一种海洋纤维化纤维菌THN-1及其产右旋糖酐酶的方法与流程

2021-02-02 18:02:09|

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本发明涉及一种微生物，尤其涉及一种海洋纤维化纤维菌thn-1及其产右旋糖酐酶的方法。

背景技术：

右旋糖酐酶主要来源来自于微生物，并且由于微生物产右旋糖酐酶过程中，水解高分子右旋糖酐具有环境友好、耗低的特点，因此工业上大多采用微生物进行生产右旋糖酐酶，生产获取的低分子量的右旋糖酐，被广泛应用于医学、食品、化工等领域，具有极高的经济价值，不同于陆地温和的环境，特殊的海洋环境使得海洋微生物所产的酶通常具有耐盐、耐碱等特性，更适用于工业生产的实际需求，因此海洋菌所产右旋糖酐酶的研究具有极其重要的意义；本发明公开了一种海洋纤维化纤维菌thn-1，该菌株分离自中国江苏连云港田湾核电站附近海泥中纤维化纤维菌(cellulosimicrobiumcellulans)thn-1，该菌株于2020年8月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2020430，建议的分类命名为cellulosimicrobiumcellulansthn-1，保藏地址为中国武汉大学。

技术实现要素：

本发明公开了一种海洋纤维化纤维菌thn-1，该菌株为革兰氏阴性菌，其形状为黄色不透明菌落，适宜生长温度为25-45℃，适宜ph生长为6.0-10.0，适宜nacl浓度范围为0-6％，纤维化纤维菌thn-1于2020年8月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2020430，建议的分类命名为cellulosimicrobiumcellulansthn-1，保藏地址为中国武汉大学。

一种海洋纤维化纤维菌thn-1的制备方法，包括如下步骤：

(1)取海泥放入2216e培养基中，于28℃、180r/min培养2-5d；

(2)选取步骤(1)中培养液稀释并涂布初筛培养基中，于20℃条件下培养3-4d；

(3)待步骤(2)中长出菌落，加入95％乙醇，于-20℃条件下冷冻3-4h，观察是否出现透明圈；

(4)挑取步骤(3)中有透明圈的单菌落至产酶培养基中，于20℃，180r/min条件下培养2d，以1000r/min离心15min，取上清液测定酶活力大小并选出透明圈较大和酶活力较高的菌株，即为纤维菌thn-1。

进一步的，所述2216e培养基由0.1％酵母粉、0.5％胰蛋白胨、1.5％琼脂，以陈海水配置，其ph为8.0。

进一步的，所述产酶培养基由1.5％胰蛋白胨、08％麸皮、0.5％右旋糖酐t20，以陈海水配置，其ph为7.5。

进一步的，所述初筛培养基由0.1％酵母粉、0.5％胰蛋白胨、0.2％的蓝色葡聚糖2000、1％的右旋糖酐t20、1.5％琼脂，以陈海水配置，其ph为8.0。

一种海洋纤维化纤维菌thn-1的应用，海洋纤维化纤维菌thn-1用于产右旋糖苷酶，具体包括如下步骤：

(1)将纤维化纤维菌thn-1按照装液量20％接种至2216e培养基中，以在30℃、180r/min条件下培养24h获取种子液；

(2)并将步骤(1)中种子液按照接种量为2.5％、装液量20％接种至产酶培养基中，于30℃、180r/min条件下培养24h；

(3)将步骤(2)中培养液在8000rpm条件下离心30min，所得上清液即为粗酶液，并以4℃保存备用。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：

本发明提供了一种新的从海洋环境筛选产右旋糖酐酶的菌(cellulosimicrobiumcellulans)thn-1，并基于该菌株进行产右旋糖苷酶，有效的拓宽了右旋糖酐酶的来源，为研究改造和工业应用提供重要基础，利于工业规模化推广，大大提高了经济价值和社会价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例技术描述中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为菌株thn-1扫描电镜照片形态图；

图2为菌株thn-1在初筛平板上形成的透明圈图；

图3为温度对菌株thn-1生长的影响图；

图4为nacl浓度对菌株thn-1生长的影响图；

图5为ph对菌株thn-1生长的影响图；

图6为初始培养基ph对菌株thn-1产酶的影响图；

图7为温度对菌株thn-1产酶的影响图；

图8为碳源对菌株thn-1产酶的影响图；

图9为氮源对菌株thn-1产酶的影响图；

图10为诱导剂浓度对菌株thn-1产酶的影响图；

图11为nacl浓度对菌株thn-1产酶的影响图；

图12为温度对菌株thn-1所产右旋糖酐酶的影响图；

图13为菌株thn-1所产右旋糖酐酶的热稳定性图；

图14为ph对菌株thn-1所产有右旋糖酐酶的影响图；

图15为菌株thn-1所产右旋糖酐酶的ph稳定性图；

图16为菌株thn-1所产右旋糖酐酶的底物特异性图；

图17为菌株thn-1所产右旋糖酐酶的水解产物图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

为了达到本发明的目的，如图1-17所示，一种海洋纤维化纤维菌thn-1，该菌株为革兰氏阴性菌，其形状为黄色不透明菌落，适宜生长温度为25-45℃，适宜ph生长为6.0-10.0，适宜nacl浓度范围为0-6％，纤维化纤维菌thn-1于2020年8月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2020430，建议的分类命名为cellulosimicrobiumcellulansthn-1，保藏地址为中国武汉大学。

一种海洋纤维化纤维菌thn-1的制备方法，包括如下步骤：

(1)取海泥放入2216e培养基中，于28℃、180r/min培养2-5d；

(2)选取步骤(1)中培养液稀释并涂布初筛培养基中，于20℃条件下培养3-4d；

(3)待步骤(2)中长出菌落，加入95％乙醇，于-20℃条件下冷冻3-4h，观察是否出现透明圈；

进一步的，所述2216e培养基由0.1％酵母粉、0.5％胰蛋白胨、1.5％琼脂，以陈海水配置，其ph为8.0。

进一步的，所述产酶培养基由1.5％胰蛋白胨、08％麸皮、0.5％右旋糖酐t20，以陈海水配置，其ph为7.5。

进一步的，所述初筛培养基由0.1％酵母粉、0.5％胰蛋白胨、0.2％的蓝色葡聚糖2000、1％的右旋糖酐t20、1.5％琼脂，以陈海水配置，其ph为8.0。

一种海洋纤维化纤维菌thn-1的应用，海洋纤维化纤维菌thn-1用于产右旋糖苷酶，具体包括如下步骤：

(1)将纤维化纤维菌thn-1按照装液量20％接种至2216e培养基中，以在30℃、180r/min条件下培养24h获取种子液；

(2)并将步骤(1)中种子液按照接种量为2.5％、装液量20％接种至产酶培养基中，于30℃、180r/min条件下培养24h；

(3)将步骤(2)中培养液在8000rpm条件下离心30min，所得上清液即为粗酶液，并以4℃保存备用。

实施例一：

一种来自海洋的纤维化纤维菌thn-1，于2020年8月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2020430，建议的分类命名为cellulosimicrobiumcellulansthn-1，保藏地址为中国武汉大学。

一、菌株thn-1的筛选方法：

(1)培养基的制备：

2216e培养基：0.1％酵母粉，0.5％胰蛋白胨，1.5％琼脂，以陈海水配置，其ph为8.0；

初筛培养基：0.1％酵母粉，0.5％胰蛋白胨，0.2％的蓝色葡聚糖2000，1％的右旋糖酐t20，1.5％琼脂，以陈海水配置，其ph为8.0；

种子培养基：0.1％酵母粉，0.5％胰蛋白胨，以陈海水配置，其ph为7.0；

lb培养基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉，超纯水配置，为ph为7.0；

产酶培养基：1.5％胰蛋白胨，08％麸皮，0.5％右旋糖酐t20，陈海水配置，为ph为7.5。

(2)菌株的筛选方法：

自中国江苏连云港田湾核电站附近取海泥1g，放入50ml2216e培养基中，于20℃，180r/min条件下培养2-5d；选取合适的培养液稀释液涂布初筛培养基，于20℃条件下培养3-4d，待菌落长出后加入95％乙醇，并于-20℃冷冻3-4h，观察菌落周围是否出现透明圈；挑取有透明圈的单菌落菌株接入产酶培养基，在20℃、180r/min条件下培养2d，培养结束后以1000r/min离心15min取上清液测定酶活力大小，选出透明圈较大和酶活力较高的菌株，即为海洋的纤维化纤维菌thn-1。

该菌株为革兰氏阴性菌，黄色不透明菌落，如图1所示；该菌株在2216e固体培养基中培养48h后，菌落呈黄色，在含有蓝色葡聚糖的培养基上能够产生透明圈，如图2所示；该菌株能利用葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖，其生理化结果如表1所示：

表1菌株thn-1的生理生化特征

表1中，+：阳性；－：阴性。

二、菌株thn-1分子生物学鉴定：

用细菌基因组提取试剂盒提取菌株thn-1的基因组，选用扩增原核微生物16srdna序列的通用引物：27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’

1492r：5’-ggttaccttgttacgactt-3’)

进行聚合酶链式反应，其反应体系50μl：ddwater39.5μl，pcrbuffer5μl，mg2⁺1μl，上下游引物各1μl，dntp1μl，模板dna1μl，taqplusploymerase0.5μl，反应条件：94℃变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min15s，30个循环，72℃5min；将pcr产物琼脂糖电泳纯化回收并构建克隆载体，挑选阳性克隆子送往上海生工测序，将测得的序列反向互补拼接后，获得1382bp的碱基片段；将所得序列提交至genbank数据库，通过16srdna序列同源性比对，可以初步确定该菌株为纤维属(cellulosimicrobium)，将亲缘关系较近的菌株运用mega软件进行多重比较，用中邻接法(neibor-joingmethod)建系统进化树，从进化树表明菌株thn-1与cellulosimicrobium关系最近。

三、菌株thn-1的生长特性：

将菌株thn-1从-80℃接种到2216e固体培养基中，于30℃培养箱培养2d，将培养基上单菌落接种到2216e培养基中，其装液量为20％，于30℃、180r/min条件下培养24h，获取种子液；待用：

(1)温度对菌株thn-1生长的影响：

将种子液以2％的接种量接种到lb培养基，ph7.0，转速180r/min，装液量20％，分别在不同温度下培养6h，在600nm波长下测定od值，该菌株低于15℃不能生长，生长温度范围为25-45℃，最适生长温度为40℃，如图3所示。

(2)nacl浓度对菌株thn-1的生长的影响：

将种子液以2％的接种量接种至装有不同含量nacl的未加nacl的lb培养基中，装液量20％，在30℃培养10h，在600nm波长下测定od值，菌株thn-1生长的nacl浓度范围为0-6％，最适生长nacl浓度为1.5％，如图4所示。

(3)ph对菌株thn-1生长的影响：

将种子液以2％的接种量接种至ph为5.0-10.0的lb培养基中，为了防止培养过程中ph的变化，加入终浓度为10mmol/l的缓冲液：ph5.0-6.0(mes缓冲液)，ph7.0(pipes缓冲液)，ph7.5-8.0(hepes缓冲液)，ph9.0-10.0直接用naoh调；培养条件为装液量20％，在30℃培养10h，在600nm波长下测定od值，该菌株生长的ph范围为6.0-10.0，最适生长ph为8.0，如图5所示。

(4)碳氮源对菌株thn-1的影响：

以0.1％的碳源(玉米粉、糊精、麦芽糖、大麦粉、乳糖、马铃薯淀粉、蔗糖、麸皮、葡萄糖)和0.5％氮源(酵母粉、鱼粉蛋白胨、胰蛋白胨、花生粕、干酪素、氯化铵、尿素、硝酸钠、豆粕、硫酸铵)用于替换培养基中的酵母粉和胰蛋白胨，在30℃培养10h，在600nm波长下测定od值，其结果显示麸皮，胰蛋白胨有利于菌株thn-1的生长，如图8-10所示。

实施例二：

一、纤维菌thn-1产右旋糖酐酶的应用：

将纤维菌thn-1从-80℃甘油保存的菌种中接到2216e培养基中，装液量20％，在30℃、180r/min下培养24h得到种子液；接种量为2.5％，装液量20％，在30℃、180r/min下培养24h,然后8000rpm离心30min，所得上清液即为粗酶液，4℃保存备用。

右旋糖酐酶酶活测定：右旋糖酐酶酶活测定方法：将150微升右旋糖酐t70底物加入装有50微升酶液的小试管中，40℃水浴30min后，加入200微升dns，沸水浴5min后，将试管取出放入冷水中迅速冷却，加入3ml去离子水后震荡摇匀，取100微升与96孔酶标版上与540nm下测定吸光值。

(1)温度对菌株thn-1所产右旋糖酐酶活性的影响：

分别在不同温度下测定菌株thn-1所产右旋糖酐酶活力，计算相对酶活力，该菌株所产的右旋糖酐酶在30-45℃下有较高的催化活力，最适作用温度为40℃，如图12所示。

(2)菌株thn-1所产右旋糖酐酶的热稳定性：

将粗酶液分别置于不同温度:30℃、40℃、50℃水浴锅中保温1-5h，每隔1h取出样品，并进行酶活测定，以未处理酶液作对照，计算相对酶活。该酶的稳定性较好，于30℃的5h仍能保持90％以上的酶活力，如图13所示。

(3)ph对菌株thn-1所产右旋糖酐酶的影响：

将酶液与不同ph相同浓度的右旋糖酐t70溶液在40℃下进行酶活测定，不同ph缓冲液为：50mm乙酸乙酸钠缓冲液，50mm磷酸缓冲液，50mmtris-hcl缓冲液，最适作用ph为tris-hcl缓冲液所调的7.5，如图14所示。

(4)菌株thn-1所产右旋糖酐酶的酸碱稳定性：

将酶液与各种不同ph缓冲液混合后放入4℃冰箱过夜，测过夜后酶液酶活，计算相对酶活力，在ph5.5-9.0范围内有较好的稳定性，如图15所示。

(5)菌株thn-1所产右旋糖酐酶的底物特异性：

将酶液与不同分子量的右旋糖酐：右旋糖酐t20、右旋糖酐t40、右旋糖酐t70、右旋糖酐t500、右旋糖酐t2000，以及不同种多糖：普鲁兰、可溶性淀粉、壳聚糖，制成的底物进行反应，以酶活最高的作为100％，计算相对酶活力，结果如图16所示。

(6)金属离子对菌株thn-1所产右旋糖酐酶的影响：

将底物与不同金属离子混合，并使得金属离子的终浓度分别为1mm、5mm以及10mm，用酶液与混合后的底物反应，测得酶活，以未加金属离子所测得的酶活力为100％，计算相对酶活力，在不同浓度下各种金属离子对该酶的影响见下表2：

表2金属离子对菌株thn-1所产右旋糖酐酶的影响

(7)菌株thn-1所产右旋糖酐酶水解产物分析：

将酶液与纯水配的含3％右旋糖酐t70的底物在30℃条件下酶解，分别水解1h，6h，12h，24h，48h以及72h，对产物进行薄层层析分析，对照标品发现，随着时间的增长，水解产物为聚合度大于等于4的异麦芽寡糖，其中异麦芽四糖含量最高，这表明有菌株thn-1所产的右旋糖酐酶是内切型右旋糖酐酶，如图17所示，其中标品g1-g5，g7：葡萄糖，麦芽糖，麦芽三糖，麦芽四糖，麦芽五糖，麦芽七糖。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

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