一种有效抑制锦竹组培过程中丛芽褐化的方法与流程

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种有效抑制锦竹组培过程中丛芽褐化的方法。

背景技术：

锦竹(hibanobambustranguillansf.shiroshima)又名白纹阴阳竹，隶属于阴阳竹属，混生竹种。竹高1.5-2m，径0.8-1.4cm，初植几年竹丛较矮，叶片披针形至阔披针形，长9-25cm，宽1.3-5cm。笋期4月下旬，新叶黄白色，渐绿间有较宽的黄白色条纹，叶色亮丽，在我国被列为珍稀彩叶观赏地被竹种(史军义,易同培,马丽莎,王海涛,杨林.我国的彩色竹资源及其保护利用，四川林业科技2016,27(3)：42-48)。

竹类植物枝繁叶茂、四季常青，在涵养水源、保持水土、防风固沙、调节气候、净化空气和减少噪音等方面意义重大。同时竹子经冬不凋，形态独特，风姿秀雅，具有很高的观赏价值，是一类重要的园林观赏植物。近年来，全球对生存环境质量问题的关注、城市化进程的快速推进和人们生活水平的不断提高，竹类植物的生态和环境景观功能日益受到人们的重视。随着观赏竹受到的关注越来越多，传统的繁殖方法如移竹、竹蔸、埋鞭、埋秆、埋节等具有消耗母竹多、种苗运输不便、劳动强度大、繁殖系数低等缺点，难以满足当前商业化生产的要求。针对这一现象，植物组织培养技术开始运用到观赏竹的生产中来，目前对锦竹组培研究已有报道(曾余力,王旭锋,林新春,桂仁意,张翠萍,黄丽春.白纹阴阳竹试管快繁技术研究，西南林学院学报,2010,30(3)：38-41)，但锦竹在快繁过程中丛芽易出现褐化现象，外植体容易受到褐化而死亡，严重阻碍快繁体系的建立。

外植体发生褐变是植物组织培养中的三大难题之一，也是影响组培能否成功的重要因素。有研究表明，导致褐化的主要原因是由多酚氧化酶作用于天然底物酚类物质形成醌而引起的，通过加入抗氧化剂、吸附剂以及调整渗透压可较好地控制褐化现象发生。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明要解决的技术问题在于提供一种有效抑制锦竹组培过程中丛芽褐化的方法，通过在培养基中添加抗褐化剂和调整蔗糖浓度，从而减轻锦竹组培苗褐化现象的发生，有效提高锦竹丛芽的抗褐化能力，在较短时间内获得大量健康的锦竹丛芽，为锦竹快繁体系的建立奠定基础。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种有效抑制锦竹组培过程中丛芽褐化的方法，包括以下步骤：

(1)外植体的选取：于夏季6-8月，选取锦竹当年生健康、无病害的半木质化带芽枝条，经预处理后备用；

(2)消毒灭菌：用次氯酸钠溶液及酒精对预处理后的外植体进行消毒灭菌，得到无菌锦竹外植体；

(3)初代诱导培养：将无菌锦竹外植体接种到诱导培养基上进行丛芽诱导，得到无菌芽；其中，诱导培养基为ms+4mg/l6-ba(6-苄氨基腺嘌呤)+0.5mg/lkt(激动素)+0.5mg/ltdz(噻二唑苯基脲)；

(4)继代增殖培养：在初代培养中获得健康无菌苗后，将其剪成3-5个芽为一丛，移至不定芽增殖培养基中进行继代增殖培养30d；所述增殖培养基为ms+5mg/l6-ba+0.2mg/lkt，增殖培养基中添加抗褐化剂或蔗糖；所述抗褐化剂为pvp(聚乙烯比咯烷酮)、l-glu(l-谷氨酰胺)或活性炭，调整蔗糖浓度以改变培养基中渗透压。

所述有效抑制锦竹组培过程中丛芽褐化的方法，所述pvp的浓度为0.2～2g/l，l-glu的浓度为0.05～1g/l，活性炭的浓度为0.2～2g/l；所述蔗糖浓度为10～30g/l；

所述有效抑制锦竹组培过程中丛芽褐化的方法，步骤1)中外植体预处理：将室外采集的当年生枝条剪成0.5～1.5cm长的带芽茎段，用洗洁精清洗1min，自来水冲淋3-4h。

所述有效抑制锦竹组培过程中丛芽褐化的方法，步骤2)中外植体消毒灭菌处理：在超净工作台上先用质量分数为70％的酒精浸泡45～60s，无菌水冲洗3-5次，再用质量分数为0.5％的次氯酸钠消毒12-17min，无菌水冲洗4～5次。

所述有效抑制锦竹组培过程中丛芽褐化的方法，步骤5)中l-谷氨酰胺浓度为50mg/l；蔗糖浓度为10g/l。

所述有效抑制锦竹组培过程中丛芽褐化的方法，所述诱导培养基和增殖培养基均在灭菌前将ph调到5.80，灭菌条件为121℃下15min。

所述有效抑制锦竹组培过程中丛芽褐化的方法，初代诱导培养和继代增殖培养时培养室温度为25±1℃，光周期为14h/黑暗10h，培养物表面的光照强度约为3000lx。

有益效果：与现有的技术相比，本发明的优点包括：

(1)本发明优化了锦竹组织培养各个阶段的操作方法，有效降低褐化率至5％以下，解决了锦竹组培褐化率高的难题。

(2)本发明采用了pvp(聚乙烯吡咯烷酮)、l-谷氨酰胺及活性炭三种抗褐化剂，分别添加在培养基中，通过吸附外植体释放的酚类物质以及氧化后形成的醌类物质，从而达到预防褐化的效果。

(3)本发明进一步优化了锦竹组织培养增殖阶段的培养基配方，调整了培养基中蔗糖的浓度，有效降低了锦竹组培过程中的褐化问题。

(4)锦竹外植体伤口处积累的酚类物质时间过长会引起褐化，本发明将继代培养时间缩短到20天以内，可以减轻锦竹组培过程中丛生芽褐化现象。

附图说明

图1为锦竹外植体图；

图2为诱导丛芽芽图；

图3为锦竹增殖丛芽图；

图4为锦竹增殖30d丛芽图；

图5为褐化的锦竹丛芽图；

图6为添加不同浓度pvp的锦竹丛芽生长情况对照图；

图7为添加不同浓度l-谷氨酰胺的锦竹丛芽生长情况对照图；

图8为添加不同浓度活性c的锦竹丛芽生长情况对照图；

图9为不同蔗糖含量的锦竹丛芽生长情况对照图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

实施例1

一种有效抑制锦竹组培过程中丛芽褐化的方法。包括以下步骤：

(1)外植体的选取：于夏季6-8月，选取锦竹当年生健康、无病害的半木质化带芽枝条，将室外采集的当年生枝条剪成1cm左右的带芽茎段，用洗洁精清洗1min，自来水冲淋3-4h。

(2)消毒灭菌：经预处理后的外植体，在超净工作台上先用质量分数为70％的酒精浸泡1min，无菌水冲洗3-5次，再用质量分数为0.5％的次氯酸钠消毒15min，无菌水冲洗4～5次；置于起始培养基中：ms+4mg/l6-ba+0.5mg/lkt+0.5mg/ltdz，通过以上消毒方法处理后的锦竹鞭芽接种后，无菌率最高，芽诱导成活率高(表1)。

表1不同消毒剂处理不同时间对外植体培养的影响

(3)初代诱导培养：将获得的无菌锦竹外植体接种到诱导培养基上进行丛芽诱导，一周后丛生芽形成；其中，诱导培养基为ms+4mg/l6-ba+0.5mg/lkt+0.5mg/ltdz；本发明中的ms指的是ms培养基成分(murashige&skoogmedium，1962，physiol.plant15：473-497)；

(4)继代增殖培养：在初代培养中获得健康无菌苗后，将其剪成3-5个芽为一丛，移至不定芽增殖培养基中进行继代增殖培养；在9种配方中，从增殖系数以及苗生长高度看，最优增殖培养基为ms+5mg/l6-ba+0.2mg/lkt。

表2不同植物激素浓度对锦竹丛芽增殖的影响

注：不同小写字母表示同列在0.05水平上差异显著

(5)防褐化培养：在增殖培养基ms+5mg/l6-ba+0.2mg/lkt(蔗糖为30g/l)中添加不同浓度的pvp、l-谷氨酰胺或活性炭，其中pvp的浓度为0.2g/l、1g/l、2g/l；l-谷氨酰胺浓度为50mg/l、0.2g/l、1g/l；活性炭浓度为0.2g/l、1g/l、2g/l；蔗糖浓度为10g/l、20g/l、30g/l。通过研究，发现添加不同浓度pvp以及活性炭对抑制锦竹组培苗褐化效果不佳。而不同浓度l-谷氨酰胺浓度，锦竹丛芽褐化率表现差异，添加50mg/ll-谷氨酰胺下，褐化率仅为4.81％，但随着浓度的增加，褐化率也随之增加。同时，通过调整培养基中蔗糖浓度来改变培养基的渗透压，进一步筛选适合锦竹丛芽增殖生长的培养基，蔗糖浓度为10g/l、20g/l、30g/l，实验发现，在蔗糖浓度为10g/l时，锦竹丛芽褐化率仅为3.05％，丛芽长势好，花叶多，叶片嫩绿色，叶大且展开。

表3不同抗褐化剂对锦竹丛芽增殖的影响

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