胚胎干细胞向CD34+造血祖细胞的分化方法与流程

2021-02-02 18:02:31|

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本发明属于细胞分化培养领域，具体地涉及胚胎干细胞向cd34+造血祖细胞的分化及培养。

背景技术：

胚胎干细胞(esc)是一种高度未分化细胞，具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。胚胎干细胞(esc)也具有多能性，具有通过细胞分化成多种组织的能力。胚胎干细胞最诱人的前景和用途是生产细胞和组织用于“细胞疗法”，为细胞移植提供无免疫原性的材料。现今已从esc细胞诱导分化出心肌细胞、骨细胞、软骨细胞、肝细胞、造血细胞、脂肪细胞、胰岛素细胞、神经细胞、内皮细胞等。这些诱导后的细胞有望为器官移植、损伤器官的修复提供原材料，因而具有十分广阔的临床应用前景。

cd34分子属于钙黏蛋白家族，其选择性地表达于人类及其他哺乳动物造血干/祖细胞(hematopieticstem/progenitorcell，hsc/hpc)表面，并随细胞的成熟逐渐减弱至消失。cd34抗原在造血祖细胞的分化过程中起着某种调节作用，cd34+造血祖细胞可以重建并维持机体的正常造血。

胚胎干细胞定向分化成造血祖细胞，为获得临床上治疗用造血祖细胞，尤其是cd34+造血祖细胞提供了可能性。但是目前采用的方法获得的造血细胞数量有限，而且获得的造血细胞纯度不够，常常需要胎牛血清维持小鼠基质细胞生长和实现分化，血清和基质细胞都属于组成复杂的异源成分，而且使用高浓度的造血相关的细胞因子，导致造血祖细胞的分化产生重复性低，限制了工业化生产造血祖细胞，及其在临床上的应用。

例如，目前现有技术中从胚胎干细胞(esc)向cd34+造血祖细胞的分化方法主要有以下两种：(1)拟胚体(eb)分化法，这种方法的缺陷是分化过程中常用到低氧环境，操作不便，eb形成过程中细胞损失过多或eb间黏连严重，分化效率较低；以及(2)与op9细胞(小鼠骨髓基质细胞)共培养分化法，这种方法的缺陷是含有异种来源的细胞，还需要采用低氧环境，操作较为复杂，技术要求高。

因此，亟待改进现有eb分化技术方案的缺陷，从而获得从胚胎干细胞(esc)向cd34+造血祖细胞操作简单，纯度较高的分化。

技术实现要素：

本发明提供了一种改进的拟胚体(eb)分化系统，所述分化系统能够使拟胚体(eb)在常氧、无异种来源细胞的条件下向cd34+造血祖细胞的分化。本发明还提供了利用改进的拟胚体(eb)分化系统对所述拟胚体(eb)进行分化培养的方法，实现了拟胚体(eb)的高效形成，而且克服了拟胚体(eb)分化球易粘连的问题。

第一方面，本发明提供了一种改进的拟胚体(eb)分化系统，所述分化系统包括以下成分：

(1)eb形成培养基，所述eb形成培养基是在完全限定stemlineii培养基中另外添加选自y-27632，hbmp-4，hbfgf和hvegf中的一种或几种；和

(2)中胚层分化培养基，所述中胚层分化培养基是在完全限定stemlineii培养基中另外添加选自hbmp-4，hbfgf和hvegf中的一种或几种。

在一些实施方案中，所述eb形成培养基还包含选自mtg，its和vc中的一种或几种成分。所述mtg的浓度在350-450μm的范围内，优选为400μm。所述vc的浓度在45-55μg/ml的范围内，优选为50μg/ml。

在一些实施方案中，所述中胚层分化培养基还包含选自mtg，its和vc中的一种或几种成分。所述mtg的浓度在350-450μm的范围内，优选为400μm。所述vc的浓度在45-55μg/ml的范围内，优选为50μg/ml。

在一些实施方案中，所述eb形成培养基中y-27632的浓度在8-12μm的范围内，优选为10μm；所述hbmp-4的浓度在35-45ng/ml的范围内，优选为40ng/ml；所述hbfgf的浓度在45-55ng/ml的范围内，优选为50ng/ml；所述hvegf的浓度在45-55ng/ml的范围内，优选为50ng/ml。

在一些实施方案中，所述中胚层分化培养基中，所述hbmp-4的浓度在35-45ng/ml的范围内，优选为40ng/ml；所述hbfgf的浓度在45-55ng/ml的范围内，优选为50ng/ml；所述hvegf的浓度在45-55ng/ml的范围内，优选为50ng/ml。

使用改进成分配方的eb形成培养基和中胚层分化培养基，拟胚体(eb)可以实现在常氧、无异种来源细胞的条件下向cd34+造血祖细胞的分化。

优选地，所述eb形成培养基和所述中胚层分化培养基用于eb的悬浮培养。

在一些实施方案中，所述分化系统还包括aggrewell培养板，优选地还包含抗黏附清洗液(anti-adherencerinsingsolution)，可以去除aggrewell培养板微孔中的气泡。aggrewell是悬浮培养的专用培养容器。这个板子为24孔板，每孔底部有300个微孔，加入多能干细胞离心后使细胞聚集在微孔中，形成大小均一的细胞团。

在一些实施方案中，所述分化系统还包括sb431542(tocris)，优选地所述sb431542的添加浓度为4-8μm，优选为6μm。

在一些实施方案中，所述分化系统还包括祖细胞分化培养基-1，所述祖细胞分化培养基-1是在完全限定stemlineii中另外添加选自hbfgf，hvegf和hscf中的一种或者多种成分。优选地，所述祖细胞分化培养基-1还另外添加选自its，vc和mtg的一种或者多种成分。优选地，所述hbfgf的浓度在45-55ng/ml的范围内，优选为50ng/ml；所述hvegf的浓度在45-55ng/ml的范围内，优选为50ng/ml；所述scf的浓度在45-55ng/ml的范围内，优选为50ng/ml。所述mtg的浓度在350-450μm的范围内，优选为400μm。所述vc的浓度在45-55μg/ml的范围内，优选为50μg/ml。

在一些实施方案中，所述分化系统还包括祖细胞分化培养基-2，所述祖细胞分化培养基-2是在完全限定stemlineii中另外添加选自hbfgf，hvegf，hscf，mtg，flt3l和tpo中的一种或者多种成分。优选地，所述祖细胞分化培养基-2还另外添加选自its，vc和mtg中的一种或者多种成分。优选地，所述hbfgf的浓度在45-55ng/ml的范围内，优选为50ng/ml；所述vegf的浓度在45-55ng/ml的范围内，优选为50ng/ml；所述scf的浓度在45-55ng/ml的范围内，优选为50ng/ml；所述mtg的浓度在350-450μm的范围内，优选为400μm；所述flt3l在8-12ng/ml的范围内，优选为10ng/ml；所述tpo在25-35ng/ml的范围内，优选为30ng/ml。所述vc的浓度在45-55μg/ml的范围内，优选为50μg/ml。

优选地，所述拟胚体(eb)获自胚胎干细胞(esc)或诱导多能干细胞(ips)。在这种情况下，所述分化系统还包含esc或ips培养基，优选地还包含accutase(stemcell)，用于对贴壁培养的细胞进行消化获得单细胞悬浮液。

第二方面，本发明提供了利用第一方面的改进的拟胚体(eb)分化系统对拟胚体(eb)进行分化培养的方法，所述方法在常氧培养条件下进行。

优选地，所述常氧培养条件是在5％二氧化碳和空气的条件下进行，氧含量为大约20％。

在一些实施方案中，所述分化培养包括以下步骤：

(1)利用拟胚体(eb)形成培养基形成拟胚体(eb)；

(2)利用中胚层分化培养基培养步骤(1)获得的拟胚体(eb)；

(3)利用祖细胞分化培养基-1培养步骤(2)获得的拟胚体(eb)；以及

(4)利用祖细胞分化培养基-2培养步骤(3)获得的拟胚体(eb)，

其中所述eb形成培养基是在完全限定stemlineii培养基中另外添加选自y-27632，hbmp-4，hbfgf和hvegf中的一种或几种；所述中胚层分化培养基是在stemlineii培养基中另外添加选自hbmp-4，hbfgf和hvegf中的一种或几种。

使用改进成分配方的eb形成培养基和中胚层分化培养基，拟胚体(eb)可以实现在常氧、无异种来源细胞的条件下向cd34+造血祖细胞的分化。

优选地，所述eb形成培养基和所述中胚层分化培养基用于eb的悬浮培养。

在一些实施方案中，在步骤(1)中，采用aggrewell培养板进行培养，优选地在利用aggrewell培养板进行培养前，用抗黏附清洗液(anti-adherencerinsingsolution)对aggrewell培养板进行进行预处理，以去除aggrewell培养板微孔中的气泡。aggrewell是悬浮培养的专用培养容器。这个板子为24孔板，每孔底部有300个微孔，加入多能干细胞离心后使细胞聚集在微孔中，形成大小均一的细胞团。

优选地，在步骤(1)中，以8×10⁵个细胞/孔的密度将细胞悬液接种于aggrewell中，100g离心3min使细胞聚集于微孔中，37℃，5％co2培养箱中培养过夜，常氧条件，不采用低氧条件。

在一些实施方案中，在步骤(2)中，还包括在中胚层分化培养基中添加sb431542(tocris)的步骤，优选地所述sb431542的添加浓度为4-8μm，优选为6μm。优选地，在进行步骤(2)的第2天添加sb431542(tocris)，第3天进行半换液。

在一些实施方案中，在步骤(2)中，采用aggrewell培养板进行培养。

在一些实施方案中，所述祖细胞分化培养基-1是在完全限定stemlineii培养基中另外添加选自hbfgf，hvegf和hscf中的一种或者多种成分。优选地，所述祖细胞分化培养基-1还另外添加选自its，vc和mtg的一种或者多种成分。优选地，所述hbfgf的浓度在45-55ng/ml的范围内，优选为50ng/ml；所述vegf的浓度在45-55ng/ml的范围内，优选为50ng/ml；所述scf的浓度在45-55ng/ml的范围内，优选为50ng/ml。所述mtg的浓度在350-450μm的范围内，优选为400μm。所述vc的浓度在45-55μg/ml的范围内，优选为50μg/ml。

在一些实施方案中，所述祖细胞分化培养基-2是在完全限定stemlineii培养基中另外添加选自hbfgf，hvegf，hscf，mtgflt3l和tpo的一种或者多种成分。优选地，所述祖细胞分化培养基-2还另外添加选自its，vc和mtg中的一种或者多种成分。优选地，所述hbfgf的浓度在45-55ng/ml的范围内，优选为50ng/ml；所述vegf的浓度在45-55ng/ml的范围内，优选为50ng/ml；所述scf的浓度在45-55ng/ml的范围内，优选为50ng/ml；所述mtg的浓度在350-450μm的范围内，优选为400μm；所述flt3l在8-12ng/ml的范围内，优选为10ng/ml；所述tpo在25-35ng/ml的范围内，优选为30ng/ml。所述vc的浓度在45-55μg/ml的范围内，优选为50μg/ml。

优选地，所述步骤(3)中使用祖细胞分化培养基-1在低吸附6孔板中(corning)置于轨道摇床上(80-120rpm)，于37℃，5％co2培养箱中进行动态培养，不采用低氧条件。

优选地，所述步骤(3)中使用祖细胞分化培养基-2在低吸附6孔板中(corning)置于轨道摇床上(80-120rpm)，于37℃，5％co2培养箱中进行动态培养，不采用低氧条件。

在一些实施方案中，步骤(1)中获得的eb的粒径为232.22±15.13(μm)；步骤(2)获得的eb的粒径为236.41±22.85(μm)。

本发明的方法的步骤(2)aggrewell中的细胞消化后细胞存活率在94％以上。本发明的方法的步骤(2)获得的eb中胚层markerpdgfrα、flk1比率检测显示，flk1阳性率为3.70％，pdgfr为阴性。步骤(3)的低吸附6孔板中的细胞团消化后细胞存活率在78％以上，造血祖细胞markercd34比率检测结果显示阳性率在17％以上。

第三方面，本发明提供了一种eb形成培养基，所述eb形成培养基是在stemdiff^tmapel^tm2培养基中另外添加选自y-27632，hbmp-4，hbfgf和hvegf中的一种或几种。

第四方面，本发明提供了一种中胚层分化培养基，所述中胚层分化培养基是在完全限定stemlineii培养基中另外添加选自hbmp-4，hbfgf和hvegf中的一种或几种。

在一些实施方案中，所述中胚层分化培养基还包含选自mtg，its和vc中的一种或几种成分。所述mtg的浓度，优选为50μg/ml在350-450μm的范围内，优选为400μm。所述vc的浓度在45-55μg/ml的范围内，优选为50μg/ml。

在上述第一至第四方面中，所述完全限定stemlineii培养基为stemdiff^tmapel^tm2培养基或stempro34培养基。

拟胚体(eb)是由胚胎干细胞(es)或诱导多能干细胞(ips)在体外一定的培养条件下形成的，具有内、中、外三胚层结构，形态学上与哺乳动物早期的胚胎发育阶段有着很高相似度的一种球状结构，称为拟胚体(embryoidbodies，eb，ebs)。

stemdiff^tmapel^tm2培养基是用于分化人胚胎干细胞(es)和诱导多能干细胞(ips)的完全限定培养基，是无血清和无动物成分的培养基。在本发明中使用该培养基作为基础培养基。

sb431542是一种小分子化合物，是一种有效的，选择性的间变性淋巴瘤激酶5/转化生长因子-βi型受体(alk5/tgf-βtypeireceptor)抑制剂。

y-27632是rock1抑制剂。

hbmp-4是人骨生成素-4。

its(insulin、transferrin、selenium，即胰岛素、转铁蛋白、硒)是一种细胞培养添加物。

stempro34培养基，是一种无血清，化学成分确定的完全限定培养基。在本发明中使用该培养基作为基础培养基。

hbfgf是人碱性成纤维细胞生长因子。

hvegf是人血管内皮生长因子。

hscf是人干细胞生长因子。

flt3l是fms样酪氨酸激酶3配体.

tpo是促血小板生成素。

附图说明

附图1显示了实施例1中的eb在分化过程中随时间的形态变化。

附图2显示了实施例1中第4天时中胚层markerpdgfr与flk1的比率检测结果。

图3显示了实施例1中第12天时造血祖细胞markercd34的比率检测结果。

图4显示了实施例2中第1天(d1)-第4天(d4)不同分化培养基条件下eb的形态变化。

图5显示了实施例2中第4天(d4)-第12天(d12)不同分化培养基条件下eb的形态变化。

图6显示了实施例2中第4天(d4)不同分化培养基条件下中胚层的流式检测结果。

图7显示了实施例2中第4天(d4)不同分化培养基条件下中胚层的rt-pcr检测结果。

图8显示了实施例2中第12天(d12)不同分化培养基条件下cd34+造血祖细胞的流式检测结果。

图9显示了实施例3中静态体系进行h9向造血祖细胞分化的结果。

图10显示了实施例3中静态体系进行h1向造血祖细胞分化的结果。

图11显示了实施例3中静态体系第4天(d4)分化中胚层的rt-pcr的检测结果。

图12显示了实施例3中静态体系分化第10天(d10)造血祖细胞的流式检测结果。

具体实施例

以下所述的是本发明的优选实施方式，本发明所保护的不限于以下优选实施方式。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。所用试剂未注明生产商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1h9向造血祖细胞的分化

一、实验材料

细胞：人胚胎干细胞h9；

试剂：mtesr1basalmedium、stemdiff^tmapel^tm2medium、stempro^tm-34sfm、accutase、matrigel、pbs、sb431542、bmp4、hbfgf、hvegf、y27632、scf、mtg、flt3l、tpo；

抗体：apc抗人cd140a(pdgfrα)抗体(biolegend)；

cd309(flk1单克隆抗体(avas12a1)，pe(ebioscience)；

cd34单克隆抗体(4h11)，fitc(ebioscience)；

设备：细胞培养箱(thermo150i)、超净工作台(苏州安泰)、beckman离心机(x-15r)、细胞计数仪(countstar)、倒置显微镜(leicadmilled)、轨道摇床(chemglass)、4℃冰箱(海尔hyc390)、-20℃冰箱(海尔)、负压吸引器(鱼跃)、移液枪(eppendorf)、制冰机

二、实验方法

1.esc细胞(h9细胞系)的准备

将细胞以1.8×10⁵个细胞/孔的密度传代至matrigel包被的6孔板(corning)中，将细胞置于37℃，5％co2培养箱中进行贴壁培养。待细胞融合度达到70％-90％时，使用accutase(stemcell)对细胞进行消化，得到单细胞悬浮液。

2.eb形成(第0-第1天(d0-d1))

eb形成培养基：stemdiff^tmapel^tm2medium，y-27632(10μm)，hbmp-4(40ng/ml)，hbfgf(50ng/ml)，vegf(50ng/ml)，mtg(硫代甘油，400μm)，its，vc(50μg/ml)；

aggrewell预处理：以500μl/孔向aggrewell中添加抗黏附清洗液(anti-adherencerinsingsolution(stemcell))，1300g离心5min以去除微孔中的气泡；

吸弃aggrewell中的清洗液，将h9细胞重悬于eb形成培养基，以8×10⁵个细胞/孔的密度接种于aggrewell中，100g离心3min使细胞聚集于微孔中，37℃，5％co2培养箱中培养过夜，次日观察eb的形成情况，进行粒径统计。

3.中胚层分化(第1-第4天(d1-d4))

中胚层分化培养基：stemdiff^tmapel^tm2medium,its,vc,hbmp-4(40ng/ml),hbfgf(50ng/ml),vegf(50ng/ml),mtg(400μm)

小心吸弃旧培养基，更换为中胚层分化培养基，第2天(d2)添加6μmsb431542(tocris)，第3天(d3)进行半换液(含6μmsb431542)。

4.造血祖细胞分化阶段-1(第4天-第6天(d4-d6))

祖细胞分化培养基-1：stempro34medium，its，vc，50ng/mlhbfgf，50ng/mlhvegf，50ng/mlscf，400μmmtg；

使用5ml巴氏吸管小心吸出aggrewell板中的eb球，通过37μm可逆滤器(stemcell)，翻转可逆滤器，使用pbs收集eb球至新的15ml离心管中(每4孔aggrewell中的eb收集至1个离心管中)，200g离心4min，弃上清，使用5.5ml祖细胞分化培养基-1重悬eb，转移至低吸附6孔板中(corning)，6孔板置于轨道摇床上(100rpm)，于37℃，5％co2培养箱中动态培养。

5.造血祖细胞分化阶段-2(d6-d12)

祖细胞分化培养基-2：stempro34medium,its,vc,50ng/mlhbfgf,50ng/mlvegf,50ng/mlscf,400μmmtg,10ng/mlflt3l,30ng/mltpo

使用5ml巴氏吸管小心吸出低吸附6孔板中的eb球，通过37μm可逆滤器(stemcell)，翻转可逆滤器，使用pbs收集eb球至新的15ml离心管中，200g离心4min，弃上清，使用5.5ml祖细胞分化培养基-2重悬eb，转移至新的低吸附6孔板中(corning)，6孔板置于轨道摇床上(100rpm)，于37℃，5％co2培养箱中动态培养，隔天换液。

6.消化eb

使用5ml巴氏吸管小心吸出aggrewell板中的eb球，通过37μm可逆滤器(stemcell)，翻转可逆滤器，使用pbs收集eb球至新的15ml离心管中，200g离心4min，弃上清。加入2mltryple(gibco)，37℃水浴摇晃防止细胞团聚集，消化30min，加入2ml含血清的αmem培养基终止消化，200g离心4min，弃上清，1mlpbs重悬计数。

7.流式检测中胚层markerpdgfrα、flk1比率

取1.2×10⁶个eb细胞，用300μlstainbuffer重悬，平均分成3份(分为unstain，isotype与stain三组)，stain组加入5μlpdgfrα、flk1抗体；isotype组加入对应的isotype；unstain不做处理，室温避光孵育1h，用1mlstainbuffer洗两遍，200μlstainbuffer重悬，使用bdfacsverse进行检测。

8.流式检测造血祖细胞的标记物cd34的比率

取1.2×10⁶个细胞，300μlstainbuffer重悬，平均分成3份(分为unstain，isotype与stain组)，stain组加入5μlcd34单克隆抗体，fitc；isotype组加入对应的isotype；unstain不做处理，室温避光孵育1h，用1mlstainbuffer洗两遍，200μlstainbuffer重悬，使用bdfacsverse进行检测。

三、实验结果

1.分化过程中eb的形态变化参见附图1。第1天(d1)eb的粒径为232.22±15.13(μm)，第4天(d4)的粒径为236.41±22.85(μm)；

2.第4天(d4)的分化细胞消化情况：2孔aggrewell中的细胞消化后细胞存活率94.97％，活细胞数为1.96×10⁶；

3.第4天(d4)中胚层markerpdgfrα、flk1的比率检测结果：flk1阳性率为3.70％，pdgfr为阴性，参见图2；

4.第12天(d12)分化细胞的消化情况：1孔低吸附六孔板中的细胞团消化后细胞存活率为78.23％，活细胞数为1.24×10⁶个细胞；

5.第12天(d12)造血祖细胞标记物cd34的比率检测结果：阳性率为17.65％，参见附图3。

实施例2第1天-第4天(d1-d4)不同培养基对造血祖细胞分化的影响

一、实验材料

细胞：人胚胎干细胞h9；

试剂：mtesr1basalmedium、stemdiff^tmapel^tm2medium、stempro^tm-34sfm、accutase、matrigel、pbs、sb431542、bmp4、hbfgf、hvegf、y27632、scf、mtg、flt3l、tpo；

抗体：apc抗人cd140a(pdgfrα)抗体(biolegend)；cd309(flk1)单克隆抗体(avas12a1)，pe(ebioscience)；

cd34单克隆抗体(4h11)，fitc(ebioscience)；

二、实验方法

根据第1-第4天(d1～d4)的培养基不同分为如下4组：

表1

注：apel即stemdiff^tmapel^tm2medium

具体实验方法参照实施例1。

三、实验结果

1.分化过程中各组第1天-第4天(d1-d4)eb形态变化参见附图4。4组eb球粒径均较大，d1-k1组粒径最小。粒径统计结果参见表2。各组eb的形态相似，无明显差异；

2.分化过程中各组第4天-第12天(d4～d12)的eb形态变化参见表2。k1在培养过程中细胞团散落，细胞团大小不一，未观察到明显空泡，k2～k4在第12天(d12)均有空泡形成，k2空泡最为明显，各组培养过程中均未出现黏连；

3.第4天(d4)对eb进行消化，4组细胞存活率均较高，活细胞较多，参见附图5。对中胚层markerpdgfrα、flk1进行检测，流式检测结果显示flk1阳性率均低，约3％，pdgfrk1～k3均为阴性，k4阳性率为4.55％，4组均无双阳性细胞，参见表3。通过rt-pcr对中胚层相关基因进行检测，结果显示相对于分化初始细胞h9，k3组阳性指标pdgfr、mixl1、kdr、t在第4天(d4)均有明显上升，阴性指标oct4明显下降。k3组各指标中，pdgfr上升最明显，上升50倍以上。其余各个指标综合表现不佳，参见附图6。

4.第12天(d12)对eb进行消化，4组细胞存活率均较高，活细胞较多，参见附图7。对造血祖细胞标记物cd34进行流式检测，参见附图8，结果显示k1组cd34为阴性，cd34阳性率k3>k4>k2，k3组阳性率最高达17.65％；

综上所述，k3组分化效果较其他组好，分化效率较高，达17.65％。

表2第1天(d1)-第4天(d4)不同分化培养基条件下eb的粒径统计

表3第4天(d4)和第12天(d12)经消化后的eb细胞存活率统计

实施例3.静态体系下h9或h1向造血祖细胞的分化

一、实验材料

细胞：人胚胎干细胞h9，h1；

试剂：mtesr1basalmedium、stemdiff^tmapel^tm2medium、stempro^tm-34sfm、accutase、matrigel、pbs、sb431542、bmp4、hbfgf、hvegf、y27632、scf、mtg、flt3l、tpo；

抗体：apc抗人cd140a(pdgfrα)抗体(biolegend)；cd309(flk1)单克隆抗体(avas12a1)，pe(ebioscience)，cd34单克隆抗体(4h11)，fitc(ebioscience)；设备：细胞培养箱(thermo150i)、超净工作台(苏州安泰)、beckman离心机(x-15r)、细胞计数仪(countstar)、倒置显微镜(leicadmilled)、轨道摇床(chemglass)、4℃冰箱(海尔hyc390)、-20℃冰箱(海尔)、负压吸引器(鱼跃)、移液枪(eppendorf)、制冰机。

二、实验方法

1.eb形成(第0-第4天(d0-d1))

eb形成培养基：stemdiff^tmapel^tm2medium,y-27632(10μm)；

aggrewell预处理：向aggrewell中以500μl/孔加入抗黏附清洗液(anti-adherencerinsingsolution)(stemcell)，1300g离心5min以去除微孔中的气泡；

吸弃aggrewell中的清洗液，将h9细胞重悬于eb形成培养基，以8×10⁵细胞/孔的密度接种于aggrewell中，100g离心3min使细胞聚集于微孔中，37℃，5％co2培养箱中培养过夜，次日观察eb形成情况，进行粒径统计；

2.中胚层分化(第0-第4天(d1-d4))

中胚层分化培养基：stempro^tm-34sfm，hbmp-4(40ng/ml)，hbfgf(50ng/ml),vegf(50ng/ml)，mtg(400μm)，its(1x)，vc(50μg/ml)；

使用5ml巴氏吸管小心吸出aggrewell板中的eb球，通过37μm可逆滤器(stemcell)，翻转可逆滤器，使用pbs收集eb球至新的15ml离心管中(每4孔aggrewell中的eb收集至1个离心管中)，200g离心4min，弃上清，使用5.5ml中胚层分化培养基重悬eb，转移至低吸附6孔板中(corning)，摇散，6孔板置于37℃，5％co2培养箱中静态培养。第2天(d2)添加6μmsb431542(tocris)，第3天(d3)进行半换液(含6μmsb431542)。

其余操作参照实施例1。

三、实验结论

1.第4天-第10天(d4-d10)分化过程中eb之间黏连非常严重，第6天(d6)将大团快挑出后，次日小团仍会黏连在一起，eb形态极差，未出现空泡形态(参见附图9和附图10)；

2.通过rt-pcr对中胚层相关基因进行检测，结果显示相对于分化初始细胞h1，阴性指标oct4均明显下降。但阳性指标pdgfr、mixl1、kdr、t在第4天(d4)上升倍数较小，甚至有所下降。各个指标综合表现不佳，参见附图11；

3.第10天(d10)对eb进行消化，h9分化组的细胞存活率为90.56％，活细胞数4.25×10⁶；h1分化组的细胞存活率为86.73％，活细胞数为4.12×10⁶。对造血祖细胞标记物cd34进行流式检测，结果显示h1分化第10天(d10)cd34+的阳性率为4.11％，h9分化第10天(d10)cd34+的阳性率为5.36％，阳性率均很低，参见附图12。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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