酿酒酵母及其在制作果香型干红葡萄酒中的应用的制作方法
本发明涉及一种干红葡萄酒的制作方法,尤其涉及一种利用酿酒酵母制作果香型干红葡萄酒,属于酿酒领域。
背景技术:
葡萄酒是以葡萄为原料酿造的一种果酒。其酒精度高于啤酒而低于白酒。葡萄酒主要由葡萄发酵酿造而成,因此酒中不但含有葡萄本身的多种营养成分,而且还具有在发酵过程中产生的多种丰富的营养成分,营养、保健作用明显。
在葡萄酒的生产工艺中,陈酿过程是决定酒品质好坏的重要环节。在陈酿过程中,葡萄酒醇香、口感谐调程度、柔顺程度等因素最终影响品质、口感。在葡萄酒行业中,葡萄酒的窖藏存是葡萄酒陈酿必须经过的一个途径。在陈酿过程中对于酒窖的温度、微生物环境、湿度、光线、震动有严格的要求。
此外,葡萄酒是酵母菌株互作生长和发展变化形成的多成分混合物,其中酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)是葡萄酒生产中的主要微生物,对酿造和窖藏之后的葡萄酒的风味及质量至关重要。葡萄酒发酵过程中,酵母负责将葡萄汁中的糖转化成酒精和co2,并代谢产生高级醇、酯、有机酸、醛类等物质,形成葡萄酒最重要的香气——发酵香(酒香、二类香气),与品种香(果香、一类香气)和陈酿香(三类香气)一起构成葡萄酒复杂而独特的风味。因此,酵母被称为“葡萄酒之父”。
葡萄酒发酵过程的酵母菌来源主要有三类:①葡萄表皮的野生酵母,成熟期葡萄糖分的渗出及浆果破损有效促进了酵母菌菌群的生长,增加了酵母菌数量和多样性;②酒厂环境和酿酒设备中的土著菌群,即长期发酵过程残存在酿造环境中的酵母菌;③人工接种的酵母。目前国内葡萄酒发酵绝大多数采用接种商业酵母的方式,商业酵母针对性不强,无法完全根据原料特色、工艺条件进行选择,也就很难酿造出充分体现原料特点的高端葡萄酒。除此之外,我国葡萄酒普遍存在果香型风味偏弱的问题。
葡萄酒中的主要果香呈味物质有酯类(乙酸酯类和脂肪酸乙酯类)、高级醇、有机酸、萜烯、黄酮类物质等,部分物质在葡萄原料中是潜在的,需要酵母代谢进行转化和激发。果香型酵母能充分发挥葡萄原料中的潜在香气,对酿造果香型葡萄酒是必不可少的。我国地大物博,酵母种类丰富,为果香型酵母的筛选带来了更多可能性。优质产区、优良葡萄的自然发酵过程更易获得高品质的酵母资源,因为环境条件已对酵母进行了自然选择,留存的都是发酵力和竞争力较强的酵母菌,从中可以分离获得更多的有用菌株。
技术实现要素:
发明目的:为了克服现有技术中存在的不足,本发明提供一种酿酒酵母及其在制作果香型干红葡萄酒中的应用。
技术方案:为实现上述目的,本发明所述的一种酿酒酵母为ssf12酵母,该酵母已于2020年07月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,分类命名为酿酒酵母saccharomycescerevisiae,保藏编号为cgmccno.20305,保藏地址为中国北京。
进一步地,所述ssf12酵母中的酯酶酶活为68.2mu/ml或以上、β-葡萄糖苷酶酶活为48.4mu/ml或以上、醇乙酰基转移酶酶活为6.28u/ml或以上。
一种利用所述酿酒酵母制作果香型干红葡萄酒的方法,包括以下步骤:
(s1)将新酿造的果香型葡萄酒原酒移入橡木桶,采用接种有酵母ssf12的黄泥严格密封橡木桶;
(s2)陈酿:将上述葡萄酒存放于恒温的酒窖内陈酿1-3年,酒窖温度控制在13~17℃之间。
进一步地,步骤(s1)中的所述黄泥每克含有104~106个酵母ssf12。
进一步地,步骤(s1)中所述的果香型葡萄酒原酒是通过将酵母ssf12接种至葡萄汁中得到的。
进一步地,所述葡萄汁为蛇龙珠、赤霞珠、品丽珠和/或黑比诺葡萄汁。
所述的酿酒酵母可应用于酿造果香型干红葡萄酒。
所述的酿酒酵母可应用于窖藏果香型干红葡萄酒。
有益效果:利用本发明所述的酿酒酵母制作果香型干红葡萄酒,可以有效提高呈果香味的物质含量以及感官评价。本发明所述酿酒酵母的发酵液中,果香关键酶酯酶、β-葡萄糖苷酶、醇乙酰基转移酶酶活分别可达68.2mu/ml、48.4mu/ml、6.28u/ml,比常见的商业活性干酵母es488(意大利enartis公司,常用于干红葡萄酒酿造)中的酯酶、β-葡萄糖苷酶、醇乙酰基转移酶的酶活分别高出13.2%、20.7%、18.5%,且发酵液中乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙醇、正己醇、正丙醇、乙醛等果香呈味物质含量均高于es488,感官评价发酵香较为浓郁,果香突出,评分高于es488。
附图说明
图1为酿酒酵母ssf12在wl营养液琼脂上的菌落形态。
具体实施方式
以下结合附图1对发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
如无特殊说明,本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品,均可以通过商业渠道购买获得。
酿酒酵母ssf12的分离、纯化与鉴定:
采自陕西省咸阳市的成熟蛇龙珠葡萄,破碎后转移至20l罐进行自然发酵(24-26℃),发酵5天后取发酵液,梯度稀释(10-4、10-5、10-6、10-7)涂布wl培养基,28℃培养7天,从中挑取生长较快、顶端奶油色且外圈蓝绿色、表面光滑、奶油状、不透明、呈锥形突起的菌株,经多次划线纯化后得到纯菌,即为窖藏和/或酿酒酵母ssf12。所用筛选培养基为wl营养琼脂(wallersteinlaboratorynutrientagar)培养基,其配制方法为:取800ml去离子水,加入酵母浸粉4.0g,胰蛋白胨5.0g,葡萄糖50.0g,kh2po40.55g,kcl0.425g,cacl20.125g,mgso40.125g,fecl30.0025g,mnso40.0025g,溴甲酚绿0.022g,琼脂20.0g,定容至1l,121℃灭菌20min。
提取所得酵母的基因组dna,进行26srdnad1/d2区序列的pcr扩增,引物为:
nl1(5’-gcatatcaataagcggaggaaaag-3’);
nl4(5’-ggtccgtgtttcaagacgg-3’)。
pcr条件:95℃预变性5min;94℃1min,52℃1min,72℃,80s,35个循环;72℃延伸10min。pcr产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测无误后,进行测序,测序结果与ncbi数据库中的已有序列进行比对,确认菌株ssf12为窖藏和/或酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)。测序序列如下:
5’
cgggattgccttagttacggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggtaccttcggtgcccgagttgtaatttggagagggcaactttggggccgttccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtgtggcgaggagtgcggttctttgtaaagtgccttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatggtgttttgtgccctctgctccttgtgggtaggggaatctcgcatttcactgggccagcatcagttttggtggcaggataaatccataggaatgtagcttgcctcggtaagtattatagcctgtgggaatactgccagctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaaa-3’
酿酒酵母ssf12与商业酵母es488耐受性对比实验:
采用yepd培养基(酵母粉10g,蛋白胨20g,葡萄糖20g,蒸馏水1l)作为基础培养基,考察窖藏和/或酿酒酵母ssf12与商业酵母es488耐受性对比情况。其中糖耐受性测定中葡萄糖终浓度为200g/l、250g/l、300g/l、350g/l,酒精耐受性测定中乙醇终浓度为10%、12%、14%、16%,酸耐受性测定中柠檬酸终浓度为10g/l、15g/l、20g/l、25g/l,so2耐受性测定中so2终浓度为150mg/l、200mg/l、250mg/l、300mg/l。
结果表明,本发明的菌株ssf12与商品化窖藏酿酒酵母es488相比在糖、酸、so2耐受性方面更具优势,酒精耐受性相仿,故酿酒酵母ssf12具备制造高品质葡萄酒的潜力。
酿酒酵母ssf12与商业酵母es488酿酒效果对比实验:
挑取酿酒酵母ssf12一环,接种于灭菌的10mlyepd液体培养基中,25℃,150r/min振荡培养24h。取菌液1ml接种于另外的新鲜yepd液体培养基,25℃,150r/min振荡培养24h。取蛇龙珠葡萄汁100ml于250ml的三角瓶中,高压蒸汽灭菌后接入扩培的酵母,25℃,150r/min振荡培养24h制得种子液,按5%的接种量接种于含有0.025g/l果胶酶、1ml/lso2的3l蛇龙珠葡萄汁中。
称取0.626g果糖加入12.5ml的37℃温水中,搅拌均匀后加入1.25g商业酵母es488。搅拌,待形成洁白细腻的泡沫时,视为活化成功。将活化的商业酵母加入含有0.025g/l果胶酶、1ml/lso2的3l蛇龙珠葡萄汁中。
将两种葡萄汁24-26℃下发酵,定期测定co2失重、残糖量和酒精度,发酵完毕后(还原糖量小于4g/l,约需7d),4℃澄清12h,分别取上清和酵母。
酵母菌破壁后采用对硝基苯酚法测定酯酶活性、固相微萃取-气相色谱法测定醇乙酰基转移酶活性,发酵液中β-葡萄糖苷酶活性测定采用p-npg比色法。结果显示,ssf12的酯酶、β-葡萄糖苷酶、醇乙酰基转移酶酶活分别可达68.2mu/ml、48.4mu/ml、6.28u/ml,高于商业化果香酵母es488的60.2mu/ml、40.1mu/ml、5.30u/ml。
酶活具体测定方法如下:
酯酶酶活的测定:取发酵液5ml,加入等体积的玻璃珠破碎20min,5000×g、4℃离心15min留上清液得粗酶液。取860μl,ph5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液,100μl粗酶液与40μl的25mmp-npb混合均匀,在37℃条件下反应60min,然后加入100μl的0.5mol/l的naoh溶液终止反应。对照组用缓冲液代替粗酶液。每个样品3组平行,在400nm波长处测定吸光度。一个单位(u)酯酶活性定义为:37℃条件下,每分钟释放1μmol对硝基苯酚所需的酶量。
β-葡萄糖苷酶酶活的测定:取发酵液5ml于4℃,5000×g条件下离心5min,取100µl上清与200µl的5mmp-npg混匀,50℃保温30min,加入2ml、1mol/lna2co3终止反应并显色,于400nm下测定吸光值。一个单位(u)葡萄糖苷酶活性定义为:37℃条件下,每分钟释放1μmol对硝基苯酚所需的酶量。
醇乙酰基转移酶酶活的测定:反应体系1.5ml包含15mm苯乙醇,0.3mm乙酰辅酶a,tris-hcl缓冲50mm(ph7.0),适量的酶。整个反应混合物放在8ml具有盖子和垫子的样品瓶中,在30℃下保温反应1h后加入0.6gnacl停止反应,加入内标2-辛醇,使最终浓度为2.5mg/l。生成的产物乙酸苯乙酯用固相微萃取后进样,用气相色谱进行定性定量分析。一个单位(u)醇乙酰基转移酶活性定义为:每小时生成1.0mg/l乙酸苯乙酯所需的酶量。
采用固相微萃取-气相色谱法测定两酵母发酵上清液中香气物质含量,结果显示,ssf12发酵液中乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙醇、正己醇、正丙醇、乙醛等果香呈味物质含量分别为51.19mg/l、3.84mg/l、50.62mg/l、1.93mg/l、6.22mg/l、94.23mg/l、1.32mg/l、101.21mg/l、35.82mg/l,高于es488的46.61mg/l、1.17mg/l、42.13mg/l、0.60mg/l、3.65mg/l、45.07mg/l、0mg/l、86.55mg/l、7.61mg/l,可赋予葡萄酒更为浓郁的水果香气。
对ssf12和es488的发酵新酒进行专业的感官评价,邀请11位葡萄酒专家组成感官评价小组,参照gb/t15038-2006中香气评价方法进行感官品评。11名专家包括国家级葡萄酒品酒师2位,从事葡萄酒研究的教授、副教授4位,酿酒工程师2位,葡萄酒专业研究生3位,具有较高的权威性和合理性。品评人员对所试酒样给出评分取平均值后,ssf12得分86.72±1.38,es488得分80.89±2.35,ssf12的发酵香较为浓郁,果香突出,口感复杂,香气和口感优于es488的发酵酒样。
实验例,利用酿酒酵母ssf12的果香型干红葡萄酒的窖藏方法:(s1)将上述新酿造的葡萄酒原酒移入橡木桶,采用接种有窖藏和/或酿酒酵母ssf12的黄泥(接种量105个/g黄泥)严格密封橡木桶;(s2)陈酿:将上述葡萄酒存放于恒温的酒窖内陈酿2年,该酒窖温度控制在13~17℃。
比较例,与实验例不同之处在于采用不含有酵母ssf12的黄泥严格密封橡木桶。
陈酿两年之后,检测黄泥中酵母ssf12的量约为106个/g黄泥,由此说明本发明的酵母具有较强的生存能力。将窖藏之后的葡萄酒按照gb/t15038-2006中香气评价方法进行感官品评,实验例的窖藏酒得分为89.72±1.58,对比例的窖藏酒得分为87.36±1.83。
本发明酿酒酵母ssf12还应用于赤霞珠、品丽珠、黑比诺等品种的发酵以及发酵所生成的葡萄酒的窖藏,具有增强发酵酒果香风味的效果,因此也适用于这些品种的干红葡萄酒发酵和/或窖藏生产。
以上所述仅为发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>烟台张裕葡萄酿酒股份有限公司
<120>酿酒酵母及其在制作果香型干红葡萄酒中的应用
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<213>酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)
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cttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtgtggcgaggagtgcggttctttgt180
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atctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatga300
aaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttg360
atcagacatggtgttttgtgccctctgctccttgtgggtaggggaatctcgcatttcact420
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gctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaaa575
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