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您当前的位置： 一种三黄肉雏鸡肠道益生菌群的定植培养方法及其应用与流程
2021-02-02 18:02:45|
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起点商标网 本发明属于微生物菌群的培养方法领域，尤其涉及一种三黄肉雏鸡肠道益生菌群的定植培养方法及其应用。
背景技术：
：微生态制剂(microbialecologicalagent)是在微生态平衡理论、微生态防治理论和微生态营养理论等的指导下，选用动物体内的有益微生物及其特殊营养物质经培养、发酵、干燥等特殊加工工艺而制成的生物制剂或者活菌剂，它们能够在数量或种类上补充肠道内缺乏或减少的正常微生物，维持或调整肠道内微生态环境的平衡。具有防治疾病、保健的功能，且无毒、无残留副作用，近年来倍受人们亲睐。菌种的选择是影响微生态制剂作用效果的关键因素，在选择菌种时应遵循如下原则：第一，菌株属于动物正常菌群，能确保益生菌能顺利进入肠道定植并能快速的生长繁殖，更好的发挥其益生功能。第二，菌株的益生作用良好，能耐受胃中低ph值和胆汁而且能够在快速定植于肠粘膜。第三，菌株安全，没有毒副作用。第四，存储稳定性好，易于生产和保持其活力状态。三黄肉雏鸡指0-50d刚孵出的鸡。雏鸡的消化功能非常弱，需要制作质地较软的饲料，刚出壳的雏鸡体内有足够的卵黄，3-5天内可供给雏鸡部分营养物质。雏鸡开食多在孵出后12-24h，这段时间开食的死亡率最低，但同时这阶段雏鸡肠道中会引入大量微生物，这也是雏鸡成活率最大影响因素。现在家禽集约化养殖从饲料到养殖设备均是配套的，微生物活菌只有两种使用方式可以介入，一种是固体粉剂可以与鸡饲料一起混合使用，第二种是液体菌剂通过添加至饮水水线使用，前者并无特殊要求，而后者要求菌液分散性好，不能堵塞水线。由于家禽的肠道较短，固体菌粉处于休眠状态，直接饲喂其往往是进入肠道还未活化很快就被排出体外，这限制了其作用效果的发挥。而液体菌剂由于培养阶段菌种始终处于高活性状态，并且其培养时能够产生大量活性代谢产物(酶，有机酸，活性小肽，氨基酸，抗菌素等)，而这些优点使得其能够进入肠道后无需活化并且代谢产物不受胃酸，胆盐等影响能够作用速度更快，效果更显著。因此，多种非拮抗性微生物菌剂进行复配，与单菌株相比可以更进一步的提高动物对于饲料的利用水平，利用率，从而降低料肉/蛋比。然而在实际的应用过程中，不同的菌种复合，如何能够有效控制每个菌株的活菌数和代谢产物稳定，是目前微生物菌剂研制过程和应用中的难题。技术实现要素：针对三黄肉雏鸡脱温饲养过程中抗生素滥用，雏鸡无抗养殖死亡率高，以及复合微生物菌剂活菌数和代谢产物种类和产量的稳定性等技术问题。本发明旨在提供一种三黄肉雏鸡肠道益生菌群的定植培养方法及其应用。通过从鸡肠道不同肠段十二指肠，空肠，回肠，盲肠和鸡粪便分离、筛选优质菌株，比较菌株的耐性、产酶和产酸能力，获得活菌数高且能产生丰富的蛋白酶，脂肪酶，淀粉酶以及乳酸，乙酸，丙酸，甲酸，柠檬酸的优质菌株，对筛选菌株复配定植培养及比例优化，最终得到由海内氏芽孢杆菌(bacillushaynesii)、乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)、沙福芽孢杆菌(bacillussafensis)、弗氏丙酸杆菌(propionibacteriumfreudennreichii)、丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)组成的复合微生物菌剂，将其应用于三黄肉雏鸡饲养，益生菌群在雏鸡肠道内迅速生长和繁殖，活菌数量高，利于雏鸡对饲料的消化，提高雏鸡免疫力，从而显著提高雏鸡的成活率和促进其体重增加，对于微生物菌剂在雏鸡养殖具有广泛的应用价值。为了达到以上技术目的，本发明通过以下技术方案实现：本发明提供一种三黄肉雏鸡肠道益生菌群定植培养方法，具体包括以下步骤：(1)通过农牧民散养土鸡中肠道的十二指肠、空肠、回肠和盲肠不同肠段和鸡粪便筛选分离，定向分离芽孢菌、乳酸菌、双歧杆菌和丁酸梭菌，通过形态学和染色比较共计纯化获得代表菌株，进行菌种鉴定。(2)将筛选的上述芽孢菌、乳酸菌、双歧杆菌和丁酸梭菌作为益生菌经相应培养基进行培养：芽孢菌在lb液体培养基37℃，180rpm/min培养48h，乳酸菌采用mrs液体培养基37℃静置培养活化48h，丁酸梭菌采用rcm培养基，37℃静置48h，双歧杆菌在mrs液体培养基37℃，厌氧静置培养48h；测量每种菌的抑菌圈，选择抑菌圈效果最明显的菌株，初步筛选优质菌株。(3)对筛选出的益生菌进行耐性筛选、产酶和产酸能力比较，筛选出耐酸、耐胆盐、耐胃肠液、产酸能力强且产酶丰富的菌株。(4)将上述步骤(3)筛选获得的海内氏芽孢杆菌(bacillushaynesii)、乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)、沙福芽孢杆菌(bacillussafensis)、弗氏丙酸杆菌(propionibacteriumfreudennreichii)、丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)组成适合于三黄肉雏鸡肠道益生菌群定植培养的复合微生物菌剂，将上述5种菌种按照体积比10：10：50：50：50进行复配，最终确定作为适用于三黄肉雏鸡的定植培养雏鸡肠道益生菌群。(5)将步骤(4)制备的由海内氏芽孢杆菌(bacillushaynesii)、乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)、沙福芽孢杆菌(bacillussafensis)、弗氏丙酸杆菌(propionibacteriumfreudennreichii)、丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)复配得到的益生菌群通过饲喂0日龄雏鸡，在雏鸡肠道内定植培养，快速建立起其强势益生菌群。本发明中，所述一种三黄肉雏鸡肠道益生菌群定植培养方法获得的复合微生物菌剂，由海内氏芽孢杆菌(bacillushaynesii)、乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)、沙福芽孢杆菌(bacillussafensis)、弗氏丙酸杆菌(propionibacteriumfreudennreichii)、丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)按照体积比10：10：50：50：50复配获得。本发明中，复合微生物菌剂在三黄肉雏鸡肠道益生菌群定植中的应用。本发明中，复合微生物菌剂在三黄肉雏鸡饲养中的应用。采用上述技术方案后，本发明获得有益效果如下：(1)利用本发明三黄肉雏鸡肠道益生菌群定植培养方法制备的复合微生物菌剂与常规微生物菌剂饲养相比，在生产性能(料肉比、成活率及平均体重)、肠道大肠杆菌(病原菌)、乳酸杆菌和双歧杆菌(有益菌)数量，免疫球蛋白a和g浓度等方面的改善效果。(2)本发明提供的三黄肉雏鸡肠道益生菌群定植培养方法，不仅可以保证菌种生长，相互之间没有拮抗，同时可以有效控制微生物菌群的代谢产物，产生丰富的蛋白酶，脂肪酶和淀粉酶，从而明显改善了三黄肉雏鸡消化功能。(3)本发明提供的三黄肉雏鸡肠道益生菌群定植培养方法制备的复合微生物菌剂产生活菌数高，能够在三黄肉雏鸡肠道内快速建立起盲肠优势菌群，刺激提高免疫同时帮助消化。附图说明：无具体实施方式下面举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下属实施例。本发明测定指标：测定体重、料肉比、成活率等生长性能指标，均在试验肉鸡喂养28天早晨空腹称重后，每个重复，随机抽取1只健康三黄肉雏鸡，采用全自动生化分析仪(olypusau600型)测定血液生化指标。实施例1：三黄肉雏鸡肠道益生菌群定植培养方法一种三黄肉雏鸡肠道益生菌群的定植培养方法，具体包括如下步骤：(1)通过农牧民散养土鸡中肠道的十二指肠、空肠、回肠和盲肠不同肠段和鸡粪便筛选分离，定向分离芽孢菌、乳酸菌、双歧杆菌和丁酸梭菌，通过形态学和染色比较共计纯化获得代表菌株，进行菌种鉴定。(2)将筛选的上述芽孢菌、乳酸菌、双歧杆菌和丁酸梭菌作为益生菌经相应培养基进行培养：芽孢菌在lb液体培养基37℃，180rpm/min培养48h，乳酸菌采用mrs液体培养基37℃静置培养活化48h，丁酸梭菌采用rcm培养基，37℃静置48h，双歧杆菌在mrs液体培养基37℃，厌氧静置培养48h；测量每种菌的抑菌圈，选择抑菌圈效果最明显的菌株，初步筛选优质菌株。(3)对筛选出的益生菌进行耐性、产酶和产酸能力比较，筛选出耐酸、耐胆盐、耐胃肠液、产酸能力强且产酶丰富的菌株。(4)将上述步骤(3)筛选获得的海内氏芽孢杆菌(bacillushaynesii)、乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)、沙福芽孢杆菌(bacillussafensis)、弗氏丙酸杆菌(propionibacteriumfreudennreichii)、丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)组成适合于三黄肉雏鸡肠道益生菌群定植培养的复合微生物菌剂，将上述5种菌种按照体积比10：10：50：50：50进行复配，最终确定作为适用于三黄肉雏鸡的定植培养雏鸡肠道益生菌群。(5)将步骤(4)制备的由海内氏芽孢杆菌(bacillushaynesii)、乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)、沙福芽孢杆菌(bacillussafensis)、弗氏丙酸杆菌(propionibacteriumfreudennreichii)、丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)复配得到的益生菌群通过饲喂0日龄雏鸡在雏鸡肠道内定植培养，快速建立起其强势益生菌群。实施例2：三黄肉雏鸡肠道益生菌群定植培养方法(1)菌株的分离、纯化及鉴定购买南北疆农牧民民散养土鸡，对其进行禁食，不禁水3天，使其肠道内食物完全排空。活鸡宰杀完毕后，选取各鸡肠道不同肠段十二指肠，空肠，回肠，盲肠和鸡粪便，进行分离，使用无菌棉绳将各肠段捆扎紧，对各肠段进行标记，然后使用无菌剪刀将不同肠段剪下，放置于无菌纱布上，然后在无菌环境下使用无菌剪刀将肠道剪开，利用无菌勺挂取肠壁表面黏着物，放置于带有玻璃珠的50ml/150ml三角瓶，加入50ml无菌生理盐水，置于摇床室温震荡30min，无菌操作下进行梯度稀释10-4、10-5和10-6，于各种培养基上置于37℃恒温培养，厌氧微生物使用厌氧培养罐(罐体内通入二氧化碳或者氮气将罐体中氧气排出形成厌氧环境)，放置于37℃恒温培养。定向分离芽孢菌(地衣芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌)，乳酸菌(粪场球菌，屎肠球菌，乳酸场肠球菌，嗜酸乳杆菌，保加利亚乳杆菌，干酪乳杆菌，植物乳杆菌，乳酸乳杆菌，戊糖片球菌)，双歧杆菌(两歧双歧杆菌)，丁酸梭菌，同时也对鸡肠道病原菌进行了分离，分离鉴别用到的培养基如附表1。表1：鸡肠菌群分离培养基培养基名称乳酸菌分离培养基mrs琼脂(添加0.75％caco3)芽孢菌培养基lb琼脂梭菌厌氧菌选择培养基tsn琼脂丁酸梭菌培养基rcm培养基大肠杆菌鉴别培养基emb琼脂沙门氏菌与志贺氏菌鉴别培养基ss琼脂通过形态学和染色比较共计纯化出30株具有代表性菌株，然后对菌株进行16srrna基因测序，通过与genbank数据库序列比对，构建系统发育树，结果如表2所示。30株菌分别归为，乳酸菌类：片球菌属，肠球菌属，乳杆菌属；双歧杆菌类：双歧杆菌属，芽孢菌属，丁酸梭菌属；病原菌：埃希氏菌属，沙门氏菌属，志贺氏菌属。表2：肠道微生物分离及其鉴定(2)益生菌活性对比试验根据每个肠段里益生菌种类和特点，肠道病原菌抑制为筛选准则，根据肠段从十二指肠，空肠，回肠到盲肠氧气含量逐渐降低的特点，十二指肠，空肠主要以好氧性微生物为主，芽孢菌，回肠微厌氧主要以乳酸菌为主，盲肠厌氧，以厌氧菌为主。将筛选到的益生菌在lb液体培养基(芽孢菌)37℃，180rpm/min培养48h，乳酸菌采用mrs液体培养基37℃静置培养活化48h，丁酸梭菌采用rcm培养基，37℃静置48h；致病菌在普通液体培养基(nb)摇床培养16h，取灭菌后的营养琼脂(na)培养基冷却至46℃左右，接入1％的致病菌，混匀后，无菌超净工作台下倒平板，待平板冷却凝固后，用打孔器打孔，每个孔内添加100μl的乳酸菌菌液，常温下静置3h后，置于37℃培养箱，过夜培养。测量每种乳酸菌的抑菌圈，选择抑菌圈效果最明显的菌株，用于后续共培养实验，具体结果如表3所示。表3：鸡源肠道益生菌对鸡源病原菌的抑制效果(体外平板抑菌圈法)根据表3的数据可知，7株芽孢杆菌对三种病原菌具有较为强烈的抑菌活性，其中包括bacillusvelezensis(dj-h3)，bacillussubtilis(ts-s6)，bacillussafensis(hj-m15)，bacillushaynesii(ts-s7)，bacillusmethylotrophicus(bc-k1)，bacilluspumilus(bj-k3)，bacillustequilensis(hj-k5)。筛选出乳酸菌3株：lactobacillusplantarum(hj-m11)，enterococcusfeacium(em-s1)，pediococcusacidilactici(hj-s5)，厌氧菌2株：clostridiumbutyricum(hj-m1)，bifidobacteriumbifidum(hj-m12)，丙酸菌1株：propionibacteriumfreudennreichii(bc-k2)。(3)益生菌耐性对比试验本试验对筛选出的13株菌的耐性进行比较，考察不同ph值、胆盐浓度中菌株的存活率以及各菌株对人体胃肠液的耐受性，结果如表4-7所示。表4：益生菌耐酸特性比较表5：益生菌耐胆盐特性比较表6：耐人工胃肠液特性比较表7：耐人工肠液特性比较由表4-7结果可知，各芽孢菌在培养结束时形成芽孢率为99.21％，其形成芽孢后对于酸，胆盐，肠液，胃液均具有较强的抗性，其中ph值对芽孢菌的影响最大，当ph值在1.5时，芽孢菌活菌放置0.5h，活菌数最高不超过61％；而当ph值为2.5时，活菌数增加至80％左右，当ph值为3.5时活菌数增加至90％左右。胆盐，肠液，胃液对于各类益生菌影响差异不显著，在最高浓度情况下，其存活率至少保持在90％以上，除了丙酸菌对胆盐和肠液表现的较为敏感，但其活菌数至少在80％以上表明这些菌均具有潜在的益生菌应用效果。(4)益生菌产酶和产酸能力比较试验利用微量法酶试剂检测试剂盒对菌株培养48h后其所产生的胞外酶活性进行了比较，芽孢菌以lb液体培养基为基础培养基，接入相同浓度的各芽孢菌，然后培养48h后，吸取1ml菌液12000rpm/min离心，然后吸取0.1ml上清液加入酶活试剂盒37℃恒温培养测定各项酶酶活性，结果如表8-9所示。表8：芽孢菌产酶比较表9：益生菌产酸比较由附表8-9结果可知，芽孢菌和丁酸梭菌都能够产生丰富的蛋白酶，脂肪酶，淀粉酶，少量能够产生纤维素酶。各芽孢菌产酶能力较为相当，其中丁酸梭菌产各种酶能力最强，其他芽孢菌产酶能力相差不大。益生菌产酸能力比较，同型乳酸菌植物乳杆菌hj-m11产乳酸能力最强，乳酸片球菌产乳酸能力次之，这两种菌均不产生其他类型酸，而异型乳酸菌em-s1和hj-m12能够产生乳酸，乙酸，和甲酸。丁酸梭菌能够产生乙酸和丁酸，而费氏丙酸杆菌bc-k2仅能够检测到丙酸。(5)益生菌株的复配定植培养试验根据每种菌在恒定培养基条件下，其发酵代谢产物较为恒定这一特点，以及三黄肉雏鸡养殖阶段需求进行复配不同的菌株及其代谢产物。设定正交分析实验，选择bacillussafensishj-m15,bacillushaynesiits-s7,bacillustequilensishj-k5,lactobacillusplantarumhj-m11,enterococcusfeaciumem-s1,pediococcusacidilacticihj-s5,clostridiumbutyricumhj-m1，bifidobacteriumbifidumhj-m12，propionibacteriumfreudennreichiibc-k2。正交实验表如表10所示，5因素，4个水平1，5,10,50ml。对这16组复配菌剂进行饲喂试验，以0日龄黄羽肉鸡为研究对象，每组20只鸡，菌剂按照1:1000比例稀释后饮水中添加，小鸡饲料为天康成品小鸡开口料，小鸡自由吃食和自由饮水，每组小鸡使用一个独立饮水器和一个独立网箱架子彼此隔离(2m×1m＝2m2)，实验周期30天，记录小鸡成活率，周增重，饲料用量，使用spss对这几个值进行pca分析，提取出其代表值进行正交结果分析。表10：黄羽肉鸡的周增重结果由附表10结果可知，当试验各菌株按照体积比bacillushaynesiits-s7：pediococcusacidilacticihj-s5：bacillussafensishj-m15：propionibacteriumfreudennreichiibc-k2：clostridiumbutyricumhj-m1＝10：10：50：50：50的复合微生物菌剂对雏鸡的各项指标影响最大。0日龄雏鸡肠道内为无菌状态，且此阶段肠道容毛等较短，肠道消化，吸收能力弱，因此需要通过饲喂益生菌从而快速建立起其强势益生菌群。另外，此阶段雏鸡的免疫能力较弱，其盲肠段微生物菌群比较少和单一，因此需要快速建立起盲肠优势类群，刺激提高免疫同时帮助消化。利用高产酶和抑菌活性的芽孢菌促进饲料消化利用，复配乳酸菌降低肠道酸碱度洗脱大肠杆菌等病原菌的粘附，丁酸梭菌，双歧杆菌增加盲肠免疫刺激功能，促进雏鸡免疫性能。进一步的对每株菌在固定培养基条件下活菌数进行检测，具体结果如表11所示。表11：菌株在特定培养基上的活菌数和产酸量各微生物菌株按照复配比例bacillushaynesiits-s7(海内氏芽孢杆菌)：pediococcusacidilacticihj-s5(乳酸片球菌)：bacillussafensishj-m15(沙福芽孢杆菌)：propionibacteriumfreudennreichiibc-k2(弗氏丙酸杆菌)：clostridiumbutyricumhj-m1(丁酸梭菌)＝10：10：50：50：50制备复合微生物菌剂时，各种菌株的生长正常，没有产生相互抑制作用，活菌数高，产酸种类多，为其在雏鸡喂养中的应用提供了依据。实施例3：三黄肉雏鸡肠道益生菌群定植培养方法制备的复合微生物菌剂的应用本实施例考察通过三黄肉雏鸡肠道益生菌群定植培养方法制备的复合微生物菌剂在三黄雏鸡喂养中的应用效果，选择新疆石河子市某三黄肉鸡养殖场六栋圈舍(平均1万羽/栋)，比较不同稀释浓度梯度下菌剂对肉黄鸡生长性能，料肉比的影响，设立三个稀释梯度，1:500(t1)、1:1000(t2)、1:1500(t3)，1:2000(t4)和1:3000(t5)比例，以市售复合微生物菌剂按照说明书比例喂养为对照1组(ck1)以正常饲喂不添加菌剂组为对照(ck2)，监测7-42天期间三黄肉雏鸡生长性能，评估不同菌剂使用对三黄肉雏鸡免疫器官指数的影响，以25日龄饲喂开始日期为对照，比较三黄肉雏鸡各项器官指标差异，进一步考查了不同微生物菌剂对三黄肉雏鸡盲肠微生物及血清免疫球蛋白的影响，具体结果如12-15。表12：7-42日龄三黄肉黄雏鸡生长性能表13：不同处理组对三黄肉黄雏鸡免疫指数的影响表14：复合微生物菌剂对三黄肉雏鸡盲肠微生物的影响组别乳酸杆菌双歧杆菌大肠杆菌t15.95±0.29a4.42±0.85a2.89±0.28at26.06±0.22a4.69±0.36a1.96±0.44at35.98±0.32a4.46±0.25a2.34±0.35at45.90±0.31a4.39±0.34a2.64±0.28at56.02±0.20a4.53±0.31a2.26±0.25ack14.75±0.35a3.09±0.34a4.86±0.35ack23.92±0.44b1.61±0.47b7.68±0.22c注：①菌群数量单位：cfu(1×108)/g肠道内容物；②同列内不同上标字母表示差异显著(p＜0.05)，相同上标字母表示差异不显著(p＞0.05)。表15：不同处理对三黄肉雏鸡免疫球蛋白水平的影响组别免疫球蛋白a免疫球蛋白gt14762.03±362.13b17989.35±967.35at24882.59±453.63b18150.36±657.27at34851.32±244.53a17645.31±856.38at44805.15±325.25b18089.45±811.65at54825.51±296.31a17105.34±832.16ack14533.18±130.66a16855.67±980.8abck23154.06±342.48c11487.19±239.12c注：同列数据字母相同表示差异不显著(p>0.05),相邻字母表示差异显著(p<0.05)相间字母表示差异极显著(p<0.01)。由以上附表12-15的数据可知，本发明制备的三黄肉雏鸡用复合微生物菌剂与不加微生物菌剂、市售微生物菌剂喂养情况对比，本发明制备的三黄肉雏鸡用复合微生物菌剂生产性能明显优于其他组，其中肉鸡平均重量为3.13kg，全期增重3.07kg，肉鸡仔成活率为大于97.73％；进一步对不同复合微生物菌剂喂养三黄肉雏鸡的盲肠微生物进行了调查，本发明制备的三黄肉雏鸡复合微生物菌剂喂养的三黄肉雏鸡，乳酸杆菌和双歧杆菌(益生菌)含量均有提高，而肠道大肠杆菌(病原菌)被抑制，所以三黄肉雏鸡的消化功能明显增强；同时对不同微生物菌剂喂养的三黄肉雏鸡血清免疫球蛋白进行测定，结果显示，本发明提供的复合微生物菌剂明显优于不填加和市售微生物菌剂对照组，三黄肉雏鸡血清免疫球蛋白a和免疫球蛋白g浓度会进一步提高，表明机体转运营养物质的作用增强，从而促进肌肉蛋白质的沉积，且机体体液免疫反应亦同时增强，所以三黄肉雏鸡平均体重显著提高。上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。当前第1页1 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：微生态制剂(microbialecologicalagent)是在微生态平衡理论、微生态防治理论和微生态营养理论等的指导下，选用动物体内的有益微生物及其特殊营养物质经培养、发酵、干燥等特殊加工工艺而制成的生物制剂或者活菌剂，它们能够在数量或种类上补充肠道内缺乏或减少的正常微生物，维持或调整肠道内微生态环境的平衡。具有防治疾病、保健的功能，且无毒、无残留副作用，近年来倍受人们亲睐。菌种的选择是影响微生态制剂作用效果的关键因素，在选择菌种时应遵循如下原则：第一，菌株属于动物正常菌群，能确保益生菌能顺利进入肠道定植并能快速的生长繁殖，更好的发挥其益生功能。第二，菌株的益生作用良好，能耐受胃中低ph值和胆汁而且能够在快速定植于肠粘膜。第三，菌株安全，没有毒副作用。第四，存储稳定性好，易于生产和保持其活力状态。三黄肉雏鸡指0-50d刚孵出的鸡。雏鸡的消化功能非常弱，需要制作质地较软的饲料，刚出壳的雏鸡体内有足够的卵黄，3-5天内可供给雏鸡部分营养物质。雏鸡开食多在孵出后12-24h，这段时间开食的死亡率最低，但同时这阶段雏鸡肠道中会引入大量微生物，这也是雏鸡成活率最大影响因素。现在家禽集约化养殖从饲料到养殖设备均是配套的，微生物活菌只有两种使用方式可以介入，一种是固体粉剂可以与鸡饲料一起混合使用，第二种是液体菌剂通过添加至饮水水线使用，前者并无特殊要求，而后者要求菌液分散性好，不能堵塞水线。由于家禽的肠道较短，固体菌粉处于休眠状态，直接饲喂其往往是进入肠道还未活化很快就被排出体外，这限制了其作用效果的发挥。而液体菌剂由于培养阶段菌种始终处于高活性状态，并且其培养时能够产生大量活性代谢产物(酶，有机酸，活性小肽，氨基酸，抗菌素等)，而这些优点使得其能够进入肠道后无需活化并且代谢产物不受胃酸，胆盐等影响能够作用速度更快，效果更显著。因此，多种非拮抗性微生物菌剂进行复配，与单菌株相比可以更进一步的提高动物对于饲料的利用水平，利用率，从而降低料肉/蛋比。然而在实际的应用过程中，不同的菌种复合，如何能够有效控制每个菌株的活菌数和代谢产物稳定，是目前微生物菌剂研制过程和应用中的难题。技术实现要素：针对三黄肉雏鸡脱温饲养过程中抗生素滥用，雏鸡无抗养殖死亡率高，以及复合微生物菌剂活菌数和代谢产物种类和产量的稳定性等技术问题。本发明旨在提供一种三黄肉雏鸡肠道益生菌群的定植培养方法及其应用。通过从鸡肠道不同肠段十二指肠，空肠，回肠，盲肠和鸡粪便分离、筛选优质菌株，比较菌株的耐性、产酶和产酸能力，获得活菌数高且能产生丰富的蛋白酶，脂肪酶，淀粉酶以及乳酸，乙酸，丙酸，甲酸，柠檬酸的优质菌株，对筛选菌株复配定植培养及比例优化，最终得到由海内氏芽孢杆菌(bacillushaynesii)、乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)、沙福芽孢杆菌(bacillussafensis)、弗氏丙酸杆菌(propionibacteriumfreudennreichii)、丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)组成的复合微生物菌剂，将其应用于三黄肉雏鸡饲养，益生菌群在雏鸡肠道内迅速生长和繁殖，活菌数量高，利于雏鸡对饲料的消化，提高雏鸡免疫力，从而显著提高雏鸡的成活率和促进其体重增加，对于微生物菌剂在雏鸡养殖具有广泛的应用价值。为了达到以上技术目的，本发明通过以下技术方案实现：本发明提供一种三黄肉雏鸡肠道益生菌群定植培养方法，具体包括以下步骤：(1)通过农牧民散养土鸡中肠道的十二指肠、空肠、回肠和盲肠不同肠段和鸡粪便筛选分离，定向分离芽孢菌、乳酸菌、双歧杆菌和丁酸梭菌，通过形态学和染色比较共计纯化获得代表菌株，进行菌种鉴定。(2)将筛选的上述芽孢菌、乳酸菌、双歧杆菌和丁酸梭菌作为益生菌经相应培养基进行培养：芽孢菌在lb液体培养基37℃，180rpm/min培养48h，乳酸菌采用mrs液体培养基37℃静置培养活化48h，丁酸梭菌采用rcm培养基，37℃静置48h，双歧杆菌在mrs液体培养基37℃，厌氧静置培养48h；测量每种菌的抑菌圈，选择抑菌圈效果最明显的菌株，初步筛选优质菌株。(3)对筛选出的益生菌进行耐性筛选、产酶和产酸能力比较，筛选出耐酸、耐胆盐、耐胃肠液、产酸能力强且产酶丰富的菌株。(4)将上述步骤(3)筛选获得的海内氏芽孢杆菌(bacillushaynesii)、乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)、沙福芽孢杆菌(bacillussafensis)、弗氏丙酸杆菌(propionibacteriumfreudennreichii)、丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)组成适合于三黄肉雏鸡肠道益生菌群定植培养的复合微生物菌剂，将上述5种菌种按照体积比10：10：50：50：50进行复配，最终确定作为适用于三黄肉雏鸡的定植培养雏鸡肠道益生菌群。(5)将步骤(4)制备的由海内氏芽孢杆菌(bacillushaynesii)、乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)、沙福芽孢杆菌(bacillussafensis)、弗氏丙酸杆菌(propionibacteriumfreudennreichii)、丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)复配得到的益生菌群通过饲喂0日龄雏鸡，在雏鸡肠道内定植培养，快速建立起其强势益生菌群。本发明中，所述一种三黄肉雏鸡肠道益生菌群定植培养方法获得的复合微生物菌剂，由海内氏芽孢杆菌(bacillushaynesii)、乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)、沙福芽孢杆菌(bacillussafensis)、弗氏丙酸杆菌(propionibacteriumfreudennreichii)、丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)按照体积比10：10：50：50：50复配获得。本发明中，复合微生物菌剂在三黄肉雏鸡肠道益生菌群定植中的应用。本发明中，复合微生物菌剂在三黄肉雏鸡饲养中的应用。采用上述技术方案后，本发明获得有益效果如下：(1)利用本发明三黄肉雏鸡肠道益生菌群定植培养方法制备的复合微生物菌剂与常规微生物菌剂饲养相比，在生产性能(料肉比、成活率及平均体重)、肠道大肠杆菌(病原菌)、乳酸杆菌和双歧杆菌(有益菌)数量，免疫球蛋白a和g浓度等方面的改善效果。(2)本发明提供的三黄肉雏鸡肠道益生菌群定植培养方法，不仅可以保证菌种生长，相互之间没有拮抗，同时可以有效控制微生物菌群的代谢产物，产生丰富的蛋白酶，脂肪酶和淀粉酶，从而明显改善了三黄肉雏鸡消化功能。(3)本发明提供的三黄肉雏鸡肠道益生菌群定植培养方法制备的复合微生物菌剂产生活菌数高，能够在三黄肉雏鸡肠道内快速建立起盲肠优势菌群，刺激提高免疫同时帮助消化。附图说明：无具体实施方式下面举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下属实施例。本发明测定指标：测定体重、料肉比、成活率等生长性能指标，均在试验肉鸡喂养28天早晨空腹称重后，每个重复，随机抽取1只健康三黄肉雏鸡，采用全自动生化分析仪(olypusau600型)测定血液生化指标。实施例1：三黄肉雏鸡肠道益生菌群定植培养方法一种三黄肉雏鸡肠道益生菌群的定植培养方法，具体包括如下步骤：(1)通过农牧民散养土鸡中肠道的十二指肠、空肠、回肠和盲肠不同肠段和鸡粪便筛选分离，定向分离芽孢菌、乳酸菌、双歧杆菌和丁酸梭菌，通过形态学和染色比较共计纯化获得代表菌株，进行菌种鉴定。(2)将筛选的上述芽孢菌、乳酸菌、双歧杆菌和丁酸梭菌作为益生菌经相应培养基进行培养：芽孢菌在lb液体培养基37℃，180rpm/min培养48h，乳酸菌采用mrs液体培养基37℃静置培养活化48h，丁酸梭菌采用rcm培养基，37℃静置48h，双歧杆菌在mrs液体培养基37℃，厌氧静置培养48h；测量每种菌的抑菌圈，选择抑菌圈效果最明显的菌株，初步筛选优质菌株。(3)对筛选出的益生菌进行耐性、产酶和产酸能力比较，筛选出耐酸、耐胆盐、耐胃肠液、产酸能力强且产酶丰富的菌株。(4)将上述步骤(3)筛选获得的海内氏芽孢杆菌(bacillushaynesii)、乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)、沙福芽孢杆菌(bacillussafensis)、弗氏丙酸杆菌(propionibacteriumfreudennreichii)、丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)组成适合于三黄肉雏鸡肠道益生菌群定植培养的复合微生物菌剂，将上述5种菌种按照体积比10：10：50：50：50进行复配，最终确定作为适用于三黄肉雏鸡的定植培养雏鸡肠道益生菌群。(5)将步骤(4)制备的由海内氏芽孢杆菌(bacillushaynesii)、乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)、沙福芽孢杆菌(bacillussafensis)、弗氏丙酸杆菌(propionibacteriumfreudennreichii)、丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)复配得到的益生菌群通过饲喂0日龄雏鸡在雏鸡肠道内定植培养，快速建立起其强势益生菌群。实施例2：三黄肉雏鸡肠道益生菌群定植培养方法(1)菌株的分离、纯化及鉴定购买南北疆农牧民民散养土鸡，对其进行禁食，不禁水3天，使其肠道内食物完全排空。活鸡宰杀完毕后，选取各鸡肠道不同肠段十二指肠，空肠，回肠，盲肠和鸡粪便，进行分离，使用无菌棉绳将各肠段捆扎紧，对各肠段进行标记，然后使用无菌剪刀将不同肠段剪下，放置于无菌纱布上，然后在无菌环境下使用无菌剪刀将肠道剪开，利用无菌勺挂取肠壁表面黏着物，放置于带有玻璃珠的50ml/150ml三角瓶，加入50ml无菌生理盐水，置于摇床室温震荡30min，无菌操作下进行梯度稀释10-4、10-5和10-6，于各种培养基上置于37℃恒温培养，厌氧微生物使用厌氧培养罐(罐体内通入二氧化碳或者氮气将罐体中氧气排出形成厌氧环境)，放置于37℃恒温培养。定向分离芽孢菌(地衣芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌)，乳酸菌(粪场球菌，屎肠球菌，乳酸场肠球菌，嗜酸乳杆菌，保加利亚乳杆菌，干酪乳杆菌，植物乳杆菌，乳酸乳杆菌，戊糖片球菌)，双歧杆菌(两歧双歧杆菌)，丁酸梭菌，同时也对鸡肠道病原菌进行了分离，分离鉴别用到的培养基如附表1。表1：鸡肠菌群分离培养基培养基名称乳酸菌分离培养基mrs琼脂(添加0.75％caco3)芽孢菌培养基lb琼脂梭菌厌氧菌选择培养基tsn琼脂丁酸梭菌培养基rcm培养基大肠杆菌鉴别培养基emb琼脂沙门氏菌与志贺氏菌鉴别培养基ss琼脂通过形态学和染色比较共计纯化出30株具有代表性菌株，然后对菌株进行16srrna基因测序，通过与genbank数据库序列比对，构建系统发育树，结果如表2所示。30株菌分别归为，乳酸菌类：片球菌属，肠球菌属，乳杆菌属；双歧杆菌类：双歧杆菌属，芽孢菌属，丁酸梭菌属；病原菌：埃希氏菌属，沙门氏菌属，志贺氏菌属。表2：肠道微生物分离及其鉴定(2)益生菌活性对比试验根据每个肠段里益生菌种类和特点，肠道病原菌抑制为筛选准则，根据肠段从十二指肠，空肠，回肠到盲肠氧气含量逐渐降低的特点，十二指肠，空肠主要以好氧性微生物为主，芽孢菌，回肠微厌氧主要以乳酸菌为主，盲肠厌氧，以厌氧菌为主。将筛选到的益生菌在lb液体培养基(芽孢菌)37℃，180rpm/min培养48h，乳酸菌采用mrs液体培养基37℃静置培养活化48h，丁酸梭菌采用rcm培养基，37℃静置48h；致病菌在普通液体培养基(nb)摇床培养16h，取灭菌后的营养琼脂(na)培养基冷却至46℃左右，接入1％的致病菌，混匀后，无菌超净工作台下倒平板，待平板冷却凝固后，用打孔器打孔，每个孔内添加100μl的乳酸菌菌液，常温下静置3h后，置于37℃培养箱，过夜培养。测量每种乳酸菌的抑菌圈，选择抑菌圈效果最明显的菌株，用于后续共培养实验，具体结果如表3所示。表3：鸡源肠道益生菌对鸡源病原菌的抑制效果(体外平板抑菌圈法)根据表3的数据可知，7株芽孢杆菌对三种病原菌具有较为强烈的抑菌活性，其中包括bacillusvelezensis(dj-h3)，bacillussubtilis(ts-s6)，bacillussafensis(hj-m15)，bacillushaynesii(ts-s7)，bacillusmethylotrophicus(bc-k1)，bacilluspumilus(bj-k3)，bacillustequilensis(hj-k5)。筛选出乳酸菌3株：lactobacillusplantarum(hj-m11)，enterococcusfeacium(em-s1)，pediococcusacidilactici(hj-s5)，厌氧菌2株：clostridiumbutyricum(hj-m1)，bifidobacteriumbifidum(hj-m12)，丙酸菌1株：propionibacteriumfreudennreichii(bc-k2)。(3)益生菌耐性对比试验本试验对筛选出的13株菌的耐性进行比较，考察不同ph值、胆盐浓度中菌株的存活率以及各菌株对人体胃肠液的耐受性，结果如表4-7所示。表4：益生菌耐酸特性比较表5：益生菌耐胆盐特性比较表6：耐人工胃肠液特性比较表7：耐人工肠液特性比较由表4-7结果可知，各芽孢菌在培养结束时形成芽孢率为99.21％，其形成芽孢后对于酸，胆盐，肠液，胃液均具有较强的抗性，其中ph值对芽孢菌的影响最大，当ph值在1.5时，芽孢菌活菌放置0.5h，活菌数最高不超过61％；而当ph值为2.5时，活菌数增加至80％左右，当ph值为3.5时活菌数增加至90％左右。胆盐，肠液，胃液对于各类益生菌影响差异不显著，在最高浓度情况下，其存活率至少保持在90％以上，除了丙酸菌对胆盐和肠液表现的较为敏感，但其活菌数至少在80％以上表明这些菌均具有潜在的益生菌应用效果。(4)益生菌产酶和产酸能力比较试验利用微量法酶试剂检测试剂盒对菌株培养48h后其所产生的胞外酶活性进行了比较，芽孢菌以lb液体培养基为基础培养基，接入相同浓度的各芽孢菌，然后培养48h后，吸取1ml菌液12000rpm/min离心，然后吸取0.1ml上清液加入酶活试剂盒37℃恒温培养测定各项酶酶活性，结果如表8-9所示。表8：芽孢菌产酶比较表9：益生菌产酸比较由附表8-9结果可知，芽孢菌和丁酸梭菌都能够产生丰富的蛋白酶，脂肪酶，淀粉酶，少量能够产生纤维素酶。各芽孢菌产酶能力较为相当，其中丁酸梭菌产各种酶能力最强，其他芽孢菌产酶能力相差不大。益生菌产酸能力比较，同型乳酸菌植物乳杆菌hj-m11产乳酸能力最强，乳酸片球菌产乳酸能力次之，这两种菌均不产生其他类型酸，而异型乳酸菌em-s1和hj-m12能够产生乳酸，乙酸，和甲酸。丁酸梭菌能够产生乙酸和丁酸，而费氏丙酸杆菌bc-k2仅能够检测到丙酸。(5)益生菌株的复配定植培养试验根据每种菌在恒定培养基条件下，其发酵代谢产物较为恒定这一特点，以及三黄肉雏鸡养殖阶段需求进行复配不同的菌株及其代谢产物。设定正交分析实验，选择bacillussafensishj-m15,bacillushaynesiits-s7,bacillustequilensishj-k5,lactobacillusplantarumhj-m11,enterococcusfeaciumem-s1,pediococcusacidilacticihj-s5,clostridiumbutyricumhj-m1，bifidobacteriumbifidumhj-m12，propionibacteriumfreudennreichiibc-k2。正交实验表如表10所示，5因素，4个水平1，5,10,50ml。对这16组复配菌剂进行饲喂试验，以0日龄黄羽肉鸡为研究对象，每组20只鸡，菌剂按照1:1000比例稀释后饮水中添加，小鸡饲料为天康成品小鸡开口料，小鸡自由吃食和自由饮水，每组小鸡使用一个独立饮水器和一个独立网箱架子彼此隔离(2m×1m＝2m2)，实验周期30天，记录小鸡成活率，周增重，饲料用量，使用spss对这几个值进行pca分析，提取出其代表值进行正交结果分析。表10：黄羽肉鸡的周增重结果由附表10结果可知，当试验各菌株按照体积比bacillushaynesiits-s7：pediococcusacidilacticihj-s5：bacillussafensishj-m15：propionibacteriumfreudennreichiibc-k2：clostridiumbutyricumhj-m1＝10：10：50：50：50的复合微生物菌剂对雏鸡的各项指标影响最大。0日龄雏鸡肠道内为无菌状态，且此阶段肠道容毛等较短，肠道消化，吸收能力弱，因此需要通过饲喂益生菌从而快速建立起其强势益生菌群。另外，此阶段雏鸡的免疫能力较弱，其盲肠段微生物菌群比较少和单一，因此需要快速建立起盲肠优势类群，刺激提高免疫同时帮助消化。利用高产酶和抑菌活性的芽孢菌促进饲料消化利用，复配乳酸菌降低肠道酸碱度洗脱大肠杆菌等病原菌的粘附，丁酸梭菌，双歧杆菌增加盲肠免疫刺激功能，促进雏鸡免疫性能。进一步的对每株菌在固定培养基条件下活菌数进行检测，具体结果如表11所示。表11：菌株在特定培养基上的活菌数和产酸量各微生物菌株按照复配比例bacillushaynesiits-s7(海内氏芽孢杆菌)：pediococcusacidilacticihj-s5(乳酸片球菌)：bacillussafensishj-m15(沙福芽孢杆菌)：propionibacteriumfreudennreichiibc-k2(弗氏丙酸杆菌)：clostridiumbutyricumhj-m1(丁酸梭菌)＝10：10：50：50：50制备复合微生物菌剂时，各种菌株的生长正常，没有产生相互抑制作用，活菌数高，产酸种类多，为其在雏鸡喂养中的应用提供了依据。实施例3：三黄肉雏鸡肠道益生菌群定植培养方法制备的复合微生物菌剂的应用本实施例考察通过三黄肉雏鸡肠道益生菌群定植培养方法制备的复合微生物菌剂在三黄雏鸡喂养中的应用效果，选择新疆石河子市某三黄肉鸡养殖场六栋圈舍(平均1万羽/栋)，比较不同稀释浓度梯度下菌剂对肉黄鸡生长性能，料肉比的影响，设立三个稀释梯度，1:500(t1)、1:1000(t2)、1:1500(t3)，1:2000(t4)和1:3000(t5)比例，以市售复合微生物菌剂按照说明书比例喂养为对照1组(ck1)以正常饲喂不添加菌剂组为对照(ck2)，监测7-42天期间三黄肉雏鸡生长性能，评估不同菌剂使用对三黄肉雏鸡免疫器官指数的影响，以25日龄饲喂开始日期为对照，比较三黄肉雏鸡各项器官指标差异，进一步考查了不同微生物菌剂对三黄肉雏鸡盲肠微生物及血清免疫球蛋白的影响，具体结果如12-15。表12：7-42日龄三黄肉黄雏鸡生长性能表13：不同处理组对三黄肉黄雏鸡免疫指数的影响表14：复合微生物菌剂对三黄肉雏鸡盲肠微生物的影响组别乳酸杆菌双歧杆菌大肠杆菌t15.95±0.29a4.42±0.85a2.89±0.28at26.06±0.22a4.69±0.36a1.96±0.44at35.98±0.32a4.46±0.25a2.34±0.35at45.90±0.31a4.39±0.34a2.64±0.28at56.02±0.20a4.53±0.31a2.26±0.25ack14.75±0.35a3.09±0.34a4.86±0.35ack23.92±0.44b1.61±0.47b7.68±0.22c注：①菌群数量单位：cfu(1×108)/g肠道内容物；②同列内不同上标字母表示差异显著(p＜0.05)，相同上标字母表示差异不显著(p＞0.05)。表15：不同处理对三黄肉雏鸡免疫球蛋白水平的影响组别免疫球蛋白a免疫球蛋白gt14762.03±362.13b17989.35±967.35at24882.59±453.63b18150.36±657.27at34851.32±244.53a17645.31±856.38at44805.15±325.25b18089.45±811.65at54825.51±296.31a17105.34±832.16ack14533.18±130.66a16855.67±980.8abck23154.06±342.48c11487.19±239.12c注：同列数据字母相同表示差异不显著(p>0.05),相邻字母表示差异显著(p<0.05)相间字母表示差异极显著(p<0.01)。由以上附表12-15的数据可知，本发明制备的三黄肉雏鸡用复合微生物菌剂与不加微生物菌剂、市售微生物菌剂喂养情况对比，本发明制备的三黄肉雏鸡用复合微生物菌剂生产性能明显优于其他组，其中肉鸡平均重量为3.13kg，全期增重3.07kg，肉鸡仔成活率为大于97.73％；进一步对不同复合微生物菌剂喂养三黄肉雏鸡的盲肠微生物进行了调查，本发明制备的三黄肉雏鸡复合微生物菌剂喂养的三黄肉雏鸡，乳酸杆菌和双歧杆菌(益生菌)含量均有提高，而肠道大肠杆菌(病原菌)被抑制，所以三黄肉雏鸡的消化功能明显增强；同时对不同微生物菌剂喂养的三黄肉雏鸡血清免疫球蛋白进行测定，结果显示，本发明提供的复合微生物菌剂明显优于不填加和市售微生物菌剂对照组，三黄肉雏鸡血清免疫球蛋白a和免疫球蛋白g浓度会进一步提高，表明机体转运营养物质的作用增强，从而促进肌肉蛋白质的沉积，且机体体液免疫反应亦同时增强，所以三黄肉雏鸡平均体重显著提高。上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。当前第1页1 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