嘧啶类衍生物、其制备方法和应用以及药物组合物与流程

本发明涉及化学医药技术领域，具体而言，涉及嘧啶类衍生物、其制备方法和应用以及药物组合物。

背景技术：

蛋白激酶是细胞生命活动的重要信使，可催化将atp末端的γ-磷酸基团转移至底物上，影响底物的结构和活性，传递各种胞内外信号，以对环境刺激作出适当反应。在大多数情况下，这一磷酸化反应发生在蛋白激酶的丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr),或酪氨酸(tyr)残基上。在人体中发现了至少538种蛋白激酶，而编码具有激酶活性蛋白的基因则超过900个，约占人类基因组的2.5％。蛋白激酶参与众多的生理调控过程，包括细胞存活、增殖、分化、凋亡、代谢等等。病理学及药理学研究表明，蛋白激酶的功能失调与很多疾病密切相关，包括肿瘤、自身免疫、炎性反应、中枢神经系统疾病、心血管疾病及糖尿病等。

激酶抑制剂的研究在激酶作用机制的阐明过程中扮演了重要角色，并成为重要的药物研究热点。近30年激酶作为一个非常有潜力的药物靶点受到了研究者的广泛研究。截止2020年4月，fda批准了59个激酶小分子抑制剂上市，再次激发了针对癌症和其他疾病治疗领域的靶向药物的兴起。

plk4是中心粒复制的主要调控因子，在中心体复制过程中起关键作用。此前的研究表明，干扰rna介导的plk4缺失会导致中心体复制受到阻滞，而过表达的plk4会通过产生过量的中心粒而引起中心体的扩增。在正常的处于分裂期的细胞中，plk4的表达水平较高，而在正常的非分裂期细胞中，该蛋白几乎不表达。由于肿瘤细胞是一类增殖/分裂处于失控状态的细胞，plk4在包括乳腺癌、骨髓瘤及结直肠癌在内的等多种恶性肿瘤中高表达。在肿瘤中的进一步研究显示，plk4的表达异常可以导致中心粒的数量变异，导致细胞分裂时染色体可能无法正常的分配到子细胞中，因此诱导基因组的不稳定性，而基因组的不稳定性是肿瘤最显著的恶性表型之一。因此，该分子对于肿瘤发生及发展的具有重要作用。此外研究提示在pten缺失的肿瘤细胞中，具有恶性表型的肿瘤细胞依赖于plk4才能存活。提示plk4与pten之间具有合成致死的作用。因此plk4可能是一个用于治疗肿瘤，特别是用于治疗pten缺陷型肿瘤的分子靶标。迄今为止针对plk4小分子抑制剂的报道较少，并且它们的骨架多样性不足。因此，寻找成药性更好的高选择性plk4小分子抑制剂并将其用于开发抗肿瘤研究以及作用机制研究亟待进行。

鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新的嘧啶类衍生物、其制备方法和应用以及药物组合物，该新的嘧啶类衍生物对于激酶有优异的抑制效果，特别地，对于plk4抑制效果显著，继而该新的嘧啶类衍生物能够抑制肿瘤生长。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供一种嘧啶类衍生物，其为|或|a所示的化合物、其互变异构体、水合物、溶剂化物或其药学上可接受的盐；

其中，r1和r1＇分别独立地选自取代或未取代烷基、h和取代或未取代环烷基中的任意一种；

r2和r2＇分别独立地选自h、取代或未取代烷基、取代或未取代环烷基、卤素、-nh2、-no2和-cn中的任意一种；

r3、r3＇、r4和r4＇分别独立地选自取代或未取代芳基、取代或未取代杂芳基、以及y-x中的任意一种；其中，r5和r5＇分别独立的选自取代或未取代芳基和取代或未取代杂芳基中的任意一种，y为-o-、-s-、nh-、-c＝o-、-s＝-o和-so2-中的任意一种，x为取代或未取代烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、羰基和酯基中的任意一种。

第二方面，本发明实施例还提供一种上述嘧啶类衍生物的制备方法，按照下述合成路径合成所述嘧啶类衍生物；

第三方面，本发明实施例还提供一种药物组合物，其包括上述嘧啶类衍生物或上述嘧啶类衍生物的制备方法制备得到的化合物；

优选地，所述药物组合物包括药学上可接受的辅料；

优选地，所述嘧啶类衍生物在所述药物组合物中存在的形式还可为其前药。

第四方面，本发明实施例还提供一种上述嘧啶类衍生物在制备治疗肿瘤的药物或在制备激酶抑制剂中的应用。

本发明具有以下有益效果：本发明实施例提供一种新的嘧啶类衍生物，该嘧啶类衍生物对于蛋白激酶有良好的抑制效果，特别是对plk4有显著的抑制效果，能够有效治疗癌症。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明实施例提供一种嘧啶类衍生物，其为下式所示的化合物、其互变异构体、水合物、溶剂化物或其药学上可接受的盐，具体嘧啶类衍生物的结构式如下所示：

其中，r1和r1＇分别独立地选自取代或未取代烷基、h和取代或未取代环烷基中的任意一种；

r2和r2＇分别独立地选自h、取代或未取代烷基、取代或未取代环烷基、卤素、-nh2、-no2和-cn中的任意一种；

r3、r3＇、r4和r4＇分别独立地选自取代或未取代芳基、取代或未取代杂芳基、以及y-x中的任意一种；其中，r5和r5＇分别独立的选自取代或未取代芳基和取代或未取代杂芳基中的任意一种，y为-o-、-s-、nh-、c＝o、s＝o和-so2-中的任意一种，x为取代或未取代烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、亚甲基芳基、亚甲基杂芳基、羰基和酯基中的任意一种。

较优选地，r1和r1＇分别独立地选自c1～c4取代烷基、c1～c4未取代烷基和c3～c5取代环烷基中的任意一种；例如可以为c1～c4取代烷基为三氟甲基，c1～c4未取代烷基为甲基，c3～c5取代环烷基为环丙基、环己基等。可以理解的是，其他乙基、丙基、异丙基以及取代乙基等c1～c4取代烷基、c1～c4未取代烷基和c3～c5取代环烷基都属于本发明实施例的保护范围。

优选地，r2和r2＇分别独立地选自c1～c8烷氧基、c1～c8烷氨基、为c1～c8烷基和c3～c8环烷基中的任意一种，例如，r2和r2＇分别独立地选自甲基、异丙基、-cf3或-ocf3。可以理解的是，甲氧基、乙氧基以及丙氧基等c1～c8烷氧基；甲氨基、乙氨基以及丙氨基等c1～c8烷氨基；环己基、环戊基以及环丙基等c3～c8环烷基；正己基、正戊基、异丙基以及正丙基等c1～c8烷基都属于本发明实施例的保护范围。

优选地，x为c1～c8羰基、c1～c8酯基和-ch2-r6中的任意一种，其中，r6独立的为取代或未取代的烷基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基中的任意一种；

r3和r3＇分别独立地选自以下基团中的任意一种；

其中，ar为取代或未取代芳基或取代或未取代杂芳基；

r7和r7＇分别独立地选自卤素、取代或未取代烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基和-cn中的任意一种；例如，r7和r7＇中取代烷基为三氟甲基、未取代烷基为异丙基。

最优地，r1和r1＇分别为甲基；r3和r3＇分别为

进一步地，嘧啶类衍生物选自以下化合物中的任意一种：

本发明实施例还提供一种上述嘧啶类衍生物的制备方法，具体合成路径如下：

；其中，反应条件：(a)溶剂、碳酸盐、含r4的化合物、45-95℃；(b)含r2的化合物、溶剂、胺类物质、75-85℃；(c)溶剂、碳酸盐、含r3的化合物、75-85℃；(d)溶剂、无机碱，含r3的硼酸酯以及相应的催化剂；

更优选地，反应条件：(a)dma，碳酸氢钾，45℃或者1,4-二氧六环:水＝4：1，[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯，碳酸钾，95℃以及含有r4的(杂)芳基、芳基硼酸或者乙烯基硼酸酯；(b)含有r2的氨基吡唑类中间体,三乙胺，甲苯，80℃；(c)dmf，碳酸钾，80℃以及含有r3的中间体；(d)1,4-二氧六环:水＝4：1，[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯，碳酸钾以及含有r3的(杂)芳基、芳基硼酸或者乙烯基硼酸酯，95℃。

具体地，合成步骤如下：

步骤一：

经过亲核取代反应制备，1a(1eq.)溶于dma中，加入r4的亲核试剂(1.2-1.5eq.)加入碳酸氢钾(2-3eq.)在45-60℃下反应24小时以上，反应完全后，经乙酸乙酯萃取后，有机相干燥后，经柱层析获得产品中间体1b(1b的结构式为：)。或者经过suzuki偶联反应制备，化合物1a和r4-芳基哪醇酯(1.2eq.)，碱(2.0eq.)，加入1,4-二氧六环:水(4:1-6:1)的混合溶剂中，加入催化剂(3-8mmol％)，n2保护下升温至90-100℃反应6-10h得产品1b。碱的例子包括但不限于碳酸钾、磷酸钾、碳酸钠、碳酸铯。催化剂的例子包括但不限于醋酸钯、[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物、三(二亚苄基茚丙酮)二钯。

步骤二：

1b(1eq.)溶于dmf中，加入碱(2.0eq.)以及相应的含r2基团的氨基吡唑类中间体，于80℃下反应8-12h得化合物1c(1c的结构式为：)。碱的例子包括但不限于三乙胺、dipea、碳酸钾、磷酸钾、碳酸钠和碳酸铯。

步骤三：

经过亲核取代反应制备，1c(1eq.)溶于dma中，加入r3的亲核试剂(1.2-1.5eq.)加入碳酸氢钾(2-3eq.)在80-℃下反应24小时以上，反应完全后，经乙酸乙酯萃取后，有机相干燥后，经柱层析获得产品产品1d。

或者经过suzuki偶联反应制备，化合物1c和r3芳基哪醇酯(1.2eq.)，碱(2.0eq.)，加入1,4-二氧六环:水(4:1-6:1)的混合溶剂中，加入催化剂(3-8mmol％)，n2保护下升温至90-100℃反应6-10h得产品1d(1d的结构式为：)。碱的例子包括但不限于碳酸钾、磷酸钾、碳酸钠、碳酸铯。催化剂的例子包括但不限于醋酸钯、[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物、三(二亚苄基茚丙酮)二钯。

优选地，r1和r1＇分别为甲基，且r3和r3＇分别为时，嘧啶类衍生物参照下述合成路径制备得到：

，其中，

优选地，反应条件为：(a)；溶剂、碱金属、碳酸胍；(b)含氯化合物、回流；(c)溶剂、碱金属盐、75-85℃；(d)溶剂、碳酸盐、炔类化合物、40-55℃；(e)溶剂、胺类物质、肟类化合物、75-85℃；(f)溶剂、碳酸盐、含有r2的化合物、75-85℃；(g)溶剂、含r4的化合物、85-95℃；(h)碳酸盐、溶剂、回流；

更优选地，反应条件：(a)碳酸胍，金属钠，ch3oh；(b)三氯氧磷，回流；(c)乙酸酐，乙酸钾，80℃；(d)dma，碳酸钾，碳酸氢钾，溴丙炔，45℃；(e)三乙胺，甲苯，n-羟基异丁基亚氨氯化肟，80℃；(f)dmf，碳酸氢钾，含有r2的氨基吡唑类中间体，80℃；(g)dmf，90℃,含有r4基团的胺、醇以及硫醇等中间体或者1,4-二氧六环:水＝4：1，[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯，碳酸钾以及含有r4的(杂)芳基、芳基硼酸或者乙烯基硼酸酯；(h)碳酸钾，甲醇，回流，过夜。

具体地，合成步骤如下：

步骤一：

甲醇在氮气保护下缓慢加入金属钠(2eq.)，反应液转至80℃，加入碳酸胍(1eq.)，搅拌0.5h。加入甲氧基马来酸二甲酯(1eq.)的甲醇溶液，回流加热2小时后转至室温下搅拌过夜，反应液过滤后，固体溶于水中，乙酸酸化至ph＝6，剩余的固体通过过滤收集，水洗，干燥后获得产品化合物2。

步骤二：

化合物2(1eq.)溶于适量三氯氧磷中,加入pcl5(0.5eq.)，回流16小时后，冷却，浓缩掉部分溶剂后,剩余物倒入至冰水中，nh4oh中和后，经ch2cl2萃取.有机相经无水硫酸镁干燥后，过滤，浓缩，硅胶柱层析获得化合物3。

步骤三：

化合物3溶于乙酸酐中，加入乙酸钾，80℃下反应5h后得化合物4。

步骤四：

化合物4(1eq.)和碳酸钾(1.2eq.)、碳酸氢钾(1.2eq.)溶于dmf中，升温至45℃，加入溴丙炔(1.2eq.)，反应15h得化合物5。

步骤五：

甲苯中加入化合物5(1eq.)以及n-羟基异丁基亚氨氯化肟(1.2eq.)，加入三乙胺(2.0eq.)，60℃下反应3-5h得化合物6。

步骤六：

化合物6溶于dmf中，加入碱(2.0eq.)以及相应的氨基吡唑类中间体，于80℃下反应8-12h得化合物7。

步骤七：

法1：芳香亲核取代反应制备，化合物7(1eq.)溶于dmf中，加入过量的脂肪环胺，在90℃下反应过夜得产品。

法2：suzuki偶联反应制备，化合物7和芳基哪醇酯(1.2eq.)，碱(2.0eq.)，加入1,4-二氧六环:水(4:1-6:1)的混合溶剂中，加入催化剂(3-8mmol％)，n2保护下升温至90-100℃反应6-10h得产品。碱的例子包括但不限于碳酸钾、磷酸钾、碳酸钠、碳酸铯。催化剂的例子包括但不限于醋酸钯、[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物、三(二亚苄基茚丙酮)二钯。

步骤八：

步骤g的产品溶于甲醇中加入碱(2.0eq.)，室温搅拌过夜得系列化合物。碱的例子包括但不限于碳酸钾、磷酸钾、碳酸钠、碳酸铯。

本发明实施例还提供一种药物组合物，其包括上述嘧啶类衍生物，其中，药物组合物包括药学上可接受的辅料，例如，赋形剂、稀释剂、媒介物以及崩解剂等。而嘧啶类衍生物在所述药物组合物中存在的形式除了上述直接添加化合物、添加其互变异构体、盐还可为其前药、水合物或溶剂化物。且该药物组合物的剂型为药学可接受的剂型，包括但不限于液体制剂，例如口服液体制剂或静脉注射剂，液体制剂中可含有注射用水、盐水溶液、葡萄糖水溶液、注射/输注用盐水、注射/输注用葡萄糖、格林氏溶液或含有乳酸盐的格林氏溶液等。该药物组合物也可以为固体制剂，例如颗粒剂、片剂、冻干粉以及粉末等。

本发明实施例还提供一种上述嘧啶类衍生物应用，该应用包括制备激酶抑制剂或制备治疗肿瘤的药物。其中，激酶抑制剂为plk4激酶抑制剂；肿瘤包括乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、脑癌、肝癌、颈癌、甲状腺癌、黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、中枢神经系统癌症、恶性胶质瘤、骨髓增生病和血液瘤中的任意一种。上述应用进一步提升了该新的嘧啶类衍生物的商业价值。

术语“水合物”表示进一步通过非共价分子间作用力结合化学计量或非化学计量的水的化合物。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种嘧啶类衍生物，即n4-(5-环丙基-1h-吡唑-3-基)-5-甲氧基-6-(4-甲基哌嗪-1-基)-n2-{[3-(丙基-2-基)-1,2-异恶唑-5-基]甲基}嘧啶-2,4-二胺(编号为8a)，其结构式如下所示：

本实施例还提供一种上述8a的制备方法，合成步骤如下：

第一步，中间体2的合成

甲醇(80ml)在氮气保护下缓慢加入金属钠(2.8g,120mmol)，反应液转至80℃，加入碳酸胍(5.6g,31mmol)，搅拌0.5h。加入甲氧基马来酸二甲酯(10g,62mmol)的甲醇溶液(20ml)，回流加热2小时后转至室温下搅拌过夜，反应液过滤后，固体溶于水中，乙酸酸化至ph＝6，剩余的固体通过过滤收集，水洗，干燥后获得产品(6.8g，70％)。msm/z(esi)：157.1[m+h]⁺。

第二步，中间体3的合成

化合物2(4.7g，1eq.)溶于(45ml)三氯氧磷中,加入pcl5(3.2g，0.5eq.)，回流16小时后，冷却，浓缩掉部分溶剂后,剩余物倒入至冰水中，nh4oh中和后，经ch2cl2萃取，有机相经无水硫酸镁干燥后，过滤，浓缩，硅胶柱层析获得化合物3(4.5g，79％)。msm/z(esi)：193.0[m+h]⁺。

第三步，中间体4的合成

化合物3(4g，1eq.)溶于乙酸酐(80ml)中，加入乙酸钾(3.9g，2eq.)，80℃下反应5h后，浓缩溶剂，残余物通过硅胶柱层析纯化，得化合物3.2g(67％)。msm/z(esi)：235.1[m+h]⁺。

第四步，中间体5的合成

化合物4(2.4g，1eq.)和碳酸钾(1.7g，1.2eq.)、碳酸氢钾(1.2g，1.2eq.)溶于dmf中，升温至45℃，加入溴丙炔(1.44g，1.2eq.)，反应15h，将反应液倒入水中，经ch2cl2萃取，有机相经无水硫酸镁干燥后，过滤，浓缩，硅胶柱层析获得化合物5(2.6g，93％)。msm/z(esi)：273.0[m+h]⁺。

第五步，中间体6的合成

取甲苯30ml，加入化合物5(2.2g，1eq.)以及n-羟基异丁基亚氨氯化肟(1.2g，1.2eq.)，加入三乙胺(2.3ml，2.0eq.)，60℃下反应3-5h，浓缩溶剂后，残余物经硅胶柱层析纯化，得化合物6(1.8g，64％)。msm/z(esi)：358.1[m+h]⁺。

第六步，中间体7a的合成

化合物6(0.72g，1eq.)溶于dmf中，加入碳酸氢钾(0.3g，2.0eq.)以及5-环丙基-1h-吡唑-3-胺(0.44g，1.2eq.)，于80℃下反应10h后，将反应液倒入水中，经乙酸乙酯萃取，有机相经无水硫酸镁干燥后，过滤，浓缩，硅胶柱层析获得化合物7a(0.75g，84％)。得化合物7a。msm/z(esi)：445.2[m+h]⁺。其中，中间体7a的结构式如下：

第七步：终产品8a的合成

化合物7a(111.3mg，1eq.)溶于dmf中，加入碳酸氢钾(50mg，2.0eq.)以及1-甲基哌嗪(0.14ml，5eq.)，于80℃下反应8h后，将反应液倒入水中，经乙酸乙酯萃取，有机相经无水硫酸镁干燥后，过滤，浓缩，剩余物无需纯化直接用于下一步反应。

将剩余物溶于甲醇中，加入70mg碳酸钾，于室温下搅拌过夜，反应完成后，直接拌样，硅胶柱层析纯化获得8a(25.8mg，收率21.0％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.46(s,1h),6.05(s,1h),5.90(s,1h),5.25(t,j＝6.3hz,1h),4.60(d,j＝5.9hz,2h),3.65(t,j＝4.8hz,4h),3.58(s,3),3.01(p,j＝7.0hz,1h),2.46(t,j＝4.9hz,4h),2.31(s,3h),1.85(m,j＝8.7,5.0,4.3hz,1h),1.24(s,6h),0.94-0.86(m,2h),0.71(m,j＝6.9,3.3hz,2h).hrms(esi-tof)m/zcalcdforc23h33n9o2[m+h]⁺:468.22830,found:468.2837。

实施例2

本实施例提供嘧啶类衍生物，即n4-(5-环丙基-1h-吡唑-3-基)-5-甲氧基-6-(4-吗啉-1-基)-n2-{[3-(丙基-2-基)-1,2-异恶唑-5-基]甲基}嘧啶-2,4-二胺(编号为8b)，其结构式如下所示：

8b的合成步骤与实施例1提供的8a的合成步骤相同，区别仅在于：利用7a合成8b时，原料不同，1-甲基哌嗪替换为1-甲基吗啉，其他条件以及中间体的合成与实施例1相同。

利用7a合成8b的收率为28.4％，¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.47(s,1h),6.04(s,1h),5.93(s,1h),5.30(s,1h),4.60(d,j＝6.0hz,2h),3.75(t,j＝4.7hz,4h),3.61(d,j＝4.8hz,4h),3.59(s,3h),3.02(p,j＝7.0hz,1h),1.86(m,j＝8.7,5.0hz,1h),1.26(m,6h),(d,j＝6.7hz,6h),0.94-0.87(m,2),0.74-0.69(m,2h).hrms(esi-tof)m/zcalcdforc22h30n8o3[m+h]⁺:455.2514,found:455.2516。

实施例3

本实施例提供嘧啶类衍生物，即n4-(5-环丙基-1h-吡唑-3-基)-5-甲氧基-6-((2r,6s)-2,6-二甲基吗啉-4-基)-n2-{[3-(丙基-2-基)-1,2-异恶唑-5-基]甲基}嘧啶-2,4-二胺(编号为8c)，其结构式如下所示：

8c的合成步骤与实施例1提供的8a的合成步骤相同，区别仅在于：利用7a合成8c时，原料不同，1-甲基哌嗪替换为顺式-2,6-二甲基吗啉，其他条件以及中间体的合成与实施例1相同。

利用7a合成8c的收率为31.7％，¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.42(s,1h),6.04(s,1h),5.88(s,1h),5.36(s,1h),4.60(d,j＝6.0hz,2),4.04(m,2h),3.70(m,2h),3.58(s,3h),3.35(m,2h),3.10–2.95(m,2h),1.86(m,1h),1.21(d,6h),0.90(m,2h),0.71(d,2h).hrms(esi-tof)m/zcalcdforc24h34n8o3[m+h]⁺:483.2837,found:483.2831。

实施例4

本实施例提供嘧啶类衍生物，即n4-(5-环丙基-1h-吡唑-3-基)-5-甲氧基-6-((2r,6r)-2,6-二甲基吗啉-4-基)-n2-{[3-(丙基-2-基)-1,2-异恶唑-5-基]甲基}嘧啶-2,4-二胺(编号8d)，其结构式如下所示：

8d的合成步骤与实施例1提供的8a的合成步骤相同，区别仅在于：利用7a合成8d时，原料不同，1-甲基哌嗪替换为反式-2,6-二甲基吗啉，其他条件以及中间体的合成与实施例1相同。

利用7a合成8d的收率为22.1％。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.34(s,1h),6.05(s,1h),5.83(s,1h),5.37(d,j＝22.1hz,1h),4.60(d,j＝5.9hz,2h),4.21(d,j＝13.0hz,2h),3.65(m,2h),3.56(s,3h),3.02(p,j＝6.9hz,1h),2.56(m,2h),1.25(d,6h),1.20(d,j＝6.2hz,6h),0.97–0.82(m,2h),0.76–0.57(m,2h).hrms(esi-tof)m/zcalcdforc24h34n8o3[m+h]⁺:483.2837,found:483.2835。

实施例5

本实施例提供嘧啶类衍生物，即n4-(5-环丙基-1h-吡唑-3-基)-5-甲氧基-6-[(1s,4s)-2-氧杂-5-氮杂桥环[2.2.1]庚烷-5-基]-n2-{[3-(丙基-2-基)-1,2-恶唑-5-基]甲基}嘧啶-2,4-二胺(编号8e)，其结构式如下所示：

8e的合成步骤与实施例1提供的8a的合成步骤相同，区别仅在于：利用7a合成8e时，原料不同，1-甲基哌嗪替换为(1r,4r)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷，其他条件以及中间体的合成与实施例1相同。

利用7a合成8e的收率为19.6％，¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.34(s,1h),6.05(s,1h),5.82(s,1h),5.32(s,1h),4.61(s,2h),3.85(d,j＝7.5hz,1h),3.79(d,j＝7.5hz,1h),3.59–3.55(m,2h),3.54(s,3h),3.06–2.98(m,1h),1.87(q,j＝9.7hz,1h),1.69–1.55(m,1h),1.39(d,1h),1.24(d,6h),0.94-0.87(m,2h),0.75-0.70(m,2h)..hrms(esi-tof)m/zcalcdforc23h30n8o3[m+h]⁺:467.2514,found:467.2518。

实施例6

本实施例提供嘧啶类衍生物，即n4-(5-环丙基-1h-吡唑-3-基)-5-甲氧基-6-{2-氧杂-6-氮杂螺环[3.3]庚烷-6-基-n2-{[3-(丙基-2-基)-1,2-恶唑-5-基]甲基}嘧啶-2,4-二胺(编号8f)，其结构式如下所示：

8f的合成步骤与实施例1提供的8a的合成步骤相同，区别仅在于：利用7a合成8f时，原料不同，1-甲基哌嗪替换为2-氧杂-6-氮杂-螺[3,3]庚烷，其他条件以及中间体的合成与实施例1相同。

利用7a合成8f的收率为28.4％，¹hnmr(400mhz,chloroform-d)δ7.37(s,1h),6.05(s,1h),5.90(s,1h),5.39(s,1h),4.82(s,4h),4.61(d,j＝5.7hz,2h),4.25(s,4h),3.56(s,3h),3.01(p,j＝6.9hz,1h),1.84(m,1h),1.24(s,6h),0.94-0.87(m,2h),0.74-0.64(m,2h).hrms(esi-tof)m/zcalcdforc23h30n8o3[m+h]⁺:467.2514,found:467.2516。

实施例7

本实施例提供嘧啶类衍生物，即n4-(5-环丙基-1h-吡唑-3-基)-5-甲氧基-6-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]-n2-{[3-(丙基-2-基)-1,2-恶唑-5-基]甲基}嘧啶-2,4-二胺(编号8g)，其结构式如下所示：

8g的合成步骤与实施例1提供的8a的合成步骤相同，区别仅在于：

第七步，终产品8g的合成

化合物7a(111.3mg，1eq.)和4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯硼酸频哪醇酯(90mg，1.2eq.)，碳酸钾(70mg，2.0eq.)，[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(20mg)加入至1,4-二氧六环:水(4:1-6:1)的混合溶剂中，n2保护下升温至100℃反应6h后，浓缩溶剂，经乙酸乙酯萃取，有机相经无水硫酸镁干燥后，过滤，浓缩，剩余物无需纯化直接用于下一步反应。将剩余物溶于甲醇中，加入70mg碳酸钾，于室温下搅拌过夜，反应完成后，直接拌样，硅胶柱层析纯化获得8g(24.5mg，此步骤收率20.7％)。

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.00(d,j＝8.5hz,2h),7.81(s,1h),6.95(d,j＝8.6hz,2h),6.11(d,j＝10.9hz,2h),5.48(s,1h),4.73(d,j＝6.1hz,2h),3.50(s,3h),3.33(t,j＝5.0hz,4h),3.02(p,j＝6.9hz,1h),2.60(t,j＝5.1hz,4h),2.37(s,3h),1.87(m,j＝9.0,5.2hz,1h),1.26(d,j＝1.9hz,6h),0.98–0.91(m,2h),0.74(d,j＝5.3hz,2h).hrms(esi-tof)m/zcalcdforc29h37n9o2[m+h]⁺:544.3143,found:544.3147.

实施例8

本实施例提供嘧啶类衍生物，即n4-(5-甲基-1h-吡唑-3-基)-5-甲氧基-6-(4-甲基哌嗪-1-基)-n2-{[3-(丙基-2-基)-1,2-异恶唑-5-基]甲基}嘧啶-2,4-二胺(编号8h)，其结构式如下所示：

8h的合成步骤与实施例1提供的8a的合成步骤相同，区别仅在于：

第六步，中间体7b的合成；

化合物6(0.72g，1eq.)溶于dmf中，加入碳酸氢钾(0.3g，2.0eq.)以及5-甲基-1h-吡唑-3-胺(0.35g，1.2eq.)，于80℃下反应8h后，将反应液倒入水中，经乙酸乙酯萃取，有机相经无水硫酸镁干燥后，过滤，浓缩，硅胶柱层析获得化合物7b(0.53g，66％)。msm/z(esi)：419.2[m+h]⁺。

第七步：终产品8h的合成与实施例1提供的第七步：终产品8a的合成操作一致，区别在于，将中间体7a替换为7b。

7b合成8h的收率为33.6％，¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.47(s,1h),6.04(s,1h),5.93(s,1h),5.30(s,1h),4.60(d,j＝6.0hz,2h),3.75(t,j＝4.8hz,4h),3.61(d,j＝4.8hz,4h),3.59(s,3h),3.02(p,j＝7.0hz,1h),2.36(s,3h),2.27(s,3h),1.26(m,6h).hrms(esi-tof)m/zcalcdforc21h31n9o2[m+h]⁺:442.2637,found:442.2632。

实施例9

本实施例提供嘧啶类衍生物，即n4-(5-甲基-1h-吡唑-3-基)-5-甲氧基-6-(4-吗啉-1-基)-n2-{[3-(丙基-2-基)-1,2-异恶唑-5-基]甲基}嘧啶-2,4-二胺(编号8i)，其结构式如下所示：

8i的合成步骤与实施例8提供的8h的合成步骤相同，区别仅在于：利用7b合成8i时，原料不同，将1-甲基哌嗪替换为1-甲基吗啉，其他条件以及中间体的合成与实施例8相同。

利用7b合成8i的收率为28.4％，¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.46(s,1h),6.05(s,1h),5.92(s,1h),5.33(s,1h),4.61(d,j＝6.0hz,2h),3.59(s,3h),3.25(t,j＝4.8hz,4h),2.77(d,j＝4.8hz,4h),3.02(p,j＝7.0hz,1h),2.33(s,3h),1.24(m,6h).hrms(esi-tof)m/zcalcdforc20h28n8o3[m+h]⁺:428.2284,found:428.2287。

实施例10

本实施例提供嘧啶类衍生物，即n4-(5-甲基-1h-吡唑-3-基)-5-甲氧基-6-[4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]-n2-{[3-(丙基-2-基)-1,2-恶唑-5-基]甲基}嘧啶-2,4-二胺(编号8j)，其结构式如下所示：

8j的合成步骤与实施例8提供的8g的合成步骤相同，区别仅在于：利用7b合成8j时，其他条件以及中间体的合成与实施例8g相同。

利用7b合成8j的收率为20.1％，¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.03(d,j＝8.5hz,2h),7.79(s,1h),6.95(d,j＝8.6hz,2h),6.08(d,j＝10.9hz,2h),5.47(s,1h),4.72(d,j＝6.0hz,2h),3.53(s,3h),3.43(t,j＝5.0hz,4h),3.06(m,j＝6.9hz,1h),2.59(t,j＝5.0hz,4h),2.37(s,3h),1.26-1.23(d,6h).hrms(esi-tof)m/zcalcdforc29h37n9o2[m+h]+:518.2986,found:518.2979。

实施例11

本实施例提供嘧啶类衍生物，即5-甲氧基-n4-(5-甲基-1h-吡唑-3-基)-n2-{[3-(丙基-2-基)-1,2-异恶唑-5-基]甲基}-6-[(1e)-2-(吡啶-4-基)乙烯基]嘧啶-2,4-二胺(编号8k)，其结构式如下所示：

8k的合成步骤与实施例10提供的8j的合成步骤相同，区别仅在于：利用7b合成8k时，原料不同，4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯硼酸频哪醇酯替换为反式-4-吡啶乙烯基苯硼酸频哪醇酯，其他条件以及中间体的合成与实施例10相同。

利用7b合成8k的收率为16.7％，¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.86(d,j＝16.8hz,1h),7.71(d,j＝5.4hz,2h),7.51(d,2h),7.46(s,1h),6.89(d,j＝16.8hz,1h),6.05(s,1h),5.92(s,1h),5.30(s,1h),4.62(d,2h),3.59(s,3h),3.02(p,j＝7.0hz,1h),2.36(s,3h),1.24(m,6h).hrms(esi-tof)m/zcalcdforc23h26n8o2[m+h]⁺:447.2251,found:447.2258。

实验例

分别将实施例1-实施例11的化合物(0.001μm，0.01μm，0.1μm，1μm以及10μm)或空白溶剂与待测的蛋白激酶以及相应的多肽底物共同加入到反应缓冲液中孵育，其中，反应缓冲液由8mm丙磺酸盐(mops，ph＝7.0)，0.2mm乙二胺四乙酸(edta)，10mm醋酸镁和10μm浓度的γ33p-atp溶液组成。整个反应在室温下进行40min后，向反应缓冲液中加入3％的磷酸盐溶液以终止反应。随后定量吸取10μl反应混合液滴在p30滤纸上，并用75mm的磷酸盐溶液清洗3次，再用甲醇清洗一次，将p30滤纸晾干后加入闪烁液进行闪烁计数。化合物的抑制活性用半数抑制浓度ic50来表示，ic50值由各浓度梯度对应的抑制率拟合得到。实验结果参见下表：

化合物对有丝分裂相关激酶的抑制活性

表中，a代表化合物对相应靶蛋白的ic50小于10nm，b代表化合物对相应靶蛋白的ic50位于10-50nm之间，c代表化合物对相应靶蛋白的ic50位于50-100nm之间，d代表化合物对相应靶蛋白的ic50大于100nm。

以上测试结果表明这些化合物对于plk4激酶等并具有良好的抑制效果。

部分化合物对于有丝分裂相关激酶的活性

^a每个化合物的ic50测试2次，每个ic50设9个浓度，从10μm开始，三倍稀释。

以上测试结果表明这些化合物对于plk4激酶活性要明显优于auroraa激酶。

部分化合物对于pten基因不同状态的肿瘤细胞株的增殖抑制效果

^a每个化合物的ic50测试2次，每个ic50设9个浓度，从10μm开始，三倍稀释。

综上所述，本发明实施例提供的嘧啶类衍生物对于plk4蛋白激酶有显著的抑制效果。对于pten缺失突变的pc-3、bt549等肿瘤细胞株十分敏感，同时对mda-mb-231、skbr-3等pten野生型细胞株活性更弱。同时也表明本发明具有独特的抗pten缺陷型肿瘤的抑制效果。

综上所述，本发明实施例提供的嘧啶类衍生物对于蛋白激酶有良好的抑制效果，特别是对plk4有显著的抑制效果，能够有效抑制pten缺陷型肿瘤。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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