一种用于检测肝素的碳量子点荧光探针的制作方法

本发明属于肝素检测技术领域，具体涉及一种用于检测肝素的碳量子点荧光探针。

背景技术：

临床上肝素已被普遍用作抗凝剂，可以有效地防止手术过程中的血液凝结和血栓形成。据数据显示，肝素在心血管外科治疗中所剂量为2-8u/ml（10.8-43.2μg/ml），而在术后治疗或者长期治疗中肝素钠的用量则为0.2-1.2u/ml（1.08-6.48μg/ml），其外科心血管治疗和术后治疗或长期治疗中肝素的剂量是完全不同的。然而，过量的肝素可能会诱导一系列的并发症，如出血和血小板减少。传统监测肝素浓度的方法有的是依赖于全血激活凝固时间（atc）与活化全血凝固时间（aptt）进行的，还有分光光度法和毛细管电泳法等，这些方法都存在一定的缺点，比如耗费时间长，成本高，平均周转时间长等。用于疾病相关生物标记物准确检测的简单低成本方法对于早期诊断和治疗具有重要意义。因此，寻找更加灵敏、准确、快速分析血清中的肝素含量对于调节心肺外科手术和术后治疗期间的临床应用中的正常病理过程非常必要。

肝素是已知带负电荷最高的天然生物分子，含有-oso3-、-nhso3-、-coo-等基团，而碳量子点表面含有的氨基基团。带负电荷的肝素和带正电荷的碳量子点在edc的活化下形成氢键，电子开始转移，很可能是其荧光增强原因。荧光探针由于其操作简单，灵敏度高和易于观察而在过去的几十年中得到了广泛的研究。已经建立了许多用于肝素检测的荧光传感器，包括小型阳离子分子传感器、超分子传感器、纳米传感器等。然而，大多数这些探针需要费力的多步有机合成，并且在水中的溶解性差。因此，寻求一种制备简单且水溶性好的检测肝素的传感器仍然具有实际重要性。

技术实现要素：

本发明克服了现有技术的不足，提出一种用于检测肝素的碳量子点荧光探针，该方法操作简单，灵敏度高。

为了达到上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

一种用于检测肝素的碳量子点荧光探针，通过如下步骤制备得到：

1）按照质量比为乙二醇：超纯水：葡萄糖：聚乙烯亚胺=10-15:10-15:0.3～0.8:0.05～0.15，分别准确称量乙二醇、超纯水、葡萄糖和聚乙烯亚胺；

2）将乙二醇、超纯水和葡萄糖混合，搅拌均匀后倒入反应釜中，密封反应釜；

3）将步骤2）所得到的混合物连同反应釜一起放入马弗炉内，在温度为150～200℃条件下，加热反应2～3小时；

4）将步骤3）所得到的溶液液冷却至室温，加入聚乙烯亚胺，50～100℃下加热2～4小时；

5）待步骤4）所得到的溶液冷却后，纯化透析20～30小时，得到目标碳量子点。

进一步的，所述乙二醇：超纯水：葡萄糖：聚乙烯亚胺的质量比为：12～13:12～13:0.4～0.6:0.08～0.12。

进一步的，步骤3）中马弗炉的加热温度为170～190℃，加热反应时间为2.5～3小时。

进一步的，步骤4）中的加热温度为70～90℃，加热时间为2.5～3.5小时。

进一步的，所述目标碳量子点，经过稀释100倍后得到的溶液的荧光强度在肝素浓度0-2.5u/ml范围内时具有指数关系。

配置不同浓度的肝素溶液，加入碳量子点，检测其荧光强度。带负电荷的肝素和带正电荷的碳量子点的分子间强大作用力发生聚集诱导发光，使荧光增强。本碳量子点最大激发波长345nm。

本发明还可以在步骤5）得到的溶液中，加入适量edc后震荡均匀，再在超声清洗机中进行活化，然后将碳量子点和肝素进行混合，带负电荷的肝素和带正电荷的碳量子点在1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）的活化下形成氢键，电子开始转移，分子间的强大作用力发生聚集诱导发光，从而使荧光增强。该方法获得了良好的效果，能有效测得肝素含量，且操作方便，灵敏度高。

本发明相对于现有技术所产生的有益效果为：

本发明提出的基于碳量子点的荧光探针，是一种灵敏度高且检测范围适宜的纳米荧光探针；其制备简单，水溶性好，粒径小，毒性低，生物相容性好，光学性能好且富含氨基。使得现代医学更加灵敏、准确、快速分析血清中的肝素含量在临床应用中的正常病理过程。

本发明方法制备的修饰后的碳量子点材料可用于血清中检测肝素含量，并且表现出极高的灵敏度和选择性。

附图说明

图1为本发明碳量子点荧光探针的tem图、红外光谱图以及紫外-可见吸收光谱图和荧光发射光谱图。

图2为本发明碳量子点荧光探针的稳定性研究图谱。

图3为本发明不同浓度碳量子点荧光探针用于肝素检测的荧光图谱以及荧光强度与肝素浓度的线性关系图。

图4为本发明碳量子点荧光探针对肝素的选择性实验图。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下面结合实施例及附图详细说明本发明的技术方案，但保护范围不被此限制。

实施例1

一种用于检测肝素的碳量子点荧光探针，通过如下步骤制备得到：

1）分别准确称量乙二醇、超纯水、葡萄糖和聚乙烯亚胺；

2）将12.5ml的乙二醇，12.5ml的超纯水和0.5g的葡萄糖混合，搅拌均匀倒入反应釜中，密封反应釜；

3）将步骤2）所得到的混合物连同反应釜一起放入马弗炉内，在温度为180℃条件下，加热反应2.75小时；

4）将步骤3）所得到的溶液液冷却至室温，加入1ml、10%聚乙烯亚胺，80℃下加热3小时；

5）待步骤4）所得到的溶液冷却后，纯化透析24小时，制得目标碳量子点，即修饰后的碳量子点荧光探针。

实施例2

一种用于检测肝素的碳量子点荧光探针，通过如下步骤制备得到：

1）按照质量比为乙二醇：超纯水：葡萄糖：聚乙烯亚胺=10:15:0.3:0.15，分别准确称量乙二醇、超纯水、葡萄糖和聚乙烯亚胺；

2）将乙二醇、超纯水和葡萄糖混合，搅拌均匀后倒入反应釜中，密封反应釜；

3）将步骤2）所得到的混合物连同反应釜一起放入马弗炉内，在温度为150℃条件下，加热反应3小时；

4）将步骤3）所得到的溶液液冷却至室温，加入聚乙烯亚胺，100℃下加热2小时；

5）待步骤4）所得到的溶液冷却后，纯化透析20小时，制得目标碳量子点，即修饰后的碳量子点荧光探针。

实施例3

一种用于检测肝素的碳量子点荧光探针，通过如下步骤制备得到：

1）按照质量比为乙二醇：超纯水：葡萄糖：聚乙烯亚胺=15:10:0.8:0.05，分别准确称量乙二醇、超纯水、葡萄糖和聚乙烯亚胺；

2）将乙二醇、超纯水和葡萄糖混合，搅拌均匀后倒入反应釜中，密封反应釜；

3）将步骤2）所得到的混合物连同反应釜一起放入马弗炉内，在温度为200℃条件下，加热反应2小时；

4）将步骤3）所得到的溶液液冷却至室温，加入聚乙烯亚胺，50℃下加热2小时；

5）待步骤4）所得到的溶液冷却后，纯化透析30小时。

实施例4

一种用于检测肝素的碳量子点荧光探针，通过如下步骤制备得到：

1）按照质量比为乙二醇：超纯水：葡萄糖：聚乙烯亚胺=12:12:0.4:0.08，分别准确称量乙二醇、超纯水、葡萄糖和聚乙烯亚胺；

2）将乙二醇、超纯水和葡萄糖混合，搅拌均匀后倒入反应釜中，密封反应釜；

3）将步骤2）所得到的混合物连同反应釜一起放入马弗炉内，在温度为170℃条件下，加热反应3小时；

4）将步骤3）所得到的溶液液冷却至室温，加入聚乙烯亚胺，70℃下加热3.5小时；

5）待步骤4）所得到的溶液冷却后，纯化透析25小时。

实施例5

一种用于检测肝素的碳量子点荧光探针，通过如下步骤制备得到：

1）按照质量比为乙二醇：超纯水：葡萄糖：聚乙烯亚胺=13:12:0.6:0.12，分别准确称量乙二醇、超纯水、葡萄糖和聚乙烯亚胺；

2）将乙二醇、超纯水和葡萄糖混合，搅拌均匀后倒入反应釜中，密封反应釜；

3）将步骤2）所得到的混合物连同反应釜一起放入马弗炉内，在温度为190℃条件下，加热反应2.5小时；

4）将步骤3）所得到的溶液液冷却至室温，加入聚乙烯亚胺，90℃下加热2.5小时；

5）待步骤4）所得到的溶液冷却后，纯化透析28小时。

对实施例1制得的修饰后的碳量子点荧光探针材料进行表征，如图1、2所示，图1中，（a）图表示碳量子点的tem图，（b）图表示碳量子点的粒径分布图，从图中可以看出碳量子点具有良好的分散性且呈球形，平均粒径为3.9nm，证明了该荧光探针粒径小；（c）图表示碳量子点的红外光谱图，根据图分析可得3287cm^-1处的宽带吸收峰为o-h和n-h键的伸缩振动，1651cm^-1处吸收峰n-h键的伸缩振动，1038cm^-1处的峰属于c-o-c键的伸缩振动，861cm^-1处的吸收峰为c-n键的伸缩振动，证明了制备的碳量子点表面富含氨基；（d）图表示碳量子点的紫外吸收光谱，从图中可以看出碳量子点在紫外区域表现出较宽的光吸收，在可见光区域则表现较弱的吸收尾，吸收峰出现在220nm和280nm附近，证明了碳量子点表面大量的表面态，对其发光性能有很大的作用；（e）图表示碳量子点在不同激发波长下的荧光光谱，从图中可以看出碳量子点荧光对于激发波长的依赖性，对激发波长以20nm为间隔进行调节，从335nm增加到515nm，碳量子点的荧光发射强度出现先增加后降低的现象，在415nm激发时荧光强度最大，证明了碳量子点荧光有不错的光学性能。

图2表示本发明碳量子点荧光探针材料的稳定性研究图谱，从图中可以看出ph在4-12范围内，碳量子点的荧光强度基本处于稳定状态，证明了碳量子点荧光在较宽的酸碱度范围具有很高的稳定性。

综合图1和2可知，本发明修饰后的碳量子点荧光探针材料粒径小，富含氨基且光学性能好。

实施例6

碳量子点对肝素的荧光响应性研究，具体包括如下步骤：

1）将修饰后的碳量子点荧光探针材料溶液稀释100或50倍后，待用；

2)用10ml的超纯水将0.01g的肝素进行充分溶解待用；

3）将步骤2）得到的肝素溶液加入至步骤1）得到的碳量子点溶液中后搅拌15min，使其混合均匀且充分反应。cds溶液中肝素的浓度为0、5、10、20、30、40、50、60、70、80µg/ml，用荧光分光光度计测出荧光强度；

4）统计出步骤3）中各个离心管中溶液的荧光强度，绘制出相应的拟合曲线。

图3中，（a）所示，是稀释了100倍的碳量子点作为荧光探针对肝素的荧光响应性。可以看出，肝素浓度0-12μg/ml（0-2.5u/ml）范围内时对碳量子点的荧光强度有着较为明显的增强作用，在10μg/ml开始，荧光强度不再明显增加趋于平缓。荧光比率（f/f0）为y轴，肝素浓度为x轴，通过指数拟拟合出一条曲线，r2=0.97932，回归方程如图3中（c）所示，这说明肝素含量与碳量子点荧光强度呈良好的指数关系。

图3中，（b）是稀释了50倍的碳量子点作为荧光探针对肝素的荧光响应性。可以看出，肝素对碳量子点的荧光强度有明显的增强作用。在0-80μg/ml（0-16u/ml）范围浓度，随着加入肝素浓度的增加，荧光强度呈线性增强，且增强效果比上一个探针要好。肝素的浓度和体系的荧光比率（f/f0）呈良好的线性关系。该检测体系的检测区间为肝素在0-80µg/ml，r2=0.98，回归方程如图3中（d）所示，以斜率为检测灵敏度。结果表明，修饰后的碳量子点在血清中可以在更大的浓度区间高灵敏度高选择性的检测肝素，并且相对于现有技术具有宽的检测范围和低的检测限，检测结果更清晰。

实施例7

碳量子点对肝素的选择性研究，具体包括以下步骤：

1）碳量子点溶液内加入40μg/ml的肝素和100倍浓度的其他干扰物，包括：ca²⁺、hso3^-、k⁺、fe³⁺、na⁺、mg²⁺、glucose、ha。

2）统计出步骤1）中各个溶液的荧光强度，绘制出相应的拟合曲线。

观察上述步骤得出的细胞荧光成像图，得出结论。

从图4可以看出加入肝素后cds的荧光增强了1.6倍左右，fe³⁺、na⁺对探针荧光的干扰相对较大，会对探针荧光有所增强。hso3^-、k⁺探针荧光的干扰也相对较大，但是会对探针荧光有所减弱，而mg²⁺和glucose对其荧光干扰很小，荧光强度基本没有变化。但总的来看，干扰物质均对特异性检测产生微弱的影响。说明该测定方法特异性良好，能够应用在人体中对肝素的测定领域。

实施例8

人体血液样品中对肝素的检测研究，具体包括以下步骤：

1）通过标准加入法向处理过的人血清样品中添加20、40和60u/ml的肝素标准品；

2）对步骤1）的各个溶液用荧光检测法进行分析，进行标准回收实验，计算回收率。

下表1为本发明碳量子点荧光探针用于血清中检测肝素的测定结果。

表1

从表中可以看出在人血清样品中进行标准回收实验，回收率保持在96%-99%范围内，三次测定的相对标准偏差均都低于3.7%，这表明了该方法的可靠性和实用性。从获得的结果可以得出结论，本探针是有效的，并且可能适合直接检测肝素的临床应用。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施方式仅限于此，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定专利保护范围。

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