光叶兔儿风在生物防治方面的用途及其生物防治药剂及制备方法与流程

本发明属于生物防治领域，具体涉及光叶兔儿风在生物防治方面的用途及其生物防治药剂及制备方法。

背景技术：

西花蓟马(frankliniellaoccidentalis)，其属于缨翅目(thysanoptera)蓟马科(thripidae)花蓟马属(frankliniella)，是当今世上对作物危害最严重的世界性害虫之一。该害虫繁殖速度快，寄主范围广，造成叶片、果实出现锈褐色斑点，果实商品性丧失，还可能传播番茄斑萎病毒病(tswv)和凤仙花坏死斑病毒(insv)。西花蓟马为多食性害虫，寄主植物大约有66个科500多种植物，其中包括很多重要的经济作物，如草莓、番茄、苹果、葡萄、青椒、甜瓜、黄瓜、菊花、玫瑰、凤仙花、矮牵牛、大桐岩、大丽花等。随着西花蓟马的不断扩散和寄主植物名录的深入研究，其寄主种类将不断增加。西花蓟马成虫聚集在心叶、幼果和花上危害。初期心叶边缘出现小缺刻，叶片出现白色斑点，严重时叶片卷曲、畸形，受害叶片及果实出现锈褐色或锈色透明斑，造成落花、减产和种子发育不良，严重的植株枯萎。西花蓟马除直接危为害寄主植物外，还能传播多种病毒病，其中最重要的是番茄斑萎病毒属的两种病毒：仙坏死斑点病毒和番茄斑点萎蔫病毒，这两种病毒均严重感染多种重要农作物，经常造成重大的农作物损害。

研究表明，北京地区西花蓟马田间种群对多杀菌素的抗性倍数达到80-150倍，对乙基多杀菌素抗性倍数高达7730倍，仅2011-2015年，对乙基多杀菌素的lc50值最高增加了258倍。同样，西班牙、美国、澳大利亚等地蓟马对多杀菌素及阿维菌素均产生极高的抗药性。近年来蓟马危害显著增大，单一药剂防治及色板诱杀等防控措施效果有限，已经成为制约有机、绿色农业生产发展的重大害虫。因此开发环境友好型植物源药剂来防治西花蓟马是非常必要且迫切的。

光叶免儿风(ainsliaeaglabrahemsl)为菊科免儿风属植物，是中国特有的植物。主要分布在中国大陆的四川、云南等地，多生长于海拔800米至1,200米地区的林缘和林下荫湿草丛中，目前尚未由人工引种栽培。多年生草本，根茎，短粗被疏绵毛，,须根细长，簇生。茎直立，茎上无毛，茎粗壮，肉质，多年生木质化,通常为紫红色。叶基生，并互生，叶片革质，长椭圆形至长披针形、阔披针形、卵状披针形，顶端尾尖，基部楔形有略延长，边缘具疏齿，齿端成小尖突起，叶多无毛，向上面绿色有多数疣状突起的小刺，向下面绿色或紫红色或仅有叶脉为紫红色:网脉明显，网眼较疏，中脉在向上面明显凸起，在向下面各个脉络清晰可见，有6、7对侧脉，其中靠下的3对较粗，尾部与中脉平行，基部与中脉成约为45°的锐角。花的数量极多，头状花序，具三朵小花，花很小。头状花序又于茎顶复组成开展的圆锥花序，圆头状花序梗和圆锥花序轴的末次分枝被短柔毛:总苞圆筒形，直径约1～4mm。花淡黄色或白色，管状花，长约3mm。花为两性花，花冠藏于丝状冠毛之中，花药内藏，顶端钝，雄蕊多数，结合成聚药雄蕊，子房下位，胚珠1枚，花柱单一，分枝钝，稍叉开。瘦果纺锤形，干时黄褐色，具毛茸。光叶兔耳风根茎较粗，棕黑色，表面被稀疏绵毛，须根细长，质脆。

目前有关光叶兔儿风在生物防治领域方面的应用未见报道。

技术实现要素：

基于上述空白，本发明意外发现光叶兔儿风在生物防治领域的用途，尤其它对害虫的杀灭作用，提取自光叶兔儿风的精油可有效防治西花蓟马。

本发明的技术方案如下：

光叶兔儿风在生物防治方面的用途。

所述生物防治指用光叶兔儿风防治害虫。

所述害虫指西花蓟马。

一种生物防治药剂，其特征在于，其活性成分包括光叶兔儿风精油。

所述光叶兔儿风精油为光叶兔儿风地上部分提取的精油。

优选地，所述光叶兔儿风精油的活性成分包括：1,8-桉叶素、龙脑、α-萜烯醇、黄樟素、丁香酚、肉豆蔻醚、榄香素、细辛脑、诺卡酮；

优选地，所述光叶兔儿风精油包括下述重量百分比的活性成分：6.78％1,8-桉叶素、4.17％龙脑、3.45％α-萜烯醇、3.21％黄樟素、3.78％丁香酚、6.28％肉豆蔻醚、22.92％榄香素、1.55％细辛脑、1.21％诺卡酮；

优选地，所述生物防治药剂为杀虫剂；

优选地，所述杀虫剂为西花蓟马杀虫剂。

一种生物防治药剂的制备方法，其特征在于，对光叶兔儿风进行精油提取。

对光叶兔儿风的地上部分进行精油提取；

优选地，将光叶兔儿风的地上部分进行水煮、冷凝、萃取而得。

优选地，所述水煮指用水煮沸处理4-8h，优选6h，这样能把精油成分尽可能完全地从新鲜植株中煮出来。

优选地，所述萃取指用正己烷萃取；

更具体地，使用2l的分液漏斗，正己烷：蒸出物＝1:1，分层后保留已溶解精油的正己烷层。

优选地，所述萃取的水浴温度为38-45℃，优选40℃，正己烷在此温度下，能快速蒸发、冷凝回收。

优选地，萃取所得的混合物经干燥后蒸发去除正己烷；

优选地，所述干燥指采用无水硫酸钠干燥；

优选地，所述蒸发指采用旋转蒸发仪蒸发。

优选地，所述精油比重为0.093g/ml。

一种防治西花蓟马的方法，其特征在于，采用光叶兔儿风对西花蓟马进行防治。

所述防治指，用光叶兔儿风精油杀灭西花蓟马；

优选地，所述光叶兔儿风精油为光叶兔儿风地上部分提取的精油；

优选地，所述光叶兔儿风精油的杀虫活性成分包括：1,8-桉叶素、龙脑、α-萜烯醇、黄樟素、丁香酚、肉豆蔻醚、榄香素、细辛脑、诺卡酮；

优选地，所述光叶兔儿风精油包括下述重量百分比的杀虫活性成分：6.78％1,8-桉叶素、4.17％龙脑、3.45％α-萜烯醇、3.21％黄樟素、3.78％丁香酚、6.28％肉豆蔻醚、22.92％榄香素、1.55％细辛脑、1.21％诺卡酮；

优选地，所述杀灭方式为触杀，和/或，熏杀；

优选地，所述用光叶兔儿风精油杀灭西花蓟马指，将光叶兔儿风精油的丙酮溶液和西花蓟马置于统一密闭空间内；

优选地，所述光叶兔儿风精油的丙酮溶液中光叶兔儿风精油浓度为2-10μl/ml。

本发明通过实验室筛选意外发现光叶兔儿风的杀虫作用，并以此验证了其在生物防治领域的突出效果，因此本发明请求保护光叶兔儿风在杀虫中的用途，光叶兔儿风精油制备以光叶兔儿风植物为原料，光叶兔儿风精油采用水煮/蒸馏、冷凝、萃取、脱水、蒸发溶剂步骤制备而得，光叶兔儿风精油在杀虫药剂中的用途，特征在于所述药剂的药效成分为光叶兔儿风精油。同时本发明还提供一种基于光叶兔儿风精油的生物防治药剂，该药剂可高效杀灭西花蓟马，同时无毒无害、又不产生污染，是安全可靠、成本低廉、环保高效的新型杀虫剂。

具体实施方式

下面采用具体的实施例对本发明的内容做进一步的详细描述，但并不以此限制本发明的保护范围。

生物材料的来源

试虫来源：西花蓟马为申请人实验室人工饲养，也可通过野外采集的方式获取并加以饲养繁殖。

植物来源：光叶兔儿风为野生植株，为发明人于2019年9月在云南省昭通市采集并移栽至申请人实验室苗圃。

本发明实验例所使用的试剂，未特别说明的试验试剂均为本领域常规试剂或采用本领域常规方法获得，可通过商业途径购买，均为分析纯试剂。如无特殊说明，实验例进行的实验操作均为本领域常规操作。第1组实施例、本发明的光叶兔儿风生物防治新用途

本组实施例提供光叶兔儿风在生物防治方面的用途。

在具体的实施例中，所述生物防治指用光叶兔儿风防治害虫。

在更具体的实施例中，所述害虫指西花蓟马。

本领域技术人员可根据本发明的启示，将光叶兔儿风用于其它生物防治领域，例如，用于防治除西花蓟马以外的其它害虫，包括但不限于：蚊子、苍蝇、跳蚤、蟑螂、蚜虫、蝗虫、蚧壳虫、虱、蛾等。第2组实施例、本发明的生物防治药剂

本组实施例提供一种基于光叶兔儿风的生物防治药剂。在本组所有的实施例中，所述生物防治药剂具备如下共同特征：所述生物防治药剂的活性成分包括光叶兔儿风精油。

在具体的实施例中，所述光叶兔儿风精油为光叶兔儿风地上部分提取的精油。

优选地，所述光叶兔儿风精油的杀虫活性成分包括：1,8-桉叶素、龙脑、α-萜烯醇、黄樟素、丁香酚、肉豆蔻醚、榄香素、细辛脑、诺卡酮；

优选地，所述光叶兔儿风精油包括下述重量百分比的杀虫活性成分：6.78％1,8-桉叶素、4.17％龙脑、3.45％α-萜烯醇、3.21％黄樟素、3.78％丁香酚、6.28％肉豆蔻醚、22.92％榄香素、1.55％细辛脑、1.21％诺卡酮；

优选地，所述生物防治药剂为杀虫剂；

优选地，所述杀虫剂为西花蓟马杀虫剂。

第3组实施例、本发明生物防治药剂的制备方法

本组实施例提供一种生物防治药剂的制备方法，其特征在于，对光叶兔儿风进行精油提取。

在优选的实施例中，所述制备方法指，对光叶兔儿风的地上部分进行精油提取；

在具体的实施例中，所述制备方法包括：将光叶兔儿风的地上部分进行水煮、冷凝、萃取而得。

在更具体的实施例中，所述水煮指用水煮沸处理4-8h，优选6h，这样能把精油成分尽可能完全地从新鲜植株中煮出来。

优选地，所述萃取指用正己烷萃取；

更具体地，使用2l的分液漏斗，正己烷：蒸出物＝1:1，分层后保留已溶解精油的正己烷层。

优选地，所述萃取的水浴温度为38-45℃，优选40℃，正己烷在此温度下，能快速蒸发、冷凝回收。

优选地，萃取所得的混合物经干燥后蒸发去除正己烷；

优选地，所述干燥指采用无水硫酸钠干燥；

优选地，所述蒸发指采用旋转蒸发仪蒸发。

优选地，所述精油比重为0.093g/ml。

最具体的实施例操作步骤如下：

采集光叶兔儿风的地上部分，用水煮法处理6h，得到的油水混合物冷凝回收后用正己烷萃取，加无水硫酸钠干燥后，使用旋转蒸发仪除去正己烷，所得成分为光叶兔儿风精油。其中，水浴温度为40℃。

除了上述实施例提供的步骤可制备得到光叶兔儿风精油进而得到生物防治药剂外，还可采用本领域常用的其它精油提取方法来提取光叶兔儿风精油，例如，本领域技术人员熟知的：蒸馏法、香脂法、溶剂萃取法、挤压法、超临界萃取法、油脂分离法、亚临界萃取法等，这些方法对光叶兔儿风的地上部分进行精油提取也可获得光叶兔儿风精油进而得到生物防治药剂，操作步骤、采用的试剂、仪器设备均为本领域技术人员可根据实际需要进行常规选择和调整的，本文不再一一赘述。

第4组实施例、本发明防治西花蓟马的方法

本组实施例提供一种防治西花蓟马的方法。在本组所有的实施例中，所述方法都具备如下共同特征：采用光叶兔儿风对西花蓟马进行防治。

在具体的实施例中，所述防治指，用光叶兔儿风精油杀灭西花蓟马；

优选地，所述光叶兔儿风精油为光叶兔儿风地上部分提取的精油；

优选地，所述光叶兔儿风精油的杀虫活性成分包括：1,8-桉叶素、龙脑、α-萜烯醇、黄樟素、丁香酚、肉豆蔻醚、榄香素、细辛脑、诺卡酮；

优选地，所述光叶兔儿风精油包括下述重量百分比的杀虫活性成分：6.78％1,8-桉叶素、4.17％龙脑、3.45％α-萜烯醇、3.21％黄樟素、3.78％丁香酚、6.28％肉豆蔻醚、22.92％榄香素、1.55％细辛脑、1.21％诺卡酮；

优选地，所述杀灭方式为触杀，和/或，熏杀；

优选地，所述用光叶兔儿风精油杀灭西花蓟马指，将光叶兔儿风精油的丙酮溶液和西花蓟马置于统一密闭空间内；

优选地，所述光叶兔儿风精油的丙酮溶液中光叶兔儿风精油浓度为2-10μl/ml。

本领域技术人员可根据本发明的启示，采用上述实施例所述的方法中涉及的光叶兔儿风、光叶兔儿风精油、杀灭方式、具体的杀灭操作以及精油浓度用来防治除西花蓟马以外的其它害虫，包括但不限于：蚊子、苍蝇、跳蚤、蟑螂、蚜虫、蝗虫、蚧壳虫、虱、蛾等。

实验例1、光叶兔儿风地上部分精油成分鉴定

采用gc-ms检测方法对光叶兔儿风精油成分进行鉴定：

检测仪器：气相色谱仪(agilent6890n)和质谱检测仪(agilent5973n)。

检测条件：hp-5ms30mm×0.25mm×0.25μm石英毛细管柱，初始柱温60℃，保持1min，以12℃/min的速率，程序升温至180℃保持0.5min，再以25℃/min的速率程序升温至280℃保持18min，汽化器温度280℃，载气为氦气，柱流量1.0ml/min，分流比1:10。

质谱电离方式ei，电子轰击能量70ev，扫描质量范围20-550m/z，扫描时间2s。

取光叶兔儿风植物精油1μl(100倍丙酮稀释液)进样，经气相色谱-质谱联用仪分析鉴定，通过hp-msd化学工作站检索nist05标准质谱图库，并结合有关文献，检测并鉴定到33个峰。

成分鉴定结果如下表1所示：

表1

上表1中鉴定出来的全部成分的总百分比未到100％，是因为光叶兔儿风精油中仍存在某些未知成分，无法利用现有的gc-ms检测方法鉴定出来，不一定是新的化合物。

实验例2、本发明生物防治药剂的杀虫效果

西花蓟马-熏蒸：ld50＝387.996μg/ml；(3.501,4.800)

根据分析得到的lc50＝4.172μl/ml，由电子天平得油比重为0.093g，ld50＝lc50×油比重×1000即，ld50＝4.172×0.093×1000＝387.996μg/ml。

采用熏蒸法对西花蓟马进行本发明光叶兔儿风精油的杀灭效果验证，具体操作如下：取新鲜未施用农药的扁豆角，将豆角剪成小段，用作保湿；用丙酮作为精油溶剂，制成5个浓度的2.5μl的溶液。将10头大龄西花蓟马若虫放于10ml的透明小瓶中，放入剪好的豆角，用200目的纱布封口。将宽1.5cm长10cm的滤纸条粘于250ml广口瓶的瓶盖上，将放着西花蓟马的小瓶放于广口瓶中，用移液枪将配好的溶液滴于滤纸条上，用封口膜封口。24h后在体视镜下观察结果，以毛笔拨动虫体，虫体不动记为死亡。

死亡率(％)＝死亡数/试虫数*100

校正死亡率(％)＝(处理组死亡率-对照组死亡率)/(1-对照组死亡率)*100

半致死浓度(lc50)：指能引起50％供试个体死亡的所需浓度。利用spss软件计算而得。

结果如下表所示：

lc50＝4.172μl/ml，ld50＝387.996μg/ml，95％的置信区间为(3.501,4.800)，y＝-1.886+3.039x。

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