一种用于核酸扩增的微流控芯片的制作方法

本实用新型属于生物检测技术领域，涉及一种用于核酸扩增的微流控芯片。

背景技术：

在实验室环境下进行核酸扩增，或多或少都存在核酸污染干扰检测的问题，气溶胶在空气中很容易扩散，进而造成后续样本检测出现假阳性结果。微流控芯片以其内部环境的封闭性，使得环境中的核酸很难进入到芯片内污染，同时芯片内部腔室的独立分布也有效地隔断了内部污染的情况，可以将核酸污染的程度降低到了最低。

将微流控芯片技术与巢式pcr技术结合起来，开发可用于生物样本快速定量检测的微流控芯片，为生物样本中核酸分子的快速定量检测提供一种简单、快速、有效的解决方案，对于疾病的治疗和预后具有重要意义。

技术实现要素：

本实用新型的目的是提供一种用于核酸扩增的微流控芯片，提高了核酸分析检测的准确性。

本实用新型提供一种用于核酸扩增的微流控芯片，包括：

多个巢式扩增区，其用于对核酸分子进行巢式扩增；及

定量分配装置，其用于将含有核酸分子的微流体定量划分并分配给各所述巢式扩增区；

所述定量分配装置设置于用于向所述巢式扩增区提供所述微流体的微通道中。

优选地，所述定量分配装置包括多个定量分配单元，每个定量分配单元对应一个所述巢式扩增区。

更优选地，第一个定量分配单元包括活动设置的第一定量盘，所述第一定量盘具有内腔及分别与所述内腔连通的进液口和出液口，所述微通道包括用于进样的第一微通道、设置于所述第一个定量分配单元和第二个定量分配单元之间的第二微通道，所述第一定量盘具有第一位置和第二位置，当所述第一定量盘在第一位置时，所述第一定量盘的所述进液口和所述第一微通道连通，所述出液口和所述第二微通道连通；当所述第一定量盘在第二位置时，所述第一定量盘的所述进液口脱离所述第一微通道，所述出液口和第一个巢式扩增区连通。

更优选地，第n个定量分配单元包括活动设置的第n定量盘，n为大于1且小于n的正整数，n＝所述定量分配单元的总数＝所述巢式扩增区的总数，所述第n定量盘具有内腔、及分别与所述内腔连通的进液口和出液口，所述微通道还包括设置于第n个定量分配单元和第n-1个定量分配单元之间的第n微通道及设置于第n个定量分配单元和第n+1个定量分配单元之间的第n+1微通道，第n定量盘具有第一位置和第二位置，当第n定量盘在第一位置时，第n定量盘的所述进液口和所述第n微通道连通，所述出液口和所述第n+1微通道连通；当第n定量盘在第二位置时，第n定量盘的所述进液口脱离所述第n微通道，所述出液口和第n个巢式扩增区连通。

更优选地，第n个定量分配单元包括活动设置的第n定量盘，所述第n定量盘具有内腔、及分别与所述内腔连通的进液口和出液口；所述定量分配装置还包括指示区，所述第n个定量分配单元和所述指示区之间设置有指示区微通道；所述第n定量盘具有第一位置和第二位置，当所述第n定量盘在第一位置时，所述第n定量盘的所述进液口和第n微通道连通，所述出液口和所述指示区微通道连通；当所述第n定量盘在第二位置时，所述第n定量盘的所述进液口脱离所述第n微通道，所述出液口和第n个巢式扩增区连通。

更优选地，所述微流控芯片包括通道层，定量盘能够转动地设置于所述通道层中；和/或，所述定量盘具有多次折弯形成的盘管，所述内腔由所述盘管的管腔形成；和/或，每个所述定量分配单元包括气压阀，当定量盘在第二位置时，所述进液口和相应的所述气压阀连通；和/或，各定量盘同步处于第一位置或同步处于第二位置。

优选地，所述巢式扩增区中存储有引物，不同的所述巢式扩增区中的所述引物相同或不同；所述巢式扩增区中存储有扩增试剂，或所述微流控芯片还包括和所述巢式扩增区连通的用于向所述巢式扩增区中加入扩增试剂的补液孔。

优选地，各所述巢式扩增区分别与一通气孔连通。

优选地，所述微流控芯片还包括用于对核酸分子进行第一轮扩增的第一轮扩增区，所述第一轮扩增区通过所述微通道向所述定量分配装置提供第一轮扩增后的核酸分子。

更优选地，所述微流控芯片还包括能够和所述第一轮扩增区连通的试剂缓冲区，所述微通道和所述试剂缓冲区连通。

更优选地，所述第一轮扩增区中存储有第一轮核酸扩增所需的扩增试剂。

更优选地，所述微流控芯片还包括用于向所述第一轮扩增区中加入样本的加样孔，所述加样孔和所述第一轮扩增区之间设置有加样通道。

进一步地，所述微流控芯片还包括设置于所述加样通道中的气压阀。

优选地，所述微流控芯片包括通道层及固定于所述通道层上方的盖板层，所述巢式扩增区为设于所述通道层中的腔室。

更优选地，所所述盖板层中设置有能够上下移动的气压阀。

更优选地，所述通道层及所述盖板层的厚度分别为1～20mm。

本实用新型采用以上方案，相比现有技术具有如下优点：

本实用新型的微流控芯片能够用于核酸扩增，特别是巢式pcr扩增，不仅有效降低了核酸污染程度，同时结合巢式pcr的特异性扩增，极大地提高了核酸分析检测的准确性，试剂消耗量低、分析速度快，还可以满足多指标检测的需求，特别适合于生物样本中核酸分子的快速定量检测。

附图说明

为了更清楚地说明本实用新型的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本实用新型的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是根据本实用新型实施例的一种微流控芯片的正面示意图；

图2是根据本实用新型实施例的一种定量盘的结构示意图；

图3是根据本实用新型实施例的定量划分溶液的示意图；

图4是根据本实用新型实施例的巢式扩增区进样示意图。

其中，

101、通道层；102、盖板层；103、定位孔；

3、第一轮扩增区；31、加样通道；32、第一补液孔；33、气压阀i；

4、试剂缓冲区；

5、巢式扩增区；51、通气孔；

6、定量分配装置；60、定量分配单元；61、定量盘；611、盘管；61a、第一定量盘；61b、第二定量盘；62a、第一微通道；62b、第二微通道；62c、第三微通道；63、指示区；64、指示区微通道；65a、气压阀ii；65b、气压阀iii；65c、气压阀iv；65d、气压阀v；65e、气压阀vi；65f、气压阀vii；65g、气压阀xiii。

具体实施方式

下面结合附图对本实用新型的较佳实施例进行详细阐述，以使本实用新型的优点和特征能更易于被本领域的技术人员理解。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本实用新型，但并不构成对本实用新型的限定。

如本说明书和权利要求书中所示，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其他的步骤或元素。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的组合。

需要说明的是，如无特殊说明，当某一特征被称为“固定”、“连接”在另一个特征，它可以直接固定、连接在另一个特征上，也可以间接地固定、连接在另一个特征上。此外，本实用新型中所使用的上、下、左、右等描述仅仅是相对于附图中本实用新型各组成部分的相互位置关系来说的。

进一步可以理解的是，本公开中“多个”是指两个或两个以上，其它量词与之类似。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。

本实施例提供一种用于核酸扩增的微流控芯片。参照图1所示，该微流控芯片主要包括用于对核酸分子进行第一轮扩增的第一轮扩增区3及用于对第一轮扩增后的核酸分子进行巢式扩增的巢式扩增区5，巢式扩增区5能够和第一轮扩增区3连通。其中，巢式扩增区5的数量为多个，各巢式扩增区5均能够通过微通道和第一轮扩增区3连通。该微流控芯片进一步包括定量分配装置6，用于将第一轮扩增区3中的微流体定量划分并分配给各巢式扩增区5，可以均匀划分，也可以非均匀划分。本实施例中为均匀划分。

第一轮扩增区3中存储有第一轮核酸扩增所需的扩增试剂，扩增试剂可以液体形式预存于第一轮扩增区3内。扩增试剂包括存核酸扩增所需要的各种引物、dntp、生物酶等试剂，可以对核酸分子进行特异性扩增，满足生物样本的检测需要。

该微流控芯片还包括用于向第一轮扩增区3中加入含有核酸分子的生物样本的加样孔32，加样孔32和第一轮扩增区3之间设置有加样通道31。加样通道31中设置有气压阀i33。

该微流控芯片还包括设置于第一轮扩增区3和巢式扩增区5之间的试剂缓冲区4。试剂缓冲区4，用于消除第一轮pcr扩增产物中气泡的功能性区域；也可以作为第一轮pcr扩增产物和巢式pcr扩增试剂混合的功能性区域。

各巢式扩增区5中分别存储有引物，不同的巢式扩增区5中的引物相同或不同，这是由于第二对引物具有较高的特异性，必须在对应腔室单独储存；引物可以以冻干粉形式预存于巢式扩增区5，遇溶液后即可熔化。本实施例中，各巢式扩增区5中的引物互不相同，从而实现多指标检测。巢式扩增区5中还存储有用于第二轮核酸扩增的扩增试剂，或微流控芯片还包括用于向巢式扩增区5中加入扩增试剂的补液孔。在巢式扩增区5中可以对第一轮pcr产物内的一段dna片段进行扩增，从而提高反应的特异性。巢式扩增区5可以选择是否储存核酸扩增所需要的第二对引物、dntp、各种生物酶等巢式pcr扩增试剂，如果只储存第二对引物，而未储存其它巢式pcr扩增试剂，则可以由第二补液孔42处加入所需试剂。巢式扩增区5，同时也兼顾作为核酸扩增产物的检测区域存在。各巢式扩增区5分别与一通气孔51连通，通气孔51为微流控芯片上与外界大气相通的位置，用于保证定量分配装置6分配的微流体在流入巢式扩增区5时的芯片内外气压平衡。

结合图2至图4所示，定量分配装置6设置于用于向巢式扩增区5提供微流体的微通道中。定量分配装置6包括多个定量分配单元60，每个定量分配单元60对应一个巢式扩增区5。每个定量分配单元60分别包括一个定量盘61，定量盘61具有内腔及分别与内腔连通的进液口和出液口。定量盘61能够移动或转动，从而具有第一位置和第二位置，在第一位置时，进液口直接或间接和试剂缓冲区4连通，出液口连通下一定量盘61的进液口或指示区63，以使来自第一轮扩增区3或试剂缓冲区4的微流体流入内腔中；当各定量盘61的内腔中分配有微流体后，定量盘61移动一段距离或转动一定角度，从而切换到第二位置；在第二位置时，进液口被封闭或与一气压阀(气压阀ii65a、气压阀iii65b、气压阀iv65c、气压阀v65d、气压阀vi65e、气压阀vii65f)连通，出液口连通对应的巢式扩增区5，将内腔中的微流体注入该巢式扩增区5中。上述的指示区63作为识别定量划分溶液过程的区域，用于终止划分溶液的操作。下面对定量分配单元60进行举例说明。

将与试剂缓冲区4直接连通的定量分配单元60记为第一个定量分配单元。第一个定量分配单元包括活动设置的第一定量盘61a，第一定量盘61a具有内腔、及分别与内腔连通的进液口和出液口。第一轮扩增区3和第一个定量分配单元60之间设置有第一微通道62a，第一个定量分配单元和第二个定量分配单元之间设置有第二微通道62b。第一定量盘61a具有第一位置和第二位置，当第一定量盘61a在第一位置时，第一定量盘61a的进液口和第一微通道62a连通，出液口和第二微通道62b连通(如图3所示)；当第一定量盘61a在第二位置时，第一定量盘61a的进液口脱离第一微通道62a，出液口和第一个巢式扩增区5连通(如图4所示)。

将距试剂缓冲区4最远的定量分配单元60记为第n个定量分配单元。第n个定量分配单元包括活动设置的第n定量盘，第n定量盘具有内腔、及分别与内腔连通的进液口和出液口。该定量分配装置6还包括上述的指示区63，第n个定量分配单元和指示区63之间设置有指示区微通道64。第n定量盘具有第一位置和第二位置，当第n定量盘在第一位置时，第n定量盘的进液口和第n微通道连通，出液口和指示区微通道连通；当第n定量盘在第二位置时，第n定量盘的进液口脱离第n微通道，出液口和第n个巢式扩增区连通。

将第一个定量分配单元和第n个定量分配单元之间的任一定量分配单元记为第n个定量分配单元，n为大于1且小于n的正整数，n＝定量分配单元60的总数＝巢式扩增区5的总数。第n个定量分配单元包括活动设置的第n定量盘，第n定量盘具有内腔、及分别与内腔连通的进液口和出液口。第n个定量分配单元和第n-1个定量分配单元之间设置有第n微通道，第n个定量分配单元和第n+1个定量分配单元之间设置有第n+1微通道。第n定量盘具有第一位置和第二位置，当第n定量盘在第一位置时，第n定量盘的进液口和第n微通道连通，出液口和第n+1微通道连通；当第n定量盘在第二位置时，第n定量盘的进液口脱离第n微通道，出液口和第n个巢式扩增区5连通。

具体到本实施例中，巢式扩增区5、定量分配单元60的数量均为六个且自左至右按照第一个至第六个的顺序依次排列。n＝6，上述的第n个定量分配单元即为第六个定量分配单元。当n取值为2时，第n个定量分配单元60即为第二个定量分配单元。第二个定量分配单元包括活动设置的第二定量盘61b，第二定量盘61b具有内腔、及分别与内腔连通的进液口和出液口，第二个定量分配单元和第三个定量分配单元之间设置有第三微通道62c，第二定量盘61b具有第一位置和第二位置，当第二定量盘61b在第一位置时，第二定量盘61b的进液口和第二微通道62b连通，出液口和第三微通道62c连通；当第二定量盘61b在第二位置时，第二定量盘61b的进液口脱离第二微通道62b，出液口和第二个巢式扩增区5连通。n取值为3、4、5的情况依次类推，即第三个、第四个、第五个定量分配单元的结构与第二个定量分配单元类似。还需要说明的是，相邻两个定量盘61之间的微通道(上述第二微通道至第六微通道)为s形。

本实施例进一步提供一种定量盘的具体结构。如图2所示，定量盘61具有由多次折弯形成的盘管611，内腔由盘管611的管腔形成。各定量盘61同步处于第一位置(如图3所示)，或同步处于第二位置。每个定量分配单元60包括气压阀(气压阀ii65a、气压阀iii65b、气压阀iv65c、气压阀v65d、气压阀vi65e、气压阀vii65f)，当定量盘61在第二位置时，进液口和相应的气压阀连通，以将分配至相应定量盘61中的微流体注入相应的巢式扩增区5中。上述的定量分配装置6还包括用于调节指示区63内压力的气压阀viii65g，以用于使试剂缓冲区4内的微流体进入依次流入各定量盘61中。

微流控芯片包括通道层及固定于通道层上方的盖板层102，通道层及盖板层102的厚度分别为1～20mm。上述的第一轮扩增区3、试剂缓冲区4和巢式扩增区5分别为设于通道层中的腔室。用于连通不同腔室的上述微通道(包括第一微通道至第n微通道、加样通道等)开设于通道层中。上述的定量盘61可绕其中心轴线旋转地设置于通道层中，每个定量盘61连接有一个定量盘驱动件，定量盘驱动件可转动地设置于盖板层102中。上述的各气压阀(气压阀i～viii)可上下移动地设置于盖板层102中；上述的加液活塞14、开关活塞15可上下移动地设置于盖板层102。盖板层102一方面与通道层键合后，建立封闭的腔室；另一方面为气压阀、加液活塞14、开关活塞15提供活动的行程，实现流体定量驱动和控制功能。

通道层和盖板层102上分别设置有相互配合的定位孔103，用于通道层和盖板层102的键合定位。定位孔103分别位于微流控芯片的四个角上。

上述的通道层和盖板层102材料可以是ps、pmma、pdma、pc等高聚物，也可以是玻璃、金属等材料。

本实施例中，流体驱动方式主要为气压式驱动，即通过气压差将微流控芯片上的微流体驱动到特定位置，具体采用加液活塞或气压阀，气压阀具体采用柱状活塞，位于微通道的中间或一端，使用方式有下压操作也有上提操作，主要作用是通过气压差驱动流体进行定量转移，有时候也兼顾阀门的作用。可以将活塞的初始位置校正在一定位置后定量驱动溶液，也可以通过外接精密注射泵定量驱动溶液。

本实施例还提供一种用于核酸检测的方法，其采用上述的微流控芯片进行检测，具体过程描述如下。

步骤一、将样本通过加样孔32加入到微流控芯片上，通过变换核酸第一轮扩增区3的温度进行第一轮pcr扩增。

步骤二、待第一轮pcr扩增完成后，驱动第一轮扩增区3的微流体至六个定量盘61上，定量划分核酸第一轮扩增区3的溶液。操作方式有两种：一种方式是去掉气压阀ⅷ，将气压阀ⅷ的位置变成通气孔，接着将气压阀ⅰ下压到底，则第一轮扩增区3的微流体依次流过各定量盘61，实现定量划分溶液的功能；另外一种方式是按照一定速度将气压阀ⅰ下压到底，同时以相同的速度将气压阀ⅷ上提，当指示区63出现溶液的同时停止定量划分溶液操作，保持微流控芯片内外间的气压平衡。

步骤三、完成定量划分溶液操作后，将定量盘61逆时针旋转一定角度，使各定量盘61分别接通相应的气压阀和巢式扩增区5之间的液路。将气压阀ii～vii下压到底，则定量盘61的盘管611中的溶液分别进入巢式扩增区5，与巢式扩增区5预先储存有核酸扩增所需要的第二对引物、dntp、生物酶等试剂混合并反应，通过变换巢式扩增区5的温度进行巢式pcr扩增。当巢式pcr扩增结束后，通过荧光检测技术读取巢式扩增区5的荧光信号完成检测过程。

应用实施例1

采用上述的用于核酸扩增的方法，分别在六个巢式扩增区5添加不同的引物，每个巢式扩增区5只添加1种引物，则可以以巢式pcr的方式实现生物样本中6种指标的检测需求。

应用实施例2

采用上述的用于核酸检测的方法，分别在六个巢式扩增区5添加不同的引物，每个巢式扩增区5都添加m(m＞1)种引物，且引物种类均不相同，引物可以用不同颜色的荧光基团进行标记，则可以实现6m种指标的检测需求，极大地提高了核酸分析检测的通量，缩短了多指标的检测时间。

应用实施例3

采用上述的用于核酸检测的方法，采用具有七个巢式扩增区5和七个定量分配单元60的微流控芯片，分别在七个巢式扩增区5添加不同的引物，每个巢式扩增区5都添加m(m＞1)种引物，且引物种类均不相同，引物可以用不同颜色的荧光基团进行标记，则可以实现7m种指标的检测需求。

上述的微流控芯片是一种用于巢式pcr扩增的微流控芯片，不仅有效降低了核酸污染程度，同时结合巢式pcr的特异性扩增，极大地提高了核酸分析检测的准确性，该方法试剂消耗量低、分析速度快，特别适合于生物样本中核酸分子的快速定量检测。

此外，该微流控芯片的结构可以根据检测指标量需求进行适当调整，例如需要检测生物样本中7n种指标，可以将定量盘61和核酸第二轮扩增区的数量扩大至7个。同比例的扩大或缩小定量盘61和核酸第二轮扩增区的数量(大于1)，可以满足任意指标量的检测需求。

上述实施例只为说明本实用新型的技术构思及特点，是一种优选的实施例，其目的在于熟悉此项技术的人士能够了解本实用新型的内容并据以实施，并不能以此限定本实用新型的保护范围。凡根据本实用新型的原理所作的等效变换或修饰，都应涵盖在本实用新型的保护范围之内。

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