一种克雷伯氏菌（Klebsiella.spp）菌株及工程菌和应用的制作方法

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种克雷伯氏菌（klebsiella.spp）菌株及其构建的工程菌和应用。

背景技术：

克雷伯氏菌（klebsiella.spp）属于肠杆菌科，克雷伯氏菌在自然界广泛分布，天然存在于土壤、水体、植物根际、动物粘膜等环境。克雷伯氏菌对环境中的生物化学和地球化学过程具有重要作用，是微生态群落中主要的成员。

克雷伯氏菌在农业中有广泛的应用。克雷伯氏菌是一类植物的根际共生菌，可以固氮促进植物的生长。同时还具有溶解土壤中磷的能力，对共生植物的生长具有明显的促进作用。克雷伯氏菌可以拮抗烟草黑胫病菌，防治烟草黑胫病。克雷伯氏菌可以作为生物杀虫剂，用于杀美国白蛾。

克雷伯氏菌在环境治理中有广泛的应用。克雷伯氏菌可以降解环境中污染的硫氰酸盐。克雷伯氏菌可以还原环境中六价铬离子，处理环境污染。菌体可以吸收水体中的二价镉，清除污染。克雷伯氏菌用于菌剂可以降解土壤中吡啶，污水中的苯酚。克雷伯氏菌可以对偶氮染料进行脱色，应用于印染废水及污染土壤的处理。克雷伯氏菌可生产生物絮凝剂，用于污水处理。

克雷伯氏菌的遗传资源有广泛的应用。雷伯氏菌可用于单宁酸酶、β-半乳糖苷酶生产。克雷伯氏菌的漆酶基因可以外源表达，获得的漆酶用于偶氮类和蒽醌类染料脱色。将克雷伯氏菌赖氨酸脱羧酶进行外源表达，获得赖氨酸脱羧酶多肽可用于戊二胺生产。

克雷伯氏菌在食品中的应用。克雷伯氏菌可以作为食品发酵用菌来改善食品的品质，该菌具有合成vb12的能力，在蓝纹奶酪制作中添加该菌株，增加了奶酪中vb12、叶酸和铁的含量。

克雷伯氏菌在化学品中的应用。克雷伯氏菌可作为生产用菌来生产2,3-丁二醇、乙偶姻、2-酮基葡萄糖酸、葡萄糖酸、木糖酸、2-酮基葡萄糖酸、2,3-二羟基异戊酸、异丁醇、1,3-丙二醇等化学品。具有生长快，原料转化率高等特点。

一般在细菌液体培养过程中，细菌细胞处于游离悬浮状态。通过在培养液中添加絮凝剂可以对细胞进行絮凝，从而实现细胞和培养液进行分离的目的。有一些微生物具有自絮凝特点，自絮凝是微生物在液体培养中细胞自发聚集形成聚集体。自絮凝特征的微生物容易实现与培养液的分离，从而降低产物分离提取成本。

技术实现要素：

本发明的目的是，提供一种克雷伯氏菌（klebsiella.spp）菌株及其构建的工程菌和应用。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

一种克雷伯氏菌（klebsiella.spp）菌株，该菌株命名为克雷伯氏菌sarik01，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2020年10月28日，保藏编号为cctccm2020648。

本发明还提供由克雷伯氏菌sarik01构建的工程菌，该工程菌通过以下至少其一的方式进行构建，

失活所述克雷伯氏菌sarik01的丁二醇脱氢酶构建工程菌；

失活所述克雷伯氏菌sarik01的葡萄糖酸脱氢酶构建工程菌；

失活所述克雷伯氏菌sarik01的乙酰乳酸脱羧酶构建工程菌；

同时失活所述克雷伯氏菌sarik01的乙酰乳酸脱羧酶和2,3-二羟基异戊酸脱水酶构建工程菌；

同时失活所述克雷伯氏菌sarik01的乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶构建工程菌；

失活所述克雷伯氏菌sarik01的乳酸脱氢酶构建工程菌；

失活所述克雷伯氏菌sarik01的乙醇脱氢酶构建工程菌；

同时失活所述克雷伯氏菌sarik01的乳酸脱氢酶和乙醇脱氢酶构建工程菌；

失活所述克雷伯氏菌sarik01的丙酮酸脱氢酶复合物构建工程菌；

失活所述克雷伯氏菌sarik01的丙酮酸脱羧酶构建工程菌；

同时失活所述克雷伯氏菌sarik01的丁二醇脱氢酶和丙酮酸脱氢酶复合物；

同时失活所述克雷伯氏菌sarik01的乙酰乳酸脱羧酶、乳酸脱氢酶和2,3-二羟基异戊酸脱水酶。

本发明还提供克雷伯氏菌sarik01以及由其构建的工程菌或利用其遗传资源构建的工程菌在生产1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、乙偶姻、2-酮基葡萄糖酸、葡萄糖酸、木糖酸、2-酮基异戊酸、异丁醇或2,3-二羟基异戊酸至少其一种化学品中的应用。

作为优选实施方案，通过液体发酵培养所述克雷伯氏菌sarik01或工程菌生产所述化学品。所述克雷伯氏菌sarik01或工程菌在液体培养中能够通过细胞聚集形成絮状物。

作为优选实施方案，通过液体发酵培养所述克雷伯氏菌sarik01或工程菌生产1,3-丙二醇，其中培养基以甘油为主要碳源。

作为优选实施方案，通过液体发酵培养所述克雷伯氏菌sarik01或工程菌生产2,3-丁二醇、乙偶姻或2-酮基葡萄糖酸，其中培养基以葡萄糖为主要碳源。

作为优选实施方案，通过液体发酵培养所述克雷伯氏菌sarik01或工程菌生产木糖酸，其中培养基以木糖为主要碳源。

作为优选实施方案，通过液体发酵培养所述工程菌生产2-酮基异戊酸和/或异丁醇；所述工程菌为失活克雷伯氏菌sarik01的乙酰乳酸脱羧酶，或者同时失活乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶。

作为优选实施方案，通过液体发酵培养所述工程菌生产葡萄糖酸，其中培养基以葡萄糖为主要碳源，所述工程菌为失活克雷伯氏菌sarik01的葡萄糖酸脱氢酶。

作为优选实施方案，通过液体发酵培养所述工程菌生产2,3-二羟基异戊酸，所述工程菌为同时失活克雷伯氏菌sarik01的乙酰乳酸脱羧酶、乳酸脱氢酶和2,3-二羟基异戊酸脱水酶。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

1，本发明的克雷伯氏菌sarik01是从土壤中筛选得到的，使用该菌株或由其构建的工程菌或由该菌的遗传资源构建的工程菌为生产菌株进行液体培养的过程中，一部分菌体能够形成聚集体，发酵液静置后聚集体快速沉降，同时菌株生长更快，抵抗不良环境能力增强，具有更高的产物浓度、产物生产强度和原料转化率。

2，克雷伯氏菌sarik01和以该菌为出发菌株构建的工程菌能够以更高的底物转化率或生产强度发酵生产1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、乙偶姻、2-酮基葡萄糖酸、葡萄糖酸、木糖酸、2-酮基异戊酸、异丁醇、2,3-二羟基异戊酸等化学品。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。

实施例1

克雷伯氏菌sarik01的获得。

取上海市海科路99号绿化带草阴地表土壤1g。

将土壤接入50ml液体lb培养基，37°c震荡培养过夜。

取培养物，用蒸馏水稀释10⁶-10⁷倍，涂布于固体lb培养基，37°c培养过夜。

选取固体培养基上长出的不同形状单菌落，分别接种到另外的固体培养基上，获得纯培养微生物。

获得纯培养的微生物中的一株菌，具有氨苄青霉素抗性，经过基因组测序，分类归为克雷伯氏菌，命名为克雷伯氏菌sarik01。菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctccm2020648。

实施例2

由克雷伯氏菌sarik01构建工程菌株

利用基因重组方法，对克雷伯氏菌sarik01染色体上编码特定酶的基因进行失活获得相应的工程菌株。对乳酸脱氢酶进行失活，获得k01δldha。对乙醇脱氢酶进行失活，获得k01δadhe。对乳酸脱氢酶和乙醇脱氢酶均进行失活，获得k01δldhaδadhe。对丙酮酸脱氢酶复合物进行失活，获得k01δaco。对丙酮酸脱羧酶进行失活，获得k01δpflb。对丁二醇脱氢酶进行失活，获得k01δbudc。对丁二醇脱氢酶和丙酮酸脱氢酶复合物均进行失活，获得k01δbudcδaco。对乙酰乳酸脱羧酶进行失活，获得k01δbuda。对乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶均进行失活，获得k01δbudaδldha。对乙酰乳酸脱羧酶、乳酸脱氢酶和2,3-二羟基异戊酸脱水酶均进行失活，获得k01δbudaδldhaδilvd。对葡萄糖酸脱氢酶进行失活，获得k01δgad。以上具体构建方法为本领域常规技术手段，不再详述。

实施例3

利用克雷伯氏菌sarik01和其工程菌生产1,3-丙二醇

将克雷伯氏菌sarik01、对照菌株克雷伯氏肺炎杆菌tuac01（保藏编号为cgmcc1.6366）、k01δldha、k01δadhe、k01δldhaδadhe、k01δaco、k01δpflb分别接种于250ml锥形瓶，其中装有50ml以甘油为主要碳源的培养基中，120转，37°c进行培养。

培养基组成为：(nh4)2so44g/l，k2hpo43h2o0.69g/l，kh2po40.25g/l，mgso40.2g/l，caco35g/l，酵母提取物1.5g/l，甘油30g/l，微量元素1ml/l，1l微量元素含有：mnso44h2o100mg，zncl270mg，na2moo42h2o35mg，h3bo360mg，cocl26h2o200mg，cuso45h2o29.28mg，nicl26h2o25mg，37%hcl0.9ml。

培养过程中观测，cgmcc1.6366培养液中未见絮状聚集体，而sarik01和k01δldha、k01δadhe、k01δldhaδadhe、k01δaco、k01δpflb培养液中均出现大量絮状聚集体。培养一天后，将各菌株30ml发酵液分别倒入量筒静置，2分钟后sarik01和k01δldha、k01δadhe、k01δldhaδadhe、k01δaco、k01δpflb发酵液中的大部分菌体连同未消耗的caco3沉降到15ml体积。cgmcc1.6366样品大部分菌体连同未消耗的caco3无明显沉降。10分钟后sarik01和k01δldha、k01δadhe、k01δldhaδadhe、k01δaco、k01δpflb发酵液中的大部分菌体连同未消耗的caco3沉降到5ml体积。cgmcc1.6366样品大部分菌体连同未消耗的caco3无明显沉降。静置1个小时后，sarik01、k01δldha、k01δadhe、k01δldhaδadhe、k01δaco、k01δpflb发酵液的大部分菌体连同未消耗的caco3沉降到3ml体积。cgmcc1.6366发酵液大部分菌体连同未消耗的caco3沉降至10ml体积。继续延长放置时间，各菌株的菌体连同未消耗的caco3沉降层体积不再发生明显变化。表明sarik01和以sarik01为出发菌株改造的工程菌株发酵液中菌体容易沉降，并且菌体沉降层更紧密。

将发酵液样品进行液相色谱分析，利用hpx-87h色谱柱对发酵液组分进行分离，利用视差检测器检测。流动相为0.05mol/l的稀硫酸溶液，流速0.8ml/min。分析结果如表1所示。

表1

由表1可以看出，sarik01利用甘油为主要碳源合成1,3-丙二醇的能力相对于cgmcc1.6366更强，其原料转化率高、产物浓度高、副产物总体合成量较低。失活乳酸脱氢酶、失活乙醇脱氢酶，同时乳酸脱氢酶和乙醇脱氢酶，或失活丙酮酸脱羧酶后，菌株合成1,3-丙二醇能力进一步提高。失活丙酮酸脱氢酶复合物的菌株k01δaco合成1,3-丙二醇转化率降低，但是12小时培养检测，菌株合成1,3-丙二醇速率提高。

将k01δldhaδadhe和对照菌株cgmcc1.6366构建的cgmcc1.6366δldhaδadhe菌株利用lb培养基摇瓶培养种子。培养过夜的50ml种子培养液分别转入5l发酵罐，其中装有3l发酵培养基，进行发酵培养。待发酵液中甘油消耗后，流加甘油进入发酵液。cgmcc1.6366δldhaδadhe发酵72小时结束，最终1,3-丙二醇浓度为75g/l，原料甘油转化率为0.40g/g，培养过程中，目视菌体未形成聚集体，利用光学显微镜直接观察培养液无吸光物质；发酵液放置20分钟目视无明显分层现象。k01δldhaδadhe发酵48小时结束，最终1,3-丙二醇浓度为110g/l，原料甘油转化率为0.48g/g，培养过程中，目视菌体形成聚集体，利用光学显微镜直接观测到培养液中有大量直径为0.05-0.3mm不规整球状物质，发酵液静置后，菌体很快沉降，静置20分钟后，罐底形成2cm厚的菌体层。

因此，k01δldhaδadhe用于合成1,3-丙二醇具有更高的原料转化率和产物浓度，发酵液中的细胞沉降快。

实施例4

利用sarik01和其工程菌生产2,3-丁二醇

将cgmcc1.6366、sarik01、k01δldhaδadhe菌株分别接种于250ml锥形瓶，其中装有50ml以葡萄糖为主要碳源的培养基中，200转，37°c进行培养。

培养基组成为：葡萄糖50g/l，玉米浆4g/l，(nh4)2so45g/l，乙酸钠3g/l。

培养过程中观测，sarik01和k01δldhaδadhe培养液中出现大量絮状聚集体，而cgmcc1.6366培养液中未见絮状聚集体。培养一天后，将50ml发酵液倒入量筒静置，2分钟后sarik01和k01δldhaδadhe样品的大部分菌体连同未消耗的caco3沉降到15ml体积。cgmcc1.6366样品大部分菌体连同未消耗的caco3沉降至25ml体积。5分钟后sarik01和k01δldhaδadhe样品的大部分菌体连同未消耗的caco3沉降到5ml体积。cgmcc1.6366样品大部分菌体连同未消耗的caco3沉降至10ml体积。继续延长放置时间，各菌株的菌体连同未消耗的caco3沉降层体积不再发生明显变化。表明sarik01和工程菌株发酵液中菌体容易沉降。

培养过程中12小时和24小时取样将发酵样品进行液相色谱分析，采用与实施例3分析方法相同。分析结果如表2所示。

表2

由表2可以看出，sarik01和k01δldhaδadhe利用葡萄糖为主要碳源合成2,3-丁二醇和乙偶姻的前12小时速率较快，但是最终转化率相对于cgmcc1.6366较低。

实施例5

利用sarik01和其工程菌生产乙偶姻

以cgmcc1.6366为出发菌株，失活丁二醇脱氢酶构建工程菌cgmcc1.6366δbudc；失活丁二醇脱氢酶和丙酮酸脱氢酶复合物构建工程菌cgmcc1.6366δbudcδaco。将k01δbudc，k01δbudcδaco与cgmcc1.6366δbudc、cgmcc1.6366δbudcδaco分别接种于250ml锥形瓶，其中装有50mllb培养基中，200转，37°c进行培养过夜，将种子培养液转入5l发酵罐，其中装有3l发酵培养基，进行高好氧发酵培养。

发酵培养基组成为：葡萄糖100g/l，酵母提取物2g/l，玉米浆4g/l，(nh4)2so45g/l，乙酸钠3g/lkcl,0.4g/l，mgso4，0.1g/l。

培养过程中观测，k01δbudc和k01δbudcδaco培养液中出现大量絮状聚集体，而cgmcc1.6366δbudc和cgmcc1.6366δbudcδaco培养液中未见絮状聚集体。k01δbudc和k01δbudcδaco在14小时都生成28g/l乙偶姻。cgmcc1.6366δbudc和cgmcc1.6366δaco在16小时生成28g/l乙偶姻。

k01δbudc和k01δbudcδaco相对于cgmcc1.6366δbudc和cgmcc1.6366δaco利用葡萄糖为主要碳源合成乙偶姻的速率更快。

实施例6

利用sarik01生产2-酮基葡萄糖酸

将sarik01和对照菌株克雷伯氏肺炎杆菌tuac01（cgmcc1.6366）分别接种于250ml锥形瓶，其中装有50mllb培养基中，200转，37°c进行培养过夜，将种子培养液转入5l发酵罐，其中装有3l发酵培养基，进行高好氧发酵培养。

发酵培养基组成为：葡萄糖150g/l，玉米浆4g/l，mgso45g/l，乙酸钠3g/l。

第一阶段控制发酵过程ph处于中性，培养过程中观测，sarik01培养液中出现大量絮状聚集体，而cgmcc1.6366培养液中未见絮状聚集体。培养3小时后进入第二阶段，将发酵ph调控到5。sarik01在24小时将葡萄糖全部转化成2-酮基葡萄糖酸，cgmcc1.6366在28小时将葡萄糖全部转化成2-酮基葡萄糖酸。

sarik01相对于cgmcc1.6366利用葡萄糖为主要碳源合成2-酮基葡萄糖酸的速率更快。

实施例7

利用sarik01工程菌株生产葡萄糖酸

以cgmcc1.6366为出发菌株，失活葡萄糖酸脱氢酶构建工程菌cgmcc1.6366δgad。将k01δgad与cgmcc1.6366δgad分别接种于250ml锥形瓶，其中装有50mllb培养基中，200转，37°c进行培养过夜，将种子培养液转入5l发酵罐，其中装有3l发酵培养基，进行高好氧发酵培养。

发酵培养基组成为：葡萄糖90g/l，玉米浆4g/l，mgso45g/l，乙酸钠3g/l。

第一阶段控制发酵过程ph处于中性，培养过程中观测，k01δgad培养液中出现大量絮状聚集体，而cgmcc1.6366δgad培养液中未见絮状聚集体。培养3小时后进入第二阶段，将发酵ph调控到5。k01δgad在10小时将葡萄糖全部转化成葡萄糖酸，cgmcc1.6366δgad在12小时将葡萄糖全部转化成葡萄糖酸。在葡萄糖消耗后，补加葡萄糖，进行补料发酵，k01δgad菌株最终合成450g/l葡萄糖酸，cgmcc1.6366δgad最终合成420g/l葡萄糖酸。

k01δgad相对于cgmcc1.6366δgad利用葡萄糖为主要碳源合成葡萄糖酸的速率更快，最终葡萄糖酸浓度更高。

实施例8

利用sarik01生产木糖酸

将sarik01和对照菌株克雷伯氏肺炎杆菌tuac01（cgmcc1.6366）分别接种于250ml锥形瓶，其中装有50mllb培养基中，200转，37°c进行培养过夜，将种子培养液转入5l发酵罐，其中装有3l发酵培养基，进行高好氧发酵培养。

发酵培养基组成为：木糖30g/l，玉米浆4g/l，mgso45g/l，乙酸钠3g/l。

第一阶段控制发酵过程ph处于中性，培养过程中观测，sarik01培养液中出现大量絮状聚集体，而cgmcc1.6366培养液中未见絮状聚集体。培养4小时后进入第二阶段，将发酵ph调控到5。sarik01在8小时将木糖全部转化成木糖酸，cgmcc1.6366在9小时将木糖全部转化成木糖。

sarik01相对于cgmcc1.6366利用木糖为主要碳源合成木糖酸的速率更快。

实施例9

利用sarik01工程菌株生产2-酮基异戊酸和异丁醇

以cgmcc1.6366为出发菌株，失活乙酰乳酸脱羧酶构建工程菌cgmcc1.6366δbuda，失活乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶构建工程菌cgmcc1.6366δbudaδldha。将k01δbuda、k01δbudaδldha与cgmcc1.6366δbuda、cgmcc1.6366δbudaδldha分别接种于250ml锥形瓶，其中装有50mllb培养基中，200转，37°c进行培养过夜，将种子培养液转入5l发酵罐，其中装有3l发酵培养基，进行发酵培养。

发酵培养基组成为：葡萄糖100g/l，酵母提取物5g/l，玉米浆4g/l，(nh4)2so45g/l，乙酸钠3g/lkcl,0.4g/l，mgso4，0.1g/l。

培养过程中观测，k01δbuda和k01δbudaδldha培养液中出现大量絮状聚集体，而cgmcc1.6366δbuda和cgmcc1.6366δbudaδldha培养液中未见絮状聚集体。发酵培养24小时，液相色谱检测发酵液中组分，见表3。

表3

k01δbuda和k01δbudaδldha相对于cgmcc1.6366δbuda和cgmcc1.6366δbudaδldha合成2-酮基异戊酸和异丁醇的底物转化率较低。

实施例10

利用sarik01工程菌株生产2,3-二羟基异戊酸

以cgmcc1.6366为出发菌株，失活乙酰乳酸脱羧酶、乳酸脱氢酶和2,3-二羟基异戊酸脱水酶构建工程菌cgmcc1.6366δbudaδldhaδilvd。将k01δbudaδldhaδilvd与cgmcc1.6366δbudaδldhaδilvd分别接种于250ml锥形瓶，其中装有50ml发酵培养基中，200转，37°c进行发酵培养。

发酵培养基组成为：葡萄糖25g/l，酵母提取物5g/l，玉米浆4g/l，(nh4)2so45g/l，乙酸钠3g/l，kcl0.4g/l，mgso40.1g/l，feso40.02g/l。

培养过程中观测，k01δbudaδldhaδilvd培养液中出现大量絮状聚集体，而cgmcc1.6366δbudaδldhaδilvd培养液中未见絮状聚集体。k01δbudaδldhaδilvd在24小时生成3.8g/l2,3-二羟基异戊酸。cgmcc1.6366δbudaδldhaδilvd在24小时生成3.3g/l2,3-二羟基异戊酸。

k01δbudaδldhaδilvd于合成2,3-二羟基异戊酸的底物转化率较高。

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

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