一株降解纤维素生防芽孢杆菌及其应用和制剂的制作方法

2021-02-02 18:02:23|

492|

起点商标网

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及的是一株降解纤维素生防芽孢杆菌及其应用和制剂。

背景技术：

据报道我国的秸秆年产量位居世界第一。秸秆中含有丰富的有机质及氮、磷、钾、镁、钙和硫等农作物生长必需的营养元素,充分发挥和利用秸秆还田的积极效应,对促进农作物生长和养分资源的高效利用具有重要意义。目前大部分秸秆被露天焚烧或废弃,不仅浪费资源,还对环境造成严重污染。有研究表明,长期秸秆还田,能增加土壤有机质,改善土壤理化性状。并且可以减少农业生产造成的污染,实现秸秆资源化利用。众所周知我国是农业第一大国,而且每年生物质能源中秸秆资源占50％,但因为降解技术不发达、工业化难度较大、资源利用成本高,使秸秆综合利用率呈现下降趋势,所以还田玉米秸秆的腐解成为目前研究的热点。小麦成熟后,其秸秆中纤维素含量明显增高,可高达51.16％，经处理后在农业方面可用做肥料、饲料、生活燃料及食用菌基料等。经中国东北及内蒙古地区玉米秸秆还田的研究结果表明,因为冬季气温较低且持续时间长导致秸秆入土后腐解速度较为缓慢,这不仅会使播种质量受到影响,还会导致一些病虫的滋生,给农田生产带来诸多潜在危害。因此,不仅要实现玉米秸秆腐化,更要重视秸秆腐解效率的提高。通过微生物菌剂来降解秸秆,不仅能够让秸秆高效还田还是该问题的有效解决方法之一。

纤维素属于多糖类物质是植物细胞壁的主要成分。它的结构复杂，难以被降解。据有关文献显示，酸解、酶解和微生物降解是目前纤维素降解的主要方式，

然而无论是上述哪种降解方式都离不开高效纤维素降解菌株。因此，如果能充分利用微生物将其转化为生物能源或生产成生物产品，就可以缓解能源短缺、解决环境污染等一系列问题，同时，也可以带动一个新生产业。在自然界中存在着大量可以用来产纤维素酶的细菌和真菌，这也是纤维素的生物降解主要依赖于微生物的作用的原因。从20世纪40-50年代起，开展了大量关于产纤维素酶的微生物的分离筛选的工作，此外，还逐步建立起一套比较完整的分离筛选的方法。对于纤维素的降解，国内外研究者们进行了许多研究，其中微生物的降解是受关注的研究之一。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一株降解纤维素生防芽孢杆菌及其应用和制剂。

本发明的技术方案如下：

一株降解纤维素生防芽孢杆菌，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)的保藏编号为cgmccno：19895。

所述的芽孢杆菌的发酵液和/或代谢产物。

所述的芽孢杆菌、发酵液和/或代谢产物在降解纤维素中的应用，以及在拮抗平头炭疽菌、拮抗禾谷镰刀菌中的应用。

包含所述的芽孢杆菌、发酵液和/或代谢产物的制剂。

本发明筛选出的纤维素降解菌株具体较大的纤维素降解圈，进行了发酵产物纤维素酶活测定，能够高效降解纤维素；此外，进行了病原菌拮抗实验，主要针对的是国家经济作物小麦与玉米常见土传病害；旨在提供具有多功能的秸秆降解菌株，同时为土壤修复、生物防治与多功能微生物肥料的研制提供高效的潜力菌株。

实验证明，该菌株可高效、快速的降解秸秆中的纤维素，缩短秸秆腐解周期；该菌株生产成本低、周期短，具有良好的工业生产前景；该菌株能拮抗病原菌，制成菌剂后可使作物免受病原菌侵害。

附图说明

图1为纤维素降解菌筛选结果；

图2为纤维素降解能力初步测定；

图3为系统发育进化树；

图4为葡萄糖标准曲线；

图5为菌株拮抗平头炭疽病测试；

图6为菌株拮抗禾谷镰刀菌测试；

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1

纤维素降解菌的分离、筛选

1、土样来源

从陕西省杨陵区西北农林科技大学曹新庄实验农场的秸秆还田土壤中采取新鲜的土样，风干后，筛除土壤中的杂草，然后将称量的土放入组培瓶中，加入适量的水，进行为期一周的培养，直至土中的微生物恢复。待土壤中的微生物恢复后，分别加入小麦、玉米秸秆于组培瓶，温度28℃，进行为期50天的富集培养，分别在1、14、40天收集土样，分离纤维素降解菌。

2、培养基配方

(1)富集培养基：纤维素(秸秆)5g，蛋白胨5g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，蒸馏水1000ml。121℃灭菌2h。

(2)筛选鉴定培养基：羧甲基纤维素钠5g,酵母粉2g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.5g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。121℃灭菌2h。

3、土壤悬液的制备

称取2g土样置于100ml的三角瓶中，并加入50ml的富集培养基，充分打散混合液，置于120rpm摇床中，充分摇匀，培养3d后，取出1ml悬液，分别进行稀释，浓度分别为10²、10³、10⁴，每个梯度重复三次平行试验，分别涂布到筛选培养基中。

4、菌株分离纯化

经过涂布的培养基，置于28℃条件下培养1-2周。在培养期间，观察菌落的生长情况，挑取不同形态、颜色的菌落进行分离及纯化，从而获得纯培养物。挑取保留下的菌株，反复划线，进行纯化培养，并且对纯化后的菌株进行编号，最后保藏纯菌种。

5、筛选结果

通过对在筛选鉴定培养基上培养了2天的菌株平板倒入1mg/ml的刚果红染液染色30min，然后用1mol/ml的nacl溶液脱色30min。由于刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤维素的复合物便没法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。如图1所示，形成了以菌株为中心的透明圈，a图为平板正面，b图为背面照，平板背面能更清晰的看到纤维素降解透明圈。

为了跟清晰的知道该菌株的纤维素降解性能，在筛选鉴定培养基中心点接一次培养2天，采用上述同样的染色、脱色方法。测量菌落直径(d)与该菌落的透明圈直径(d)，如图2所示，透明圈直径d黑色横线为1.6cm，菌落直径d黄色纵线为0.6cm，透明圈直径d与菌落直径d的比值为2.67，属于分解纤维素分解较好的菌株。

实施例2

纤维素降解菌株鉴定

将该菌株于液体培养基140rpm摇床培养2天后，提取dna，进行16srdna测序，序列结果如下：

ctcagtaccctattcctgagatgattcttgaggagtccaccaaaaacttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcaaacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtaccgttcgaatagggcggtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgtttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgccctggggagtacggtcgaaagaatgaaacctaaaaggaattgacgggggcctgcacaacccgttggtgcatgaggtttatttcaagaaagtgaagaaccatttttttttttttttctttctaatatcctaaagaataggacgcccccttcccgccgaaagagaaagatgtggcatgcctacagccaatctctccaccagaagtctcgctaatcacacaacgttcgacaacctagtttcttcattgcaagatatatccctactcttcttc

在ncbi上进行blast比对，构建系统发育进化树。结果如图3所示，该菌株与bacillustequilensis的相似度为98％，属于芽孢杆菌属(bacillussp.)命名为bacillussp.ccnwx2。

将该菌株于2020年6月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmccno：19895。保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

实施例3

纤维素酶活的测定

1、葡萄糖标准曲线的绘制

在18支15ml管子中分别每3支管子(3个重复)加入1mg/ml标准葡萄糖溶液0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1ml，并用蒸馏水补至1.5ml，加入1.5mldns溶液，摇匀后置于沸水浴继续加热10min，取出立刻冷却，用蒸馏水准确补齐到15ml，摇匀，在540nm波长处测定其吸光度，以葡萄糖含量(mg/ml)为横坐标，对应的吸光度为纵坐标，绘制出葡萄糖标准曲线如图4。

2、纤维素酶活性的测定

粗酶液经12000r/min离心后，取上清0.5ml加入事先烘干至恒重的具塞比色管中，准确加入1ml的1％的羧甲基纤维素纳溶液，空白对照中加入煮沸灭活的粗酶液0.5ml，同时加入1ml的1％的羧甲基纤维素纳溶液，混匀盖塞，将其一同置入50℃水浴锅中，反应30min，取出，迅速准确的加入1.5ml配制好的dns溶液，摇匀，沸水浴中继续加热10min，取出立刻冷却至室温，加入12ml蒸馏水，摇匀，取200μl，加入酶标板的板条孔中，用酶标仪于540nm波长下测定各溶液的od值。实验组测定的od值为a1，对照组为a2，菌株od值△a＝a1-a2。

纤维素酶活力定义：以cmc-na为底物，在50℃，ph值6.3的条件下，以水解反应中每分钟催化cmc-na水解形成1μmol葡萄糖含量为一个单位，用“u”表示。

实验得出菌株的△a值为0.153，代入公式纤维素酶活力为93.98u/ml。

葡萄糖含量(mg/ml)：由葡萄糖标准曲线算出；

稀释倍数：5；

v：酶液体积0.5ml；

t：反应时间30min。

实施例4

菌株-病原菌拮抗性测定

采用琼脂平板对峙实验法，分别将菌株与病原菌按十字交叉法接种于同一平板上，28℃培养3-5天，观察菌株长势。实验选择了两种病原菌，平头炭疽菌(colletotrichumtruncatum)、禾谷镰刀菌(fusariumgraminearum)。

平头炭疽病菌在病斑上或潜伏在叶组织内越冬，由风雨、水滴滴溅传播，伤口有利于侵入。高温高湿、多雨、肥水不足植株长势差、运输途中管理不当等均有利于病害发生。发病初期叶上出现浅褐色病斑，扩展后呈近圆形、不规则形病斑，黄褐色，其上着生黑褐色小点粒。由平头炭疽菌侵染引起的大豆炭疽病是世界上大豆产区的重要病害之一,可造成大豆严重减产。因此,炭疽病的防治是大豆生产上的一个重要课题。

禾谷镰刀菌病是侵染麦粒或玉米后，生出白色絮状或绒状菌丝，后呈白色至玫瑰色、白色至粉红色或白色至砖红色。该菌能引起田间禾本科作物病害，如有性态引发小麦赤霉病，该菌在贮粮病害中，能使小麦、玉米等粮食作物发热霉变。

结果如下，图5左侧图是实验菌株，如图所示此菌株的生长不受病原菌的影响且具有较好的拮抗能力，限制病原菌的生长；右侧图病原菌长势较好且覆盖于待测菌株。对比实验表明，实验菌株相比较其他菌株具有拮抗平头炭疽病能力。图6左侧图是实验菌株，如图所示此菌株的生长完全不受禾谷镰刀菌的影响且具有较好的拮抗能力，限制病原菌的生长；右侧图病原菌长势较好且覆盖于待测菌株，非拮抗菌基本被掩埋。对比实验表明，实验菌株相比较其他菌株具有拮抗禾谷镰刀菌能力。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

序列表

<110>西北农林科技大学

<120>一株降解纤维素生防芽孢杆菌及其应用和制剂

<130>111

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1126

<212>dna

<213>bacillussp.ccnwx2

<400>1