一种能双色同时成像细胞核和线粒体的pH敏感型荧光探针的制作方法
本发明涉及一种能双色成像活细胞中细胞核和线粒体的ph敏感型荧光探针及其利用细胞核和线粒体的形态和荧光强度的变化来观测损伤细胞或细胞凋亡的应用。
背景技术:
真核细胞中含有大量的膜包被的细胞器,这些细胞器通过彼此之间的相互协作形成一套完整的细胞器互作网络,以此完成一系列重要的生理过程。细胞器互作网络的紊乱会引发各种疾病,如胰腺炎、癌症和心血管病等。因此,对细胞器互作网络的深入研究可以进一步解析细胞器之间相互作用的分子调节机制,揭示细胞器互作网络在物质转运与利用、细胞器稳态调控等方面的作用。
细胞核和线粒体是细胞器互作网络中的两个重要细胞器,它们在细胞增殖与存活、细胞分化、有丝分裂、凋亡和信号转导等各式各样的生理过程中发挥关键作用。此外,这两个细胞器都在细胞凋亡过程中也有重要作用。研究表明,细胞核是细胞内一个重要的细胞器,细胞核的变化是细胞凋亡的重要标志,如dna的降解、染色质的浓缩和核支架蛋白的解体等。另一方面,线粒体在细胞凋亡过程中也呈现明显的变化,如caspase激活物的释放、线粒体膜电位(mmp)去极化和电子传输的改变等。因此,双色成像细胞核和线粒体对于观测细胞凋亡意义重大。
目前已有的细胞核探针和线粒体探针只能分别成像细胞核和线粒体。当需要同时成像时,需要分别用细胞核和线粒体探针染色细胞,这样的方法操作过程较复杂,也会对活细胞产生较大的毒性。为了解决这一系列问题,开发可同时区分成像细胞内细胞核和线粒体的单一双靶标荧光探针具有十分重要的意义。
鉴于目前的细胞核和线粒体探针只能分别成像细胞核和线粒体,还没有在活细胞中同时双色成像细胞核和线粒体并检测细胞凋亡的单一荧光探针的报道,开发能用两种荧光颜色同时成像细胞核和线粒体并观测其在细胞凋亡中变化的单一荧光探针具有重要意义。经检索,利用细胞核中的dna嗜碱特性以及线粒体维持ph=~8.0碱性环境形成的两种细胞器ph值差设计的以两种不同的发射光颜色分别标记细胞核和线粒体的ph敏感型荧光探针还未见报道。
技术实现要素:
针对现有技术的不足,本发明要解决的问题是提供一种能双色成像活细胞中细胞核和线粒体的ph敏感型荧光探针及其应用。
本发明所述的能双色同时成像细胞核和线粒体的ph敏感型荧光探针,其特征在于:所述荧光探针的化学命名为:(e)-2-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯乙烯基)-3-甲基苯并噻唑-3-碘盐,简称hmbi,其化学结构式如式(i)所示:
其中:上述r表示烷基。优选r表示c1-3的烷基。最优选r为甲基。
上述ph敏感型荧光探针hmbi的制备方法如下:
首先将4-甲基苯并噻唑(1)与碘甲烷混合反应得到化合物2;然后将化合物2与化合物3通过knoevenagel反应合成产物;最后通过柱色谱法获得产物纯化,得到的红褐色固体产物即为hmbi。制备反应式如下:
本发明所述的ph敏感型荧光探针hmbi是由羟基化半菁及苯并噻唑盐这两部分组成。羟基化半菁是ph反应探针的一个重要家族,这些带正电荷的探针可以通过静电相互作用选择性地染色线粒体。另一方面,苯并噻唑盐探针,如花青素染料和噻唑橙,可以插入dna中,与细胞核内dna的产生较强的结合力。此外,细胞核中的dna表现出嗜碱性特性,而线粒体在正常情况下维持碱性环境(ph=~8.0)。这两种细胞器ph值的差异使得本发明所述ph敏感型探针hmbi能够以两种不同的发射颜色分别标记细胞核和线粒体。
实验结果证实,本发明所述的ph敏感型荧光探针hmbi在酸性的细胞核中以酸式形式存在,发出绿色荧光,同时该探针能够在碱性的线粒体中以碱式存在,发出红色荧光。
上述的荧光探针hmbi在细胞上的选择性经过了严格的证明。在本发明所述的荧光探针hmbi在细胞染色的基础上,首先通过与商业化的细胞核探针(hoechst33342)进行复染实验,证实其具有较高的共定位系数(0.93),进而确认绿色的荧光来自于细胞核。进一步的,与商业化的线粒体探针(mtdr)进行复染实验,证实其具有较高的共定位系数(0.87),进而确认红色的荧光来自于线粒体。
本发明所述能双色同时成像细胞核和线粒体的ph敏感型荧光探针hmbi在同时用两种荧光颜色标记或成像显示活细胞中细胞核和线粒体的应用。
其中:所述活细胞为siha细胞;所述荧光探针hmbi的激发光是405nm时,能使细胞核显示出绿色荧光,所述荧光探针hmbi的激发光是543nm时,能使线粒体显示出红色荧光。
本发明所述能双色同时成像细胞核和线粒体的ph敏感型荧光探针hmbi在鉴别活性细胞和受损伤细胞中的应用。
其中:所述活细胞为siha细胞;所述荧光探针在受损伤细胞中的细胞核发出的荧光强度变化不明显,而在受损伤细胞中的线粒体发出的荧光强度明显减弱;在活性细胞中显色的荧光强度无变化。
实验证实:本发明所述的荧光探针可以区分活细胞和受损伤的细胞。在活的siha细胞中,该探针可以在两个通道中分别成像细胞核和线粒体,而用探针染色h2o2处理过的siha细胞时,细胞核的荧光强度变化不明显,而线粒体的荧光强度明显减弱。这证实了该探针可以区分活细胞和受损伤的细胞。
本发明所述能双色同时成像细胞核和线粒体的ph敏感型荧光探针hmbi在显示细胞凋亡过程中细胞核和线粒体形态变化中的应用。
其中:所述细胞为siha细胞;在未凋亡的细胞中,所述荧光探针以绿色荧光成像细胞核、以红色荧光成像线粒体;在凋亡细胞中,所述荧光探针以绿色荧光成像细胞核、并能观察到凋亡细胞中固缩的或呈新月形的细胞核,而成像线粒体的红色荧光强度显著降低。
实验证实:本发明所述探针可以显示细胞凋亡过程中细胞核和线粒体的变化。在未凋亡的细胞中,该探针可以用绿色和红色的荧光分别成像细胞核和线粒体,在用鱼藤酮或用紫杉醇诱导的凋亡细胞中,该探针可以呈现出绿色的细胞核,而线粒体的红色荧光强度显著降低。此外,该探针可以观察到凋亡细胞中固缩的或呈新月形的细胞核。这说明该探针可以观察凋亡过程中细胞核和线粒体的变化。
本发明的有益结果是:相比于商用的细胞核或线粒体探针,本发明的ph敏感型荧光探针hmbi可以以绿色和红色的荧光分别成像细胞核和线粒体。该探针的毒性低,生物相容性好,可以减少两种探针共同染细胞核和线粒体的繁琐操作,并降低由此引起的细胞毒性。此外,可以通过线粒体荧光强度变化来区分活细胞和受损伤的细胞,还可以研究细胞凋亡过程中细胞核和线粒体荧光强度及形态的变化,这使得其具有重要的实验应用价值。
附图说明
图1:(a)探针hmbi在含2%dmso的不同ph值的britton-robinson(br)缓冲溶液中的吸收光谱。(b)不同ph值下,激发波长为405nm的hmbi的荧光光谱(溶剂为:含2%dmso的br缓冲液)。(c)不同ph值下,激发波长为543nm的hmbi的荧光光谱(溶剂为:含2%dmso的br缓冲液)。(d)i550/i605与不同ph值的关系。(e)探针hmbi在不同ph下的荧光响应时间。(f)hmbi在ph=4.0和ph=9.0下的ph值响应的可逆性。探针浓度:10μm。从图中可以看出探针hmbi对ph有着较高的灵敏度。
图2:(a)用5μm的探针hmbi染色活性siha细胞的双通道共聚焦显微镜图像。(b)hmbi(5μm,30分钟)与商用探针(5μmhoechst33342,10分钟;200nmmtdr,10分钟)共同染色siha细胞的共聚焦显微镜图像。其中hmbi在绿光通道的激发波长为405nm,荧光收集波长为510-560nm;在红光通道的激发波长为543nm,荧光收集波长为560-660nm;hoechst33342的激发波长为405nm,收光范围为410-460nm;mtdr的激发波长为635nm,收光范围为663-738nm;从图中可以看出探针hmbi可以以绿色和红色同时成像细胞核和线粒体。此外,在细胞核和线粒体中的共定位系数分别为0.93和0.87(merged图)。
图3:用5μm的探针hmbi分别染色未处理和用h2o2预处理的siha细胞的共聚焦荧光图像。其中hmbi在绿光通道的激发波长为405nm,荧光收集波长为510-560nm;在红光通道的激发波长为543nm,荧光收集波长为560-660nm。结果显示用h2o2预处理的细胞的细胞核荧光强度变化不明显,而线粒体的荧光强度显著降低。
图4:用5μm的探针hmbi分别染色未处理、用紫杉醇预处理和用鱼藤酮预处理的siha细胞的共聚焦荧光图像。其中hmbi在绿光通道的激发波长为405nm,荧光收集波长为510-560nm;在红光通道的激发波长为543nm,荧光收集波长为560-660nm。结果显示,相比于未处理的细胞,处理后细胞的线粒体荧光强度显著降低,在绿光通道中可以看到固缩的细胞核。
图5:用不同浓度的探针hmbi孵育siha细胞12小时的细胞存活率。结果显示用25μm的hmbi孵育siha细胞12小时后,细胞存活率仍高达88%,说明探针的毒性很低。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已,应该说明的是,下述说明仅仅是为了解释本发明,并非对本发明作任何形式上的限制,凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改,等同变化与修饰,均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中,所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均从商业途径得到。
实施例1:探针hmbi的合成
1)苯并噻唑碘盐(化合物2)的合成
将化合物1(4-甲基苯并噻唑2.53ml,10mmol)和ch3i(1.49ml,10mmol)溶于20ml纯乙醇溶液中,在烧瓶中搅拌1小时。然后回流8h,冷却过滤后用无水etoh洗涤3次。干燥后得到白色固体,即化合物2(质量:3.52g,产率:91%)。
1hnmr(300mhz,dmso-d6),δ(ppm):8.44(q,j=8.0hz,1h),8.29(d,j=8.4hz,1h),7.85–7.98(m,1h),7.73–7.84(m,1h),4.2(s,3h),3.18(s,3h)。
2)探针hmbi的合成
将化合物2(0.291g,1mmol)和化合物3(0.182g,1mmol)溶于20ml甲醇中,在烧瓶中搅拌1h,加入5滴哌啶。搅拌后在85℃回流8h,冷却至室温后用石油醚洗涤。以ch2cl2/ch3oh混合物(10:1~6:1,v/v)为洗脱液,进行柱色谱分离提纯,得到棕色固体即为探针hmbi(质量:0.284g,产率:60%)。
1hnmr(300mhz,dmso-d6),δ(ppm):9.69(s,1h),8.39(d,j=7.8hz,1h),8.14(q,j=11.0hz,2h),7.65-7.93(m,3h),7.41(s,2h),4.33(s,3h),3.89(s,6h).13cnmr(75mhz,dmso-d6),δ(ppm):172.19,150.21,148.73,142.49,142.09,129.61,128.44,127.79,124.89,124.53,116.93,110.65,108.72,56.85,36.69.hrms:m/zcalculatedfor[c18h18no3s+]328.1002([m-i]+);found:328.0979。
制备反应式如下:
实施例2:ph滴定实验
配制不同ph值(ph=4.0–9.0)的含2%dmso的br缓冲液,用上述缓冲液配制含10μmhmbi的测试溶液,将上述溶液用紫外-可见分光光度计和荧光光谱仪测试其吸收光谱和荧光发射光谱。
结果见图1。
在图1a中,探针hmbi在420nm处有一个吸收峰,随着ph值从4.0增加到9.0,吸光度逐渐减小。同时,随着ph值的增加,550nm处的吸光度逐渐增大。在460nm处可以观察到一个明显的等当点。在405nm的激发下,随着ph值从4.0增加到9.0,hmbi的荧光强度逐渐降低(图1b)。而hmbi在543nm激发光的激发下,随着ph值从4.0增加到9.0,荧光强度逐渐增强(图1c)。在ph从8.0减少到4.0时,荧光强度比(i550/i605),增强了近350倍(图1d),根据henderson-hasselbalch方程(log[(imax-i)/(i-imin)]=ph-pka)计算出探针的pka为5.87。在ph=4.0和ph=9.0时,hmbi均可以在15秒内做出响应(图1e)。此外,当br缓冲液中的ph值从4.0变化到9.0时,其荧光强度比也会变化,因此,hmbi对ph具有良好的可逆性(图1f)。实验说明hmbi对ph的变化非常灵敏,探针hmbi可以潜在地用于活细胞中不同ph值的细胞器的双色荧光成像。
实施例3:siha细胞的培养
将siha细胞贴壁培养于内含10%胎牛血清的高糖培养液中,在37℃,5%co2的饱和湿度孵箱中培养,每隔2-3天更换培养液,并进行传代培养。待细胞生长到对数期,接片培养:
①将盖玻片于无水乙醇中浸泡30min,酒精灯烘干后放入一次性35mm培养皿中,备用;
②将100ml细胞瓶中长满的细胞用pbs洗三遍,用1ml0.25%胰酶消化3-5分钟,小心地倒出胰酶,加入新鲜培养液吹打均匀并细胞计数,以培养液的添加量控制细胞密度,使细胞终浓度为每毫升1×105个,然后接种至内上述含盖玻片的培养皿中,放入5%co2培养箱中培养,使细胞紧贴培养皿生长。待siha细胞爬片生长并长满盖玻片后,用于细胞实验。
实施例4:探针hmbi在活性siha细胞中的共定位实验
首先,用dmso配制浓度为1mm的探针母液。待siha细胞爬片长满盖玻片后,将活性siha细胞在含5μmhmbi的培养液中孵育30min,pbs冲洗两次后,将5μmhoechst33342加入培养液中孵育10min,用荧光共聚焦显微镜对细胞进行成像。
再将活性siha细胞先用5μmhmbi在培养液中孵育30min,pbs冲洗两次后,将0.2μmmtdr加入培养液中孵育10min,用荧光共聚焦显微镜对细胞进行成像。
结果见图2。
其中(a)用5μm的探针hmbi染色活性siha细胞的双通道共聚焦显微镜图像。(b)hmbi(5μm,30分钟)与商用探针(5μmhoechst33342,10分钟;200nmmtdr,10分钟)共同染色siha细胞的共聚焦显微镜图像。其中hmbi在绿光通道的激发波长为405nm,荧光收集波长为510-560nm;在红光通道的激发波长为543nm,荧光收集波长为560-660nm;hoechst33342的激发波长为405nm,收光范围为410-460nm;mtdr的激发波长为635nm,收光范围为663-738nm;从图中可以看出探针hmbi可以以绿色和红色同时成像细胞核和线粒体。此外,荧光图像还显示hmbi在绿光部分与hoechst33342有着很好的重叠,在红光部分与mtdr有很好的重叠,共定位系数分别为0.93和0.87(merged图)。充分证明本发明的探针hmbi能够分别用绿色和红色荧光同时成像活性siha细胞的细胞核和线粒体。
实施例5:用探针hmbi区分正常细胞和受损伤细胞
对照组用5μm的hmbi染色活性siha细胞30min,然后,用荧光共聚焦显微镜观察。实验组首先用3mmh2o2预处理siha细胞2h,然后,用5μm的hmbi染色预处理的细胞,接着用荧光共聚焦显微镜观察。记录细胞中着色部位,荧光分布及亮度变化等。
结果见图3:用5μm的探针hmbi染色未处理和用h2o2预处理的siha细胞的共聚焦荧光图像。
其中hmbi在绿光通道的激发波长为405nm,荧光收集波长为510-560nm;在红光通道的激发波长为543nm,荧光收集波长为560-660nm。结果显示用h2o2预处理的细胞的细胞核荧光强度变化不明显,都呈现出绿色的荧光,而线粒体在红光通道内的荧光强度显著降低。由此,可以证实探针hmbi可以用于区分活性细胞和受损伤的细胞。
实施例6:显示细胞凋亡过程中细胞核和线粒体变化
对照组用5μm的hmbi染色活性siha细胞30min,然后,用荧光共聚焦显微镜观察。在实验组中,先将鱼藤酮溶解在dmso中,得到2.5mm的母液。siha细胞在玻璃底培养皿中培养24h。对照组加入2μldmso,混合均匀。然后将siha细胞孵育24h,实验组加入5μm鱼藤酮和2μldmso混合均匀。孵育24小时后,两组细胞均用5μmhmbi染色30分钟,最后,用激光共聚焦显微镜成像。
另一组与鱼藤酮处理相似,先将紫杉醇溶解于dmso中,得到1mm母液。将siha细胞孵育24小时,用5μm的紫杉醇孵育36小时,然后用5μmhmbi染色30分钟,用激光共聚焦显微镜成像。
结果见图4:用5μm的探针hmbi分别染色未处理、用紫杉醇预处理和用鱼藤酮预处理的siha细胞的共聚焦荧光图像。
其中hmbi在绿光通道的激发波长为405nm,荧光收集波长为510-560nm;在红光通道的激发波长为543nm,荧光收集波长为560-660nm。结果显示,未处理的细胞展现出绿色的细胞核和红色的线粒体,在实验组中,用鱼藤酮和紫杉醇处理后的细胞,绿色(细胞核)的荧光强度变化不明显,红色(线粒体)的荧光强度显著降低,这可能是由于用凋亡药物处理后,线粒体的ph值降低引起的。此外,实验组中,在绿光通道中可以看到固缩的细胞核。明确提示本发明的探针能够观察细胞凋亡过程中细胞核和线粒体的变化。
实施例7:探针hmbi的毒性测试
用标准mtt法测定活细胞的细胞毒性。将对数期生长的siha细胞接种于96孔板(约1×104个细胞/孔),用无细胞的培养基填充小孔作为空白组。将接种的细胞置于37℃,5%co2培养箱内孵育24h,然后将2、5、10、15、20、25μm浓度的hmbi加入到孔中作为实验组。此外,加入终浓度为含0.2%dmso的dmem培养液作为对照组。细胞在37℃,5%co2下孵育12小时。然后每孔加入mtt(5mg/ml)。37℃孵育4h后,加入100μl的dmso。再孵育20分钟后,使用酶标仪测试每个孔在490nm处的吸光度,细胞毒实验重复4次。
细胞存活率可通过下述公式计算得到:
其中,asample为实验组吸光度,ac为对照组吸光度,ab为空白组的吸光度。
结果见图5:用不同浓度的探针hmbi孵育siha细胞12小时的细胞存活率。
实验结果显示用25μm的hmbi孵育siha细胞12小时后,细胞存活率仍高达88%,说明探针的毒性很低。
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