酿酒酵母及其在制作果香型干红葡萄酒中的应用的制作方法

2021-02-02 18:02:01|

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本发明涉及一种干红葡萄酒的制作方法，尤其涉及一种利用酿酒酵母制作果香型干红葡萄酒，属于酿酒领域。

背景技术：

葡萄酒是以葡萄为原料酿造的一种果酒。其酒精度高于啤酒而低于白酒。葡萄酒主要由葡萄发酵酿造而成，因此酒中不但含有葡萄本身的多种营养成分，而且还具有在发酵过程中产生的多种丰富的营养成分，营养、保健作用明显。

在葡萄酒的生产工艺中，陈酿过程是决定酒品质好坏的重要环节。在陈酿过程中，葡萄酒醇香、口感谐调程度、柔顺程度等因素最终影响品质、口感。在葡萄酒行业中，葡萄酒的窖藏存是葡萄酒陈酿必须经过的一个途径。在陈酿过程中对于酒窖的温度、微生物环境、湿度、光线、震动有严格的要求。

此外，葡萄酒是酵母菌株互作生长和发展变化形成的多成分混合物，其中酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）是葡萄酒生产中的主要微生物，对酿造和窖藏之后的葡萄酒的风味及质量至关重要。葡萄酒发酵过程中，酵母负责将葡萄汁中的糖转化成酒精和co2，并代谢产生高级醇、酯、有机酸、醛类等物质，形成葡萄酒最重要的香气——发酵香（酒香、二类香气），与品种香（果香、一类香气）和陈酿香（三类香气）一起构成葡萄酒复杂而独特的风味。因此，酵母被称为“葡萄酒之父”。

葡萄酒发酵过程的酵母菌来源主要有三类：①葡萄表皮的野生酵母，成熟期葡萄糖分的渗出及浆果破损有效促进了酵母菌菌群的生长，增加了酵母菌数量和多样性；②酒厂环境和酿酒设备中的土著菌群，即长期发酵过程残存在酿造环境中的酵母菌；③人工接种的酵母。目前国内葡萄酒发酵绝大多数采用接种商业酵母的方式，商业酵母针对性不强，无法完全根据原料特色、工艺条件进行选择，也就很难酿造出充分体现原料特点的高端葡萄酒。除此之外，我国葡萄酒普遍存在果香型风味偏弱的问题。

葡萄酒中的主要果香呈味物质有酯类（乙酸酯类和脂肪酸乙酯类）、高级醇、有机酸、萜烯、黄酮类物质等，部分物质在葡萄原料中是潜在的，需要酵母代谢进行转化和激发。果香型酵母能充分发挥葡萄原料中的潜在香气，对酿造果香型葡萄酒是必不可少的。我国地大物博，酵母种类丰富，为果香型酵母的筛选带来了更多可能性。优质产区、优良葡萄的自然发酵过程更易获得高品质的酵母资源，因为环境条件已对酵母进行了自然选择，留存的都是发酵力和竞争力较强的酵母菌，从中可以分离获得更多的有用菌株。

技术实现要素：

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种酿酒酵母及其在制作果香型干红葡萄酒中的应用。

技术方案：为实现上述目的，本发明所述的一种酿酒酵母为ssf12酵母，该酵母已于2020年07月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为酿酒酵母saccharomycescerevisiae，保藏编号为cgmccno.20305，保藏地址为中国北京。

进一步地，所述ssf12酵母中的酯酶酶活为68.2mu/ml或以上、β-葡萄糖苷酶酶活为48.4mu/ml或以上、醇乙酰基转移酶酶活为6.28u/ml或以上。

一种利用所述酿酒酵母制作果香型干红葡萄酒的方法，包括以下步骤：

（s1）将新酿造的果香型葡萄酒原酒移入橡木桶，采用接种有酵母ssf12的黄泥严格密封橡木桶；

（s2）陈酿：将上述葡萄酒存放于恒温的酒窖内陈酿1-3年，酒窖温度控制在13～17℃之间。

进一步地，步骤（s1）中的所述黄泥每克含有10⁴~10⁶个酵母ssf12。

进一步地，步骤（s1）中所述的果香型葡萄酒原酒是通过将酵母ssf12接种至葡萄汁中得到的。

进一步地，所述葡萄汁为蛇龙珠、赤霞珠、品丽珠和/或黑比诺葡萄汁。

所述的酿酒酵母可应用于酿造果香型干红葡萄酒。

所述的酿酒酵母可应用于窖藏果香型干红葡萄酒。

有益效果：利用本发明所述的酿酒酵母制作果香型干红葡萄酒，可以有效提高呈果香味的物质含量以及感官评价。本发明所述酿酒酵母的发酵液中，果香关键酶酯酶、β-葡萄糖苷酶、醇乙酰基转移酶酶活分别可达68.2mu/ml、48.4mu/ml、6.28u/ml，比常见的商业活性干酵母es488（意大利enartis公司，常用于干红葡萄酒酿造）中的酯酶、β-葡萄糖苷酶、醇乙酰基转移酶的酶活分别高出13.2%、20.7%、18.5%，且发酵液中乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙醇、正己醇、正丙醇、乙醛等果香呈味物质含量均高于es488，感官评价发酵香较为浓郁，果香突出，评分高于es488。

附图说明

图1为酿酒酵母ssf12在wl营养液琼脂上的菌落形态。

具体实施方式

以下结合附图1对发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

酿酒酵母ssf12的分离、纯化与鉴定：

采自陕西省咸阳市的成熟蛇龙珠葡萄，破碎后转移至20l罐进行自然发酵（24-26℃），发酵5天后取发酵液，梯度稀释（10^-4、10^-5、10^-6、10^-7）涂布wl培养基，28℃培养7天，从中挑取生长较快、顶端奶油色且外圈蓝绿色、表面光滑、奶油状、不透明、呈锥形突起的菌株，经多次划线纯化后得到纯菌，即为窖藏和/或酿酒酵母ssf12。所用筛选培养基为wl营养琼脂（wallersteinlaboratorynutrientagar）培养基，其配制方法为：取800ml去离子水，加入酵母浸粉4.0g,胰蛋白胨5.0g，葡萄糖50.0g，kh2po40.55g，kcl0.425g，cacl20.125g，mgso40.125g，fecl30.0025g，mnso40.0025g，溴甲酚绿0.022g，琼脂20.0g，定容至1l，121℃灭菌20min。

提取所得酵母的基因组dna，进行26srdnad1/d2区序列的pcr扩增，引物为：

nl1（5’-gcatatcaataagcggaggaaaag-3’）；

nl4（5’-ggtccgtgtttcaagacgg-3’）。

pcr条件：95℃预变性5min；94℃1min，52℃1min，72℃，80s，35个循环；72℃延伸10min。pcr产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测无误后，进行测序，测序结果与ncbi数据库中的已有序列进行比对，确认菌株ssf12为窖藏和/或酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）。测序序列如下：

5’

cgggattgccttagttacggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggtaccttcggtgcccgagttgtaatttggagagggcaactttggggccgttccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtgtggcgaggagtgcggttctttgtaaagtgccttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatggtgttttgtgccctctgctccttgtgggtaggggaatctcgcatttcactgggccagcatcagttttggtggcaggataaatccataggaatgtagcttgcctcggtaagtattatagcctgtgggaatactgccagctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaaa-3’

酿酒酵母ssf12与商业酵母es488耐受性对比实验：

采用yepd培养基（酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1l）作为基础培养基，考察窖藏和/或酿酒酵母ssf12与商业酵母es488耐受性对比情况。其中糖耐受性测定中葡萄糖终浓度为200g/l、250g/l、300g/l、350g/l，酒精耐受性测定中乙醇终浓度为10%、12%、14%、16%，酸耐受性测定中柠檬酸终浓度为10g/l、15g/l、20g/l、25g/l，so2耐受性测定中so2终浓度为150mg/l、200mg/l、250mg/l、300mg/l。

结果表明，本发明的菌株ssf12与商品化窖藏酿酒酵母es488相比在糖、酸、so2耐受性方面更具优势，酒精耐受性相仿，故酿酒酵母ssf12具备制造高品质葡萄酒的潜力。

酿酒酵母ssf12与商业酵母es488酿酒效果对比实验：

挑取酿酒酵母ssf12一环，接种于灭菌的10mlyepd液体培养基中，25℃，150r/min振荡培养24h。取菌液1ml接种于另外的新鲜yepd液体培养基，25℃，150r/min振荡培养24h。取蛇龙珠葡萄汁100ml于250ml的三角瓶中，高压蒸汽灭菌后接入扩培的酵母，25℃，150r/min振荡培养24h制得种子液，按5%的接种量接种于含有0.025g/l果胶酶、1ml/lso2的3l蛇龙珠葡萄汁中。

称取0.626g果糖加入12.5ml的37℃温水中，搅拌均匀后加入1.25g商业酵母es488。搅拌，待形成洁白细腻的泡沫时，视为活化成功。将活化的商业酵母加入含有0.025g/l果胶酶、1ml/lso2的3l蛇龙珠葡萄汁中。

将两种葡萄汁24-26℃下发酵，定期测定co2失重、残糖量和酒精度，发酵完毕后（还原糖量小于4g/l，约需7d），4℃澄清12h，分别取上清和酵母。

酵母菌破壁后采用对硝基苯酚法测定酯酶活性、固相微萃取-气相色谱法测定醇乙酰基转移酶活性，发酵液中β-葡萄糖苷酶活性测定采用p-npg比色法。结果显示，ssf12的酯酶、β-葡萄糖苷酶、醇乙酰基转移酶酶活分别可达68.2mu/ml、48.4mu/ml、6.28u/ml，高于商业化果香酵母es488的60.2mu/ml、40.1mu/ml、5.30u/ml。

酶活具体测定方法如下：

酯酶酶活的测定：取发酵液5ml，加入等体积的玻璃珠破碎20min，5000×g、4℃离心15min留上清液得粗酶液。取860μl，ph5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液，100μl粗酶液与40μl的25mmp-npb混合均匀，在37℃条件下反应60min，然后加入100μl的0.5mol/l的naoh溶液终止反应。对照组用缓冲液代替粗酶液。每个样品3组平行，在400nm波长处测定吸光度。一个单位（u）酯酶活性定义为：37℃条件下，每分钟释放1μmol对硝基苯酚所需的酶量。

β-葡萄糖苷酶酶活的测定：取发酵液5ml于4℃，5000×g条件下离心5min，取100µl上清与200µl的5mmp-npg混匀，50℃保温30min，加入2ml、1mol/lna2co3终止反应并显色，于400nm下测定吸光值。一个单位（u）葡萄糖苷酶活性定义为：37℃条件下，每分钟释放1μmol对硝基苯酚所需的酶量。

醇乙酰基转移酶酶活的测定：反应体系1.5ml包含15mm苯乙醇，0.3mm乙酰辅酶a，tris-hcl缓冲50mm（ph7.0），适量的酶。整个反应混合物放在8ml具有盖子和垫子的样品瓶中，在30℃下保温反应1h后加入0.6gnacl停止反应，加入内标2-辛醇，使最终浓度为2.5mg/l。生成的产物乙酸苯乙酯用固相微萃取后进样，用气相色谱进行定性定量分析。一个单位（u）醇乙酰基转移酶活性定义为：每小时生成1.0mg/l乙酸苯乙酯所需的酶量。

采用固相微萃取-气相色谱法测定两酵母发酵上清液中香气物质含量，结果显示，ssf12发酵液中乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙醇、正己醇、正丙醇、乙醛等果香呈味物质含量分别为51.19mg/l、3.84mg/l、50.62mg/l、1.93mg/l、6.22mg/l、94.23mg/l、1.32mg/l、101.21mg/l、35.82mg/l，高于es488的46.61mg/l、1.17mg/l、42.13mg/l、0.60mg/l、3.65mg/l、45.07mg/l、0mg/l、86.55mg/l、7.61mg/l，可赋予葡萄酒更为浓郁的水果香气。

对ssf12和es488的发酵新酒进行专业的感官评价，邀请11位葡萄酒专家组成感官评价小组，参照gb/t15038-2006中香气评价方法进行感官品评。11名专家包括国家级葡萄酒品酒师2位，从事葡萄酒研究的教授、副教授4位，酿酒工程师2位，葡萄酒专业研究生3位，具有较高的权威性和合理性。品评人员对所试酒样给出评分取平均值后，ssf12得分86.72±1.38，es488得分80.89±2.35，ssf12的发酵香较为浓郁，果香突出，口感复杂，香气和口感优于es488的发酵酒样。

实验例，利用酿酒酵母ssf12的果香型干红葡萄酒的窖藏方法：（s1）将上述新酿造的葡萄酒原酒移入橡木桶，采用接种有窖藏和/或酿酒酵母ssf12的黄泥（接种量10⁵个/g黄泥）严格密封橡木桶；（s2）陈酿：将上述葡萄酒存放于恒温的酒窖内陈酿2年，该酒窖温度控制在13～17℃。

比较例，与实验例不同之处在于采用不含有酵母ssf12的黄泥严格密封橡木桶。

陈酿两年之后，检测黄泥中酵母ssf12的量约为10⁶个/g黄泥，由此说明本发明的酵母具有较强的生存能力。将窖藏之后的葡萄酒按照gb/t15038-2006中香气评价方法进行感官品评，实验例的窖藏酒得分为89.72±1.58，对比例的窖藏酒得分为87.36±1.83。

本发明酿酒酵母ssf12还应用于赤霞珠、品丽珠、黑比诺等品种的发酵以及发酵所生成的葡萄酒的窖藏，具有增强发酵酒果香风味的效果，因此也适用于这些品种的干红葡萄酒发酵和/或窖藏生产。

以上所述仅为发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>烟台张裕葡萄酿酒股份有限公司

<120>酿酒酵母及其在制作果香型干红葡萄酒中的应用

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