中制备的纳米组装体bd-gd/p与小分子alk-dota-gd在水溶液中弛豫率的变化。

图10a为不同实验组的荷瘤小鼠，在静脉给药治疗一次后肿瘤体积的变化；图10b为不同组中荷瘤小鼠治疗结束后，解剖得到的肿瘤对比照片。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明做进一步的深入说明，实施例是为了对本发明做详细描述，但本发明的保护范围不仅仅限于以下实施例。

实施例1：两亲性bd-gd分子的合成，合成路线见图3：化合物bd-gd的合成。将化合物bd-az（186.9mg,0.2mmol）和alk-dota-gd（59.6mg,0.1mmol），抗坏血酸钠（19.8mg,0.1mmol）和无水硫酸铜（8.0mg,0.05mmol）溶解在10ml四氢呋喃/水（4ml/1ml）溶液中。在氮气保护下，室温搅拌反应48h。反应结束后，过滤、旋蒸除去溶剂，将残余物通过hplc纯化，得到黑色固体产物bd-gd(23.1mg)产率为15.1%。hrms(esi):calculatedforc66h81bcl2f2gdn10o15⁺[m+h]⁺m/z1530.4557;found1530.4547。

实施例2。bd-gd/p纳米组装体的制备方法：取0.5mlbd-gd分子的dmf溶液(1mg/ml)，缓慢滴入9.5ml（1mg/ml）p水溶液，900rpm条件下搅拌过夜。在95℃条件下加热10min,自然冷却至20℃，转移至超滤管中（10k)，在2000rpm条件下离心1h，弃去下层水溶液，在上层加入水并使组装体重新分散，再次离心。反复操作三次后，使用0.22μm滤膜对组装体进行过滤，4℃保存备用。（浓度19.0g/lp;0.653mmbd-gd）。组装体bd-gd/p在水和dmf中的吸收光谱如图4所示。

实施例3。对bd-gd/p纳米组装体的光热转化性能进行研究：取制备的bd-gd/p（5μmbd-gd）纳米组装体，使用808nm激光器照射样品（1w/cm²,10min），使其自然降温冷却，以此为一个循环，反复照射样品五次，检测样品的光热稳定性。如图7所示，bd-gd/p纳米组装体光热转化稳定，具有好的耐光漂泊能力。

实施例4。对bd-gd/p纳米组装体的光声特性进行研究：取不同浓度的bd-gd/p（0，2.5，5，10，20μmbd-gd）纳米组装体水溶液，装入琼脂糖凝胶制备的模具中，通过光声成像仪器检测样品在680-900nm的光声信号。光声成像检测结果如图8所示。

实施例5。对bd-gd/p纳米组装体磁共振成像进行研究。分别取不同浓度的bd-gd/p和alk-dota-gd样品溶液，使用1.2t磁共振成像系统检测它们的弛豫时间变化(t1)。以样品浓度为横坐标，弛豫时间的倒数为纵坐标，进行曲线拟合求弛豫率r1变化。如图9所示。

实施例6。bd-gd/p应用于活体抗肿瘤研究：将本发明制备的光热纳米试剂bd-gd/p通过尾静脉注射，经过一次光热（808nm,0.5w/cm²,10min）治疗即可抑制肿瘤生长，实现肿瘤的热消融，实验结果如图10所示。

在本发明中将亲水性的磁共振成像剂与j聚集染料共价结合，使其形成的纳米组装体在水中具有良好的稳定性、高的光热转化效率、突出的抗光漂白能力，同时bodipy染料的聚集增加了磁共振成像信号。

聚集体通过聚合物共组装，最终可以制备尺寸为100多纳米的纳米组装体。

本发明提出的整套材料制备方法，为j聚集在多模态成像的研发开辟了新的路径。

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