一种花生白绢病生防芽孢杆菌产芽孢的发酵培养基及其培养方法与流程

本发明涉及微生物培养基，特别是一种花生白绢病生防芽孢杆菌产芽孢的发酵培养基及其培养方法。

背景技术：

中国是花生种植大国，花生作为重要的经济作物，关系民生。但花生连作现象严重，再加上气候变暖，高温高湿天气的增加，花生的病害也越来越严重，其中花生白绢病成为花生病害中危害严重的植物病害之一，侵染广泛。花生白绢病是一种真菌性土传病害，主要危害花生茎基部、果柄、荚果、种仁及根，可引起花生减产，造成严重的经济损失。目前国内花生抗性品种/系较少，主要的防治方法为轮作倒茬和化学药剂防治。其中传统的轮作倒茬耗时久，对花生生产不利；化学药剂防治则易导致土壤质量恶化，药剂残留，存在一定的安全隐患，不符合现代绿色农业发展的要求。生物防治则是利用有益生防菌，如细菌、真菌和放线菌等，通过拮抗、竞争、诱导植株抗病性达到抗植物病害的效果，具有高效、安全、环保、可持续等优点，成为植物病害防治研究新方向。

芽孢杆菌属是生物防治中被广泛应用的高效生防菌，其中贝莱斯芽孢杆菌作为芽孢杆菌属的一种，近几年被发现，可产生多种抑菌肽，具有良好的生防前景。通过前期的平板对峙实验发现，贝莱斯芽孢杆菌可有效抑制花生白绢病菌菌丝的生长和菌核的产生，可产生多种抑制病原菌的水解酶，盆栽实验结果进一步显示，贝莱斯芽孢杆菌可降低花生白绢病的病情指数，具有良好的防治效果，体现出作为生防菌剂的应用前景。该菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmccno.：20662。生防菌剂的有效性是影响其抑制病原菌的关键性因素，芽孢是芽孢杆菌属在相对恶劣的环境下产生的一种休眠体，相较于活菌而言，芽孢具有抗逆性强，易存活等优点，因此菌剂的制备中芽孢数量越多，菌剂的有效性就越强，生防作用就越稳定。微生物的发酵过程复杂，受多种因素影响，其中培养基配方以及培养条件对菌体的生长和芽孢的产生具有重要的影响。

技术实现要素：

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种花生白绢病生防芽孢杆菌产芽孢的发酵培养基及其培养方法，可有效解决并提高花生白绢病生防芽孢杆菌的产芽孢数量，为其工业化菌剂制备提供支撑。

为实现上述目的，本发明解决的技术方案是，一种花生白绢病生防芽孢杆菌产芽孢的发酵培养基，包括以下质量百分比计的原料：碳源：0.5％-1％，氮源：0.5％-1％，无机盐：0.3％-0.8％，余量为蒸馏水，ph为6.0-8.0；

其中，所述的碳源为麸皮、可溶性淀粉或玉米面的一种或任意质量比均匀混合在一起构成；所述的氮源为牛肉膏、酵母浸粉或豆粕的一种或任意质量比均匀混合在一起构成；

所述的无机盐为磷酸氢二钾、柠檬酸钠或氯化钠的一种或任意质量比均匀混合在一起构成。

所述花生白绢病生防芽孢杆菌产芽孢的发酵培养基培养花生白绢病生防芽孢杆菌产芽孢的培养方法，包括以下步骤：

(1)将斜面保存的花生白绢病生防芽孢杆菌菌株接种于lb培养基平板上，28-30℃培养20-24h，得活化的菌株；

(2)将活化的菌株接种到lb液体培养基中，在28-30℃、160-200r/min摇床振荡培养12-16h，得种子液；

所述的lb液体培养基是由质量浓度为10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母浸粉和10g/l氯化钠组成；

(3)将种子液接种到花生白绢病生防芽孢杆菌产芽孢的发酵培养基中培养，其中，种子液与发酵培养基体积比为1-3：100；在28-30℃、160-200r/min摇床培养36-48h，培养基初始ph为6.0-8.0，培养基装液量为40-80ml/250ml。

本发明方法简单，操作方便，通过单因素实验和正交实验，获得制备花生白绢病生防芽孢杆菌的发酵培养基配方和培养条件，降低了生产成本，可有效提高产芽孢数量，为该菌株的工业化发酵生产提供了技术基础，有显著的经济和社会效益。

附图说明

图1是六种碳源对花生白绢病生防芽孢杆菌芽孢数量的影响图。。

图2是六种氮源对花生白绢病生防芽孢杆菌芽孢数量的影响图。。

图3是六种无机盐对花生白绢病生防芽孢杆菌芽孢数量的影响图。

图4是不同质量百分比碳源麸皮对花生白绢病生防芽孢杆菌芽孢数量的影响图。

图5是不同质量百分比氮源酵母浸粉对花生白绢病生防芽孢杆菌芽孢数量的影响图。

图6是不同质量百分比无机盐氯化钠对花生白绢病生防芽孢杆菌芽孢数量的影响图。

图7是培养时间对花生白绢病生防芽孢杆菌芽孢数量的影响图。

图8是培养基初始ph对花生白绢病生防芽孢杆菌芽孢数量的影响图。

图9是装液量对花生白绢病生防芽孢杆菌芽孢数量的影响图。

图10是接种量对花生白绢病生防芽孢杆菌芽孢数量的影响图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明具体实施方式作详细说明。

实施例1

一种花生白绢病生防芽孢杆菌产芽孢的发酵培养基，包括以下质量百分比计的原料：可溶性淀粉：0.5％，牛肉膏：0.3％，酵母浸粉：0.2％，磷酸氢二钾：0.3％，余量为蒸馏水；

所述花生白绢病生防芽孢杆菌产芽孢的发酵培养基培养花生白绢病生防芽孢杆菌产芽孢的培养方法，包括以下步骤：

(1)将斜面保存的花生白绢病生防芽孢杆菌菌株接种于lb培养基平板上，28℃培养24h，得活化的菌株；

(2)将活化的菌株接种到lb液体培养基中，在28℃、160r/min摇床振荡培养16h，得种子液；

(3)将种子液接种到花生白绢病生防芽孢杆菌产芽孢发酵培养基中培养，其中，种子液与发酵培养基体积比为1：100；在28℃、160r/min摇床培养48h，培养基初始ph为6.0，培养基装液量为40ml/250ml。

实施例2

一种花生白绢病生防芽孢杆菌产芽孢的发酵培养基，包括以下质量百分比计的原料：麸皮：0.7％，酵母浸粉0.9％，氯化钠0.5％，余量为蒸馏水；

所述花生白绢病生防芽孢杆菌产芽孢的发酵培养基培养花生白绢病生防芽孢杆菌产芽孢的培养方法，包括以下步骤：

(1)将斜面保存的花生白绢病生防芽孢杆菌菌株接种于lb培养基平板上，29℃培养22h，得活化的菌株；

(2)将活化的菌株接种到lb液体培养基中，在29℃、180r/min摇床振荡培养14h，得种子液；

(3)将种子液接种到花生白绢病生防芽孢杆菌产芽孢发酵培养基中培养，其中，种子液与发酵培养基体积比为2：100；在30℃、180r/min摇床培养48h，培养基初始ph为8.0，培养基装液量为60ml/250ml。

实施例3

一种花生白绢病生防芽孢杆菌产芽孢的发酵培养基，包括以下质量百分比计的原料：玉米面：0.4％，可溶性淀粉：0.4％，豆粕：0.6％，柠檬酸钠：0.6％，余量为蒸馏水；

所述花生白绢病生防芽孢杆菌产芽孢的发酵培养基培养花生白绢病生防芽孢杆菌产芽孢的培养方法，包括以下步骤：

(1)将斜面保存的花生白绢病生防芽孢杆菌菌株接种于lb培养基平板上，30℃培养20h，得活化的菌株；

(2)将活化的菌株接种到lb液体培养基中，在30℃、200r/min摇床振荡培养12h，得种子液；

(3)将种子液接种到花生白绢病生防芽孢杆菌产芽孢发酵培养基中培养，其中，种子液与发酵培养基体积比为3：100；在30℃、200r/min摇床培养36h，培养基初始ph为8.0，培养基装液量为80ml/250ml。

实施例4

一种花生白绢病生防芽孢杆菌产芽孢的发酵培养基，包括以下质量百分比计的原料：麸皮：1％，牛肉膏：1％，氯化钠：0.3％，柠檬酸钠：0.5％，余量为蒸馏水；

所述花生白绢病生防芽孢杆菌产芽孢的发酵培养基培养花生白绢病生防芽孢杆菌产芽孢的培养方法，包括以下步骤：

(1)将斜面保存的花生白绢病生防芽孢杆菌菌株接种于lb培养基平板上，30℃培养21h，得活化的菌株；

(2)将活化的菌株接种到lb液体培养基中，在29℃、170r/min摇床振荡培养13h，得种子液；

(3)将种子液接种到花生白绢病生防芽孢杆菌产芽孢发酵培养基中培养，其中，种子液与发酵培养基体积比为1：100；在30℃、17r/min摇床培养42h，培养基初始ph为7.0，培养基装液量为70ml/250ml。

本发明在确定花生白绢病生防芽孢杆菌产芽孢的发酵培养基以及花生白绢病生防芽孢杆菌产芽孢的培养方法时，其步骤为：通过单因素实验确定影响花生白绢病生防芽孢杆菌产芽孢培养基的碳源、氮源和无机盐的考察因素，进行单因素实验确定碳源、氮源、无机盐合适浓度，通过采用正交实验获得制备花生白绢病生防芽孢杆菌的最佳发酵培养基。

本发明通过单因素实验确定影响花生白绢病生防芽孢杆菌产芽孢培养基的碳源、氮源和无机盐，见附图1、2、3，选用ck、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、可溶性淀粉、麸皮和玉米面六种碳源，选用牛肉膏、胰蛋白胨、酵母浸粉、硫酸铵、尿素和豆粕六种氮源，选用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、苯甲酸钠、柠檬酸钠、氯化钠和硫酸镁六种无机盐，经实验，可溶性淀粉、麸皮和玉米面作为碳源，牛肉膏、酵母浸粉和豆粕作为氮源，磷酸氢二钾、柠檬酸钠或氯化钠作为无机盐培养的花生白绢病生防芽孢杆菌芽孢数量最多。

上述实验确定合适的碳源、氮源和无机盐后，进行单因素实验确定碳源、氮源、无机盐合适浓度，见附图4、5、6，经实验，碳源质量百分比为0.5％-1％，氮源质量百分比为0.5％-1％，无机盐质量百分比为0.3％-0.8％时，培养的花生白绢病生防芽孢杆菌芽孢数量最多。

在培养花生白绢病生防芽孢杆菌产芽孢时，通过单因素实验，见附图7-10，培养时间为36-48h，培养基初始ph为6.0-8.0，培养基装液量为40-80ml/250ml，种子液接种量为1％-3％时，培养的花生白绢病生防芽孢杆菌芽孢数量最多。

本发明以实施例2为例，通过采用正交实验，获得制备花生白绢病生防芽孢杆菌的最佳发酵培养基，实验资料见表1、表2：

表1l9(3³)正交实验因素水平表

表2l9(3³)正交实验设计及结果

从上述可以看出，当麸皮质量百分比为0.7％，酵母浸粉质量百分比为0.9％，氯化钠(nacl)质量百分比为0.5％时，获得的芽孢数量为11.8×10⁸cfu/ml，芽孢数量最多。

本发明经多次不同量的测试，对实施例1、3、4进行实验，均取得了与实施例相同或相近似的结果，表明方法稳定、可靠，这里不再一一赘述。

本发明方法简单，操作方便，通过单因素实验和正交实验，优化了发酵培养基配方和培养条件，获得制备花生白绢病生防芽孢杆菌的发酵培养基配方和培养条件，降低了生产成本，成本降低30％以上，有效提高产芽孢数量，产芽孢数量提高45％以上，为该菌株的工业化发酵生产提供了技术基础，有显著的经济和社会效益。

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