酸响应的近红外溶酶体有机小分子荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种具备溶酶体靶向和酸激活荧光增强特性的近红外荧光探针及其制备方法，以及该荧光探针在近红外窗口(800-1300nm)细胞溶酶体染色中的应用。

背景技术：

溶酶体是一类十分重要的细胞器，在细胞及生物体的各项生理活动中起着重要作用。如参与细胞内蛋白质降解、细胞膜修复、细胞凋亡和维持细胞内稳态等多项生理过程，另外已有研究表明，溶酶体异常与多种疾病发生有关，如溶酶体贮积症等。同时，溶酶体内含有60多种酸性水解酶、ph为3.5～5.5的酸性环境，同时参与细胞胞吞胞吐的作用通路，这些特殊的性质为各种生物研究提供了极大地方便，如可以利用溶酶体中含有的特殊的水解酶设计靶向性探针、利用溶酶体的酸性环境和ph变化设计酸响应的探针，或者利用其胞吞胞吐途径来追踪生物因子或药物在体内的运输途径等。因此，对细胞溶酶体的研究在生物医学领域具有重大指导意义。

目前商业化的溶酶体探针十分丰富，如celllightlysosomes-gfp系列，可用于荧光蛋白成像进行溶酶体定位分析，标记溶酶体膜；经典的lysotracker系列，可实现在毫微摩尔浓度下标记酸性细胞器，通过荧光成像进行溶酶体定位等。但这些商业化的溶酶体探针普遍检测波长集中在可见光区域，目前最长的商业化溶酶体探针仅能到636/651纳米，仅能实现可见波段的溶酶体共定位。

近年来，随着近红外(800-1300nm)荧光成像技术的发展，其在活体成像中的应用优势日益突出，在活体水平研究细胞溶酶体具有重大意义。因此，开发新红外(800-1300nm)溶酶体靶向探针对于生物医学领域以及生物材料领域的基础研究具有极大的指导意义和应用价值。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种生物相容性好和波长可调的、具备溶酶体靶向和酸激活荧光增强特性的用于近红外区窗口生物成像的有机小分子荧光探针的制备方法和应用。

本发明提供的一种具有溶酶体靶向和酸激活荧光增强特性的用于近红外区窗口生物成像的有机小分子荧光探针，记为nirlysotracker，简记为nirlyso，其化合物结构通式如下述a或b所示：

其中：

x选自o或s，r1～r5可各自独立选自o(ch2)n1ch3或(ch2)n1ch3烷基链，也可选自h、f、cl、br、i原子；r6选自h、ch2(ch2)n1ch3、cooc(ch3)或ch3，n1为0-6的整数；y选自clo4、pf6、bf4、cl、br、i、cf3coo、cf3so3或ch3so3。

本发明的有机小分子荧光探针，其核心结构是在前人研究的基础上扩展创新设计出的一类新的荧光探针结构，完成了合成路线的探讨研究，且修饰了取代的哌嗪基团n(ch2)2(ch2)2nr6的结构未见文献报道。

本发明的有机小分子荧光探针，具备溶酶体靶向特性和酸激活荧光增强特性，同时具备此类特点的近红外窗口的荧光染料分子，未见文献报道。

本发明的有机小分子荧光探针，可作为近红外溶酶体探针用于生物成像。

具体地：

本发明的有机小分子荧光探针，具备溶酶体靶向性，具体表现为：

染料分子上的哌嗪基团具有溶酶体靶向性，与细胞共孵育12～24小时后能够点亮细胞的溶酶体，并且可以在细胞溶酶体中滞留。

本发明的有机染料小分子荧光探针，具备酸激活荧光增强特性，具体表现为：

染料分子的光物理性质与环境的酸性有关，环境的酸性越强，染料分子的发光越强；环境酸性从ph＝7变化为ph＝5时，染料分子的荧光可以增强1.6～4.2倍。

因此，本发明的有机染料小分子荧光探针可作为近红外溶酶体探针用于细胞溶酶体染色中，并在近红外窗口进行荧光成像。

本发明还提出上述有机染料小分子荧光探针的制备方法，具体如下：

当x选自o时，合成步骤为：

以取代2-羟基苯乙酮、取代哌嗪和取代苯乙酮为原料，依次通过亲核取代反应，羟醛缩合脱水成环反应得到端基盐，端基盐再与缩合剂戊烯二醛二缩苯胺盐酸盐发生knoevenagel缩合反应得到具有溶酶体靶向、酸激活荧光增强特点的nirlyso系列染料分子。

当x选自s时：合成步骤为：

以取代苯硫酚、取代苯甲酸乙酰乙酯、取代哌嗪为原料，依次通过多聚磷酸缩合成环反应，buchwald-hartwig胺化反应得到哌嗪基取代的苯并噻喃衍生物；苯并噻喃衍生物进一步通过甲基化格式试剂进行烷基化并用酸处理制成端基盐，端基盐再与缩合剂戊烯二醛二缩苯胺盐酸盐发生knoevenagel缩合反应得到最终具有溶酶体靶向、酸激活荧光增强特点的nirlyso系列染料分子。

进一步具体地：

(1)对于通式a，当x为s时，其合成路线如下：

具体合成步骤如下：

(1-1)中间体1的合成

将对取代苯硫酚(化合物1)与取代苯基乙酰乙酸乙酯(化合物3)溶于多聚磷酸中，在90～100℃下反应1～3小时；冷却后加入碎冰淬灭反应，用二氯甲烷萃取，有机相浓缩并用柱色谱分离得到中间体1；其中化合物1、化合物3和多聚磷酸的投料摩尔比为1:(1.～1.3):(10～15)；

(1-2)中间体2的合成

将哌嗪(化合物2)、化合物4和碳酸钾溶于乙腈中，于80～100℃反应16～24小时；冷却至室温后过滤，有机相浓缩并用柱色谱分离得到中间体2；其中化合物2、化合物4和碳酸钾的摩尔投料比为1：(1～1.2)：(3～5)；

(1-3)中间体3的合成

在氮气保护下，将中间体1、中间体2、buchwald催化剂和无机碱混合于干燥溶剂中，于80～110℃下反应3～12小时；冷却至室温后过滤，有机相浓缩并用柱色谱分离得到中间体3；其中，buchwald催化剂为一种组合物，取自醋酸钯、三(二亚苄基丙酮)二钯中的一种，和2-二环己基磷-2',4',6'-三异丙基联苯、4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽、2-二环己膦基-2'-(n,n-二甲胺)-联苯中的一种，其投料摩尔百分比均为中间体1的1～10％；中间体1、取代烷基胺hn[(ch2)nch3]2和无机碱的投料摩尔比为1:(2～5):(1.2～3)，无机碱选自叔丁醇钠，碳酸铯，碳酸钾和磷酸钾中的一种；溶剂选自甲苯，二氧六环和四氢呋喃中的一种；

(1-4)中间体4的合成

中间体3溶于干燥四氢呋喃中，在氮气保护下，加入甲基溴化镁，室温下反应0.5～2小时，加入10％质子酸淬灭反应，生成沉淀，过滤得中间体4；其中，中间体3和甲基溴化镁的投料摩尔比为1:(3～5)，质子酸选自hclo4、hpf6、hbf4、hcl、hbr、hi、cf3cooh、cf3so3h和ch3so3h中的一种；

(1-5)产物1的合成

将中间体4、丙二醛二缩苯胺盐酸盐(化合物5)、醋酸钠混合于醋酸酐中，在氮气保护下，于80-130℃下反应5～8小时；反应结束后加入乙醚沉淀，过滤，用二氯甲烷溶解滤饼，并用柱色谱分离，最终得到产物1；其中，中间体4、化合物5和醋酸钠的投料摩尔比为(1～1.5):0.5:(1～1.5)；

(2)对于通式b，当x为s时，其合成路线如下：

具体合成步骤如下：

(2-1)中间体5的合成

将间取代苯硫酚即化合物6与取代苯基乙酰乙酸乙酯即化合物3溶于多聚磷酸中，在90～100℃下反应1～3小时；冷却后加入碎冰淬灭反应，用二氯甲烷萃取，有机相浓缩并用柱色谱分离得到中间体5；其中化合物6、化合物3和多聚磷酸的投料摩尔比为1:(1.～1.3):(10～15)；

(1-2)中间体2的合成

将哌嗪即化合物2、化合物4和碳酸钾溶于乙腈中，于80～100℃反应16～24小时；冷却至室温后过滤，有机相浓缩并用柱色谱分离得到中间体2；其中化合物2、化合物4和碳酸钾的摩尔投料比为1：(1～1.2)：(3～5)；

(1-3)中间体6的合成

在氮气保护下，将中间体5、中间体2、buchwald催化剂和无机碱混合于干燥溶剂中，于80～110℃下反应3～12小时；冷却至室温后过滤，有机相浓缩并用柱色谱分离得到中间体6；其中，buchwald催化剂为一种组合物，取自醋酸钯、三(二亚苄基丙酮)二钯中的一种，和2-二环己基磷-2',4',6'-三异丙基联苯、4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽、2-二环己膦基-2'-(n,n-二甲胺)-联苯中的一种，其投料摩尔百分比均为中间体1的1～10％；中间体5、中间体2和无机碱的投料摩尔比为1:(2～5):(1.2～3)，无机碱选自叔丁醇钠，碳酸铯，碳酸钾和磷酸钾中的一种；溶剂选自甲苯，二氧六环和四氢呋喃中的一种；

(1-4)中间体7的合成

中间体6溶于干燥四氢呋喃中，在氮气保护下，加入甲基溴化镁，室温下反应0.5～2小时，加入10％质子酸淬灭反应，生成沉淀，过滤得中间体7；其中，中间体6和甲基溴化镁的投料摩尔比为1:(3～5)，质子酸选自hclo4、hpf6、hbf4、hcl、hbr、hi、cf3cooh、cf3so3h和ch3so3h中的一种；

(1-5)产物2的合成

将中间体7、丙二醛二缩苯胺盐酸盐即化合物5、醋酸钠混合于醋酸酐中，在氮气保护下，于80-130℃下反应5～8小时；反应结束后加入乙醚沉淀，过滤，用二氯甲烷溶解滤饼，并用柱色谱分离，最终得到产物2；其中，中间体4、化合物5和醋酸钠的投料摩尔比为(1～1.5):0.5:(1～1.5)；

(3)对于通式a，当x为o时，其合成路线如下：

具体合成步骤如下：

(3-1)中间体8的合成

在氮气保护下，将化合物7、中间体2、buchwald催化剂和无机碱混合于干燥溶剂中，于80～110℃下反应2～10小时；冷却至室温后过滤，有机相浓缩并用柱色谱分离得到中间体8；其中，buchwald催化剂为一种组合物，取自醋酸钯、三(二亚苄基丙酮)二钯中的一种，和2-二环己基磷-2',4',6'-三异丙基联苯、4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽、2-二环己膦基-2'-(n,n-二甲胺)-联苯中的一种，其投料摩尔百分比均为化合物7的1～10％；化合物7、中间体2和无机碱的投料摩尔比为1:(2～5):(1.2～3)，无机碱选自叔丁醇钠，碳酸铯，碳酸钾和磷酸钾中的一种；溶剂选自甲苯，二氧六环和四氢呋喃中的一种；

(3-2)中间体9的合成

在氮气保护下，将中间体8与化合物8加入到乙酸和质子酸的混合溶剂中，在115～120℃回流8～16小时；冷却至室温后，加乙酸乙酯至反应体系中有大量沉淀生成，过滤，收集滤渣，干燥得到中间体9；其中中间体8与化合物8的反应摩尔投料比为1：(1～1.2)，乙酸与质子酸的混合体积比为2：1，质子酸选自hclo4、hpf6、hbf4、hcl、hbr、hi、cf3cooh、cf3so3h和ch3so3h中的一种；

(3-3)产物3的合成

将中间体9、丙二醛二缩苯胺盐酸盐、醋酸钠混合于醋酸酐中，在氮气保护下，于80-130℃下反应5～8小时；反应结束后加入乙醚沉淀，过滤，用二氯甲烷溶解滤饼，并用柱色谱分离，最终得到产物3；其中，中间体9、丙二醛二缩苯胺盐酸盐和醋酸钠的投料摩尔比为(1～1.5):0.5:(1～1.5)；

(4)对于通式b，当x为o时，其合成路线如下：

具体合成步骤如下：

(4-1)中间体10的合成

在氮气保护下，将化合物9、中间体2、buchwald催化剂和无机碱混合于干燥溶剂中，于80～110℃下反应2～10小时；冷却至室温后过滤，有机相浓缩并用柱色谱分离得到中间体10；其中，buchwald催化剂为一种组合物，取自醋酸钯、三(二亚苄基丙酮)二钯中的一种，和2-二环己基磷-2',4',6'-三异丙基联苯、4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽、2-二环己膦基-2'-(n,n-二甲胺)-联苯中的一种，其投料摩尔百分比均为化合物9的1～10％；化合物9、中间体2和无机碱的投料摩尔比为1:(2～5):(1.2～3)，无机碱选自叔丁醇钠，碳酸铯，碳酸钾和磷酸钾中的一种；溶剂选自甲苯，二氧六环和四氢呋喃中的一种；

(4-2)中间体11的合成

在氮气保护下，将中间体10与化合物8加入到乙酸和质子酸的混合溶剂中，在115～120℃回流8～16小时；冷却至室温后，加乙酸乙酯至反应体系中有大量沉淀生成，过滤，收集滤渣，干燥得到中间体11；其中中间体10与化合物8的反应摩尔投料比为1：(1～1.2)，乙酸与质子酸的混合体积比为2：1，质子酸选自hclo4、hpf6、hbf4、hcl、hbr、hi、cf3cooh、cf3so3h和ch3so3h中的一种；

(4-3)产物4的合成

将中间体11、丙二醛二缩苯胺盐酸盐、醋酸钠混合于醋酸酐中，在氮气保护下，于80-130℃下反应5～8小时；反应结束后加入乙醚沉淀，过滤，用二氯甲烷溶解滤饼，并用柱色谱分离，最终得到产物4；其中，中间体11、丙二醛二缩苯胺盐酸盐和醋酸钠的投料摩尔比为(1～1.5):0.5:(1～1.5)。

本发明提供的一系列荧光探针nirlyso，在乙醇溶液中，最大吸收峰位于820～960nm，最大发射峰位于855～1017nm。

本发明提供的一系列荧光探针nirlyso，在乙醇溶液中的摩尔消光系数为25500～82000m^-1cm^-1。

本发明提供的一系列荧光探针nirlyso，在乙醇溶液中的荧光量子产率为0.035％～0.23％。

本发明提供的一系列荧光探针nirlyso，在808nm激光器激发下，当溶液ph值从7变化至5时，荧光强度增加1.6～4.2倍。

本发明提供的一系列荧光探针nirlyso，与细胞共孵育后可以点亮细胞的溶酶体。

附图说明

图1为808nm激发，nirlyso1005荧光探针荧光强度随ph的变化图(对应实施例1)。

图2为808nm激发，nirlyso880荧光探针荧光强度随ph的变化图(对应实施例3)

图3为808nm激发，nirlyso855荧光探针荧光强度随ph的变化图(对应实施例4)。

图4为808nm激发，nirlyso950荧光探针荧光强度随ph的变化图(对应实施例2)。

图5为808nm激发，nirlyso880荧光探针靶向细胞溶酶体的显微成像图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，本发明用以下具体实施例进行说明，但本发明绝非限于这些例子。以下所述仅为本发明较好的实施例，仅用于解释本发明，并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，凡是本发明的精神和原则之内所做的任何修改、替代或改进均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例1：

nirlyso1005荧光探针的制备，化合物结构式如下：

具体合成路线如下：

具体合成步骤如下：

(1)中间体1-1的合成

将对溴取代苯硫酚(化合物1-1)与取代苯基乙酰乙酸乙酯(化合物1-2)溶于多聚磷酸中，在90～100℃下反应1～3小时；冷却后加入碎冰淬灭反应，用二氯甲烷萃取，有机相浓缩并用柱色谱分离得到中间体1-1；其中化合物1-1、化合物1-2和多聚磷酸的投料摩尔比为1:(1.～1.3):(10～15)；

(2)中间体1-2的合成

在氮气保护下，将中间体1-1、甲基哌嗪、buchwald催化剂和无机碱混合于干燥溶剂中，于80～110℃下反应3～12小时；冷却至室温后过滤，有机相浓缩并用柱色谱分离得到中间体1-2；其中，buchwald催化剂为一种组合物，取自醋酸钯、三(二亚苄基丙酮)二钯中的一种，和2-二环己基磷-2',4',6'-三异丙基联苯、4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽、2-二环己膦基-2'-(n,n-二甲胺)-联苯中的一种，其投料摩尔百分比均为中间体1-1的1～10％；中间体1-1、甲基哌嗪和无机碱的投料摩尔比为1:(2～5):(1.2～3)，无机碱选自叔丁醇钠，碳酸铯，碳酸钾和磷酸钾中的一种；溶剂选自甲苯，二氧六环和四氢呋喃中的一种；

(3)中间体1-3的合成

中间体1-2溶于干燥四氢呋喃中，在氮气保护下，加入甲基溴化镁，室温下反应0.5～2小时，加入10％质子酸淬灭反应，生成沉淀，过滤得中间体1-3；其中，中间体1-2和甲基溴化镁的投料摩尔比为1:(3～5)，质子酸选自hclo4、hpf6、hbf4、hcl、hbr、hi、cf3cooh、cf3so3h和ch3so3h中的一种；

(4)产物nirlyso1005的合成

将中间体1-3、丙二醛二缩苯胺盐酸盐、醋酸钠混合于醋酸酐中，在氮气保护下，于80-130℃下反应5～8小时；反应结束后加入乙醚沉淀，过滤，用二氯甲烷溶解滤饼，并用柱色谱分离，最终得到产物lyso1005；其中，中间体1-3、丙二醛二缩苯胺盐酸盐和醋酸钠的投料摩尔比为(1～1.5):0.5:(1～1.5)。

在808nm激发下，nirlyso1005荧光探针荧光强度随ph的变化，如图1所示；光物理性质数据，见下表：

实施例2：

nirlyso950荧光探针的制备，化合物结构式如下：

具体合成路线如下：

具体合成步骤如下：

(1)中间体2-1的合成

将间溴取代苯硫酚(化合物2-1)与取代苯基乙酰乙酸乙酯(化合物2-2)溶于多聚磷酸中，在90～100℃下反应1～3小时；冷却后加入碎冰淬灭反应，用二氯甲烷萃取，有机相浓缩并用柱色谱分离得到中间体2-1；其中化合物2-1、化合物2-2和多聚磷酸的投料摩尔比为1:(1.～1.3):(10～15)；

(2)中间体2-2的合成

在氮气保护下，将中间体2-1、甲基哌嗪、buchwald催化剂和无机碱混合于干燥溶剂中，于80～110℃下反应3～12小时；冷却至室温后过滤，有机相浓缩并用柱色谱分离得到中间体2-2；其中，buchwald催化剂为一种组合物，取自醋酸钯、三(二亚苄基丙酮)二钯中的一种，和2-二环己基磷-2',4',6'-三异丙基联苯、4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽、2-二环己膦基-2'-(n,n-二甲胺)-联苯中的一种，其投料摩尔百分比均为中间体2-1的1～10％；中间体2-1、甲基哌嗪和无机碱的投料摩尔比为1:(2～5):(1.2～3)，无机碱选自叔丁醇钠，碳酸铯，碳酸钾和磷酸钾中的一种；溶剂选自甲苯，二氧六环和四氢呋喃中的一种；

(3)中间体2-3的合成

中间体2-2溶于干燥四氢呋喃中，在氮气保护下，加入甲基溴化镁，室温下反应0.5～2小时，加入10％质子酸淬灭反应，生成沉淀，过滤得中间体2-3；其中，中间体2-2和甲基溴化镁的投料摩尔比为1:(3～5)，质子酸选自hclo4、hpf6、hbf4、hcl、hbr、hi、cf3cooh、cf3so3h和ch3so3h中的一种；

(4)产物nirlyso950的合成

将中间体2-3、丙二醛二缩苯胺盐酸盐、醋酸钠混合于醋酸酐中，在氮气保护下，于80-130℃下反应5～8小时；反应结束后加入乙醚沉淀，过滤，用二氯甲烷溶解滤饼，并用柱色谱分离，最终得到产物lyso950；其中，中间体2-3、丙二醛二缩苯胺盐酸盐和醋酸钠的投料摩尔比为(1～1.5):0.5:(1～1.5)。

在808nm激发下，nirlyso950荧光探针荧光强度随ph的变化，见图4所示。

实施例3：

nirlyso880光探针的制备，化合物结构式如下：

具体合成路线如下：

具体合成步骤如下：

(3-1)中间体3-1的合成

在氮气保护下，将化合物3-1、甲基哌嗪、buchwald催化剂和无机碱混合于干燥溶剂中，于80～110℃下反应2～10小时；冷却至室温后过滤，有机相浓缩并用柱色谱分离得到中间体3-1；其中，buchwald催化剂为一种组合物，取自醋酸钯、三(二亚苄基丙酮)二钯中的一种，和2-二环己基磷-2',4',6'-三异丙基联苯、4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽、2-二环己膦基-2'-(n,n-二甲胺)-联苯中的一种，其投料摩尔百分比均为化合物3-1的1～10％；化合物3-1、甲基哌嗪和无机碱的投料摩尔比为1:(2～5):(1.2～3)，无机碱选自叔丁醇钠，碳酸铯，碳酸钾和磷酸钾中的一种；溶剂选自甲苯，二氧六环和四氢呋喃中的一种；

(3-2)中间体3-2的合成

在氮气保护下，将中间体3-1与化合物3-2加入到乙酸和质子酸的混合溶剂中，在115～120℃回流8～16小时；冷却至室温后，加乙酸乙酯至反应体系中有大量沉淀生成，过滤，收集滤渣，干燥得到中间体3-2；其中中间体3-1与化合物3-2的反应摩尔投料比为1：(1～1.2)，乙酸与质子酸的混合体积比为2：1，质子酸选自hclo4、hpf6、hbf4、hcl、hbr、hi、cf3cooh、cf3so3h和ch3so3h中的一种。

(3-3)产物nirlyso875的合成

将中间体3-2、丙二醛二缩苯胺盐酸盐、醋酸钠混合于醋酸酐中，在氮气保护下，于80-130℃下反应5～8小时；反应结束后加入乙醚沉淀，过滤，用二氯甲烷溶解滤饼，并用柱色谱分离，最终得到产物lyso875；其中，中间体3-2、丙二醛二缩苯胺盐酸盐和醋酸钠的投料摩尔比为(1～1.5):0.5:(1～1.5)。

在808nm激发下，nirlyso855荧光探针荧光强度随ph的变化，见图3所示。

实施例4：

nirlyso855荧光探针的制备，化合物结构式如下：

具体合成路线如下：

具体合成步骤如下：

(4-1)中间体4-1的合成

在氮气保护下，将化合物4-1、甲基哌嗪、buchwald催化剂和无机碱混合于干燥溶剂中，于80～110℃下反应2～10小时；冷却至室温后过滤，有机相浓缩并用柱色谱分离得到中间体4-1；其中，buchwald催化剂为一种组合物，取自醋酸钯、三(二亚苄基丙酮)二钯中的一种，和2-二环己基磷-2',4',6'-三异丙基联苯、4,5-双(二苯基膦)-9,9-二甲基氧杂蒽、2-二环己膦基-2'-(n,n-二甲胺)-联苯中的一种，其投料摩尔百分比均为化合物4-1的1～10％；化合物4-1、甲基哌嗪和无机碱的投料摩尔比为1:(2～5):(1.2～3)，无机碱选自叔丁醇钠，碳酸铯，碳酸钾和磷酸钾中的一种；溶剂选自甲苯，二氧六环和四氢呋喃中的一种；

(4-2)中间体4-2的合成

在氮气保护下，将中间体4-1与化合物3-2加入到乙酸和质子酸的混合溶剂中，在115～120℃回流8～16小时；冷却至室温后，加乙酸乙酯至反应体系中有大量沉淀生成，过滤，收集滤渣，干燥得到中间体4-2；其中中间体4-1与化合物3-2的反应摩尔投料比为1：(1～1.2)，乙酸与质子酸的混合体积比为2：1，质子酸选自hclo4、hpf6、hbf4、hcl、hbr、hi、cf3cooh、cf3so3h和ch3so3h中的一种。

(4-3)产物nirlyso855的合成

将中间体4-2、丙二醛二缩苯胺盐酸盐、醋酸钠混合于醋酸酐中，在氮气保护下，于80-130℃下反应5～8小时；反应结束后加入乙醚沉淀，过滤，用二氯甲烷溶解滤饼，并用柱色谱分离，最终得到产物lyso855；其中，中间体4-2、丙二醛二缩苯胺盐酸盐和醋酸钠的投料摩尔比为(1～1.5):0.5:(1～1.5)。

在808nm激发下，nirlyso855荧光探针荧光强度随ph的变化，见图3所示。

应用例：

准备1毫升的细胞培养皿，加入a549细胞悬浮液，待细胞贴壁密度达到60％时开始染色实验。将nirlyso880光探针溶于二甲亚砜中，制备成5mm的母液备用。取4微升的母液分散于1毫升的dmem细胞培养基中备用。移除上述培养皿中的培养基，用磷酸盐缓冲液小心清洗三遍，加入上述配制好的含有染料的1毫升培养基，，37摄氏度下孵育12～24小时；

孵育完成后，移除上述培养基，用磷酸盐缓冲液清洗三遍，再用商业化的溶酶体染料进行染色实验，孵育1小时后用磷酸盐缓冲液清洗三遍，用1毫升多聚甲醛固定细胞，2小时左右洗净，用共聚焦显微镜观察。

首先用内置的蓝光激发光激发观察商业溶酶体染料的信号通道，然后在相同的区域和放大倍数下用808纳米的外置激光器激发lyso880料，收集信号。分别可以得到对应信号通道下的细胞荧光图像。对比即可得到lyso880光探针对细胞溶酶体的定位和染色效果(如附图2所示)。

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