梯度调控芽胞杆菌启动子启动效率的序列组合及应用的制作方法

本发明涉及基因工程和微生物蛋白表达领域，具体涉及梯度调控芽胞杆菌启动子启动效率的序列组合及应用。

背景技术：

启动子是位于基因转录单元上游的一段特殊dna序列，具有启动基因转录的功能，并在调控基因转录水平中发挥着重要的作用。随着合成生物学和代谢途径工程的发展，人们逐渐发现，为了实现目标产物的高产，平衡工程菌株生长和生产的代谢通量是至关重要的，从而开发精准调控蛋白表达水平和代谢物代谢途径的工具成为了研究热点。由于启动子是基因转录的开关，从而其被认定为是建立基因精准调控工具的首选表达元件。目前，基因精准调控工具主要包括：静态调控系统、动态调控系统。其中，静态调控系统主要是利用梯度强度的启动子文库来实现对目的基因精准调控的目的，其构建策略主要启动子改造(doi:10.1021/acssynbio.7b00258)、组学筛选(doi:10.1016/j.cbpa.2012.12.008)等；而动态调控系统主要以诱导型启动子为基础，通过添加不同剂量的诱导剂实现对目的基因精准调控的目的(doi:10.1021/acs.jafc.8b02857)。

地衣芽胞杆菌是一个重要的工业生产模式菌株，具有分泌蛋白能力强特征，且被美国fda认定为生物安全性菌株，从而其可作为蛋白和目标代谢物生产的优良宿主。目前，其已经实现多种蛋白和代谢物高效生产，如α-淀粉酶、碱性蛋白酶，杆菌肽等。然而其至今仍然缺乏基因表达精准调控的有效工具，从而大大限制了地衣芽胞杆菌蛋白高效表达和目的产物高产的代谢工程育种平台的建立。

本实验室，前期研究发现，地衣芽胞杆菌dw2内源性启动子pbaca是一个活性强且稳定的表达元件。如王等人利用pbaca强化普切明合成途径酶，使产量达到550mg/l，为目前报道最高表达水平(doi:10.1128/aem.03041-19)。从而，本研究中，我们以pbaca为基础，采用静态调控思想，构建一个梯度强度的pbaca启动子突变体(pubay、pbaca、pundh)。然后，在不同芽胞杆菌中，为精准调控蛋白表达水平和代谢产物合成水平提供了一个有效的工具。并且，为构建芽胞杆菌蛋白高效表达体系和目的产物高产的代谢工程育种奠定基础。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了梯度调控芽胞杆菌启动子启动效率的序列组合，所述的启动子序列组合为seqidno.1，seqidno.2和seqidno.3。

本发明的另一个目的是提供了适用于芽胞杆菌的梯度型启动子在调控蛋白表达水平中的应用，将本发明的启动子导入芽胞杆菌中，可精准调控目的产物表达水平。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

梯度调控芽胞杆菌启动子启动效率的序列组合，为：seqidno.1；seqidno.2；和seqidno.3所示。

上述的序列组合在梯度调控芽胞杆菌外源蛋白表达量中的应用；

以上所述的应用，其应用过程是将上述序列分别替换目的启动子的5’utr；

以上所述的应用，优选的，所述的芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌，解淀粉芽胞杆菌或枯草芽胞杆菌；

以上所述的应用，优选的，所述的外源蛋白为绿色荧光蛋白，红色荧光蛋白和角蛋白酶。与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明人通过启动子改造，在地衣芽胞杆菌dw2中首次获得一组内源性梯度启动子pubay、pbaca和pundh。进而，实现了在不同芽胞杆菌中对蛋白(gfp、rfp和ker)表达水平的精准调控。

2.本发明人为芽胞杆菌提供了一个基因表达精准调控的有效工具。从而，本发明大大发展了芽胞杆菌蛋白高效表达和目的产物高产的代谢工程育种平台的建立。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

梯度调控芽胞杆菌启动子启动效率的序列组合的获得：

本发明以地衣芽胞杆菌dw2杆菌肽合成基因簇启动子pbaca为研究对象。首先，基于地衣芽胞杆菌dw2转录组数据，并考虑到5’utr的二级结构、sd序列特征和位置等因素，筛选不同的启动子的5’utr；然后替换pbaca的5’utr；接着，在不同的芽胞杆菌宿主中，对不同蛋白进行普适性验证；最终，本发明获得了一组梯度调控芽胞杆菌启动子启动效率的序列组合，如下：

gaaacaacaaagggggagatttgt(seqidno.1所示)；

attttatcaaaaaggagaatttttat(seqidno.2所示)；

cattcagaataaggacggaggattcacg(seqidno.3所示)；

将上述序列，分别替换目的启动子的5’utr，可实现目的蛋白的梯度表达。

上述的序列组合具备宿主的普适性，适用于多种芽胞杆菌；同时，更换宿主后，其对于蛋白量的表达的调控依然存在均匀的梯度。

申请人利用上述思路，同时也筛选出了两组预测可达到相同目的的序列组合，分别作为对照组1和对照组2；其中对照组1的序列组合如下：

agaagcacccttgccaaatgcagactatcaatgaaggaggtcgcctta(seqidno.7所示)；

ttattttaggagggtaaatc(seqidno.8所示)；

attaaaaggggtagaaaac(seqidno.9所示)；

对照组2的序列组合如下：

tcttatttacttaaaggaggaaatcatc(seqidno.13所示)；

ttaagcgttatcgctttaggaggaaatttc(seqidno.14所示)；

ttcagtcacctctttagtgaacttaggtgataaaaa(seqidno.15所示)；实施例2:

梯度调控芽胞杆菌启动子启动效率的序列组合的应用：

保证地衣芽胞杆菌dw2的pbaca启动子核心区不变，将下述序列组合分别替换地衣芽胞杆菌dw2中的pbaca启动子的5’utr而成，所述的序列组合：

gaaacaacaaagggggagatttgt(seqidno.1所示)；

attttatcaaaaaggagaatttttat(seqidno.2所示)；

cattcagaataaggacggaggattcacg(seqidno.3所示)；

替换后的启动子分别命名为pubay、pbaca和pundh，其对应的核苷酸序列分别为seqidno.4-seqidno.6所示。

表1梯度启动子的表达载体引物设计

注：划线为同源臂区，18-20bp。

1.以本实验室保存的质粒phy-p43-gfp(doi:10.1016/j.jbiotec.2020.02.015)和地衣芽胞杆菌dw2为模板，通过引物设计，用引物300-tf、gfp-r，pbaca-f、pbaca-r分别pcr扩增出载体骨架phy-gfp和启动子片段pbaca，并进行dna回收；

2.利用dpni酶对载体骨架phy-gfp中残留的phy-p43-gfp模板进行消化；

3.采用vazyme的同源重组酶(exnaseii)对载体骨架进行处理，并在37℃条件下反应30min，使载体骨架phy-gfp和片段pbaca相连；得到重组质粒phy-pbaca-gfp；

4.以步骤(3)得到的重组质粒phy-pbaca-gfp为模板，通过特定的引物设计，用引物pubay-f、pubay-r，pundh-f、pundh-r分别pcr扩增出包含启动子pubay和pundh的载体骨架，并进行dna回收；

5.利用dpni酶对步骤(4)得到的载体骨架中残留的phy-pbaca-gfp模板进行消化；

6.采用vazyme的同源重组酶(exnaseii)对载体骨架进行处理，并在37℃条件下反应30min，使载体骨架自连；得到重组质粒phy-pubay-gfp和phy-pundh-gfp；

7.将重组质粒(phy-pundh/pbaca/pubay-gfp)分别转入地衣芽胞杆菌dw2中，以四环抗生素作为筛选标记，随后，通过菌落pcr筛选得到阳性转化子，从而获得梯度启动子的工程菌dw2/pundh-gfp、dw2/pbaca-gfp、dw2/pubay-gfp。

8.工程菌种子活化：从甘油管以体积百分比1％将步骤7得到的工程菌分别接种于装有5mllb培养基中，230r/min、温度37℃，培养12小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1％接种量接种于种子发酵培养基于230r/min、37℃中培养10小时，得到种子培养的菌液；

9.工程菌发酵：向500ml三角瓶中装入50mllb液体发酵培养基，然后将种子培养的菌液以接种量为2％(体积百分比)，转速230r/min，温度37℃，发酵培养48小时，得到生产发酵的菌液。

10.gfp表达水平检测：取0.2ml发酵液于2mlep管，加入1.8mlpbs缓冲液，用可见光分光光度计测其生物量(od600)。然后用pbs缓冲液将发酵液相应稀释到终浓度(od600)为1，终体积2ml，随后7000rpm，2min，接着用2mlpbs缓冲液重悬，重复一次，最后用酶标仪检测其荧光强度。研究发现：在地衣芽胞杆菌dw2中，梯度启动子pundh、pbaca和pubay表达的gfp荧光强度分别为1.10×10⁵，3.38×10⁵，25.03×10⁵，说明了三种启动子的活性存在差异，且呈梯度，进而，实现了对绿色荧光蛋白的不同水平输出。

对照组1：

利用实施例1和对照组1中的序列组合，分别替换地衣芽胞杆菌dw2中的pbaca启动子的5’utr，获得的启动子分别命名为pudhbf、puyvgo和pumdh，其序列为seqidno.10-12所示。

仿照上述方法，构建了重组质粒phy-pumdh-gfp、phy-puyvgo-gfp、phy-pudhbf-gfp；将重组质粒分别转入地衣芽胞杆菌dw2中，构建了对照组1的启动子的工程菌dw2/pumdh-gfp、dw2/puyvgo-gfp、dw2/pudhbf-gfp。

所用引物pumdh-f、pumdh-r，puyvgo-f、puyvgo-r，pudhbf-f、pudhbf-r如下：

pumdh-f：gttttctaccccttttaatattcaccataatattggtc、

pumdh-r：attaaaaggggtagaaaacatggtgagcaagggcgagg，

puyvgo-f：gatttaccctcctaaaataaattcaccataatattggtc、

puyvgo-r：ttattttaggagggtaaatcatggtgagcaagggcgagg，

pudhbf-f：cattgatagtctgcatttggcaagggtgcttctattcaccataatattggtc、

pudhbf-r：aaatgcagactatcaatgaaggaggtcgccttaatggtgagcaagggcgagg；

注：划线为同源臂区，18-20bp。

同上述步骤8-10。研究发现：在地衣芽胞杆菌dw2中，梯度启动子pumdh、puyvgo和pudhbf表达的gfp荧光强度分别为1.17×10⁵，3.31×10⁵，23.95×10⁵，说明了三种启动子亦实现了对绿色荧光蛋白的不同水平输出。

对照组2：

利用实施例1和对照组2中的序列组合，分别替换地衣芽胞杆菌dw2中的pbaca启动子的5’utr，获得的启动子分别命名为pugapa、pucspb和putyra，其序列为seqidno.16-18所示。

仿照上述方法，构建了重组质粒phy-putyra-gfp、phy-pucspb-gfp、phy-pugapa-gfp；将重组质粒分别转入地衣芽胞杆菌dw2中，构建了对照组2的启动子的工程菌dw2/putyra-gfp、dw2/pucspb-gfp、dw2/pugapa-gfp。

所用引物putyra-f、putyra-r，pucspb-f、pucspb-r，pugapa-f、pugapa-r如下：

putyra-f：cctaagttcactaaagaggtgactgaaattcaccataatattggtc、

putyra-r：ctctttagtgaacttaggtgataaaaaatggtgagcaagggcgagg，

pucspb-f：tcctcctaaagcgataacgcttaaattcaccataatattggtc、

pucspb-r：gttatcgctttaggaggaaatttcatggtgagcaagggcgagg，

pugapa-f：tttcctcctttaagtaaataagaattcaccataatattggtc、

pugapa-r：tttacttaaaggaggaaatcatcatggtgagcaagggcgagg；

同上述步骤8-10。研究发现：在地衣芽胞杆菌dw2中，梯度启动子putyra、pucspb和pugapa表达的gfp荧光强度分别为1.28×10⁵，3.40×10⁵，22.76×10⁵，说明了三种启动子活性呈梯度，且实现了对绿色荧光蛋白的不同水平输出。

实施例2：

梯度启动子在枯草芽胞杆菌中调控绿色荧光蛋白表达水平的应用：

本实施例通过更换与实施例1不同的宿主来考察不同的序列组合对于外源蛋白的表达调控情况

1.将质粒phy-pubay-gfp、phy-pbaca-gfp、phy-pundh-gfp转入枯草芽胞杆菌168中，以四环抗生素作为筛选标记，随后，通过菌落pcr筛选得到阳性转化子，从而获得梯度启动子介导的gfp工程菌bs168/pubay-gfp、bs168/pbaca-gfp、bs168/pundh-gfp；

2.同理，将质粒phy-pumdh-gfp、phy-puyvgo-gfp、phy-pudhbf-gfp转入枯草芽胞杆菌168中，获得梯度启动子介导gfp表达的工程菌bs168/pumdh-gfp、bs168/puyvgo-gfp、bs168/pudhbf-gfp。

3.根据实施例1步骤8-10，发现在枯草芽胞杆菌168中，本发明提供的启动子pubay、pbaca、pundh表达的gfp荧光强度分别为20.25×10⁵，3.26×10⁵，1.02×10⁵，说明该三个启动子活性呈梯度，导致gfp不同水平的表达。而第二组启动子pumdh、puyvgo和pudhbf表达的gfp荧光强度分别为3.42×10⁵，3.00×10⁵，15.02×10⁵，说明该三个启动子活性在枯草芽胞杆菌168中存在差异，但不呈梯度。该与上述实例1中结果不一致，可能是由于该组启动子的普适性不强。

实施例3：

梯度启动子在解淀粉芽胞杆菌中调控绿色荧光蛋白表达水平的应用：

1.将质粒phy-pubay-gfp、phy-pbaca-gfp、phy-pundh-gfp转入解淀粉芽胞杆菌hz-12中，以四环抗生素作为筛选标记，随后，通过菌落pcr筛选得到阳性转化子，从而获得梯度启动子介导的gfp工程菌hz-12/pubay-gfp、hz-12/pbaca-gfp、hz-12/pundh-gfp；

2.同理，将质粒phy-putyra-gfp、phy-pucspb-gfp、phy-pugapa-gfp转入解淀粉芽胞杆菌hz-12中，获得梯度启动子介导gfp表达的工程菌hz-12/putyra-gfp、hz-12/pucspb-gfp、hz-12/pugapa-gfp。

3.根据实施例1步骤8-10，发现：在解淀粉芽胞杆菌hz-12中，本发明提供的启动子pubay、pbaca、pundh表达的gfp荧光强度分别为23.77×10⁵，3.52×10⁵，1.16×10⁵，说明该三个启动子活性呈梯度，导致gfp不同水平的表达。而对照组2的启动子putyra、pucspb和pugapa表达的gfp荧光强度分别为2.53×10⁵，2.90×10⁵，3.78×10⁵，说明该三个启动子活性在解淀粉芽胞杆菌hz-12差异较小，且均表达量较低。该与上述实例1中结果不一致，可能是由于该组启动子的普适性不强和宿主遗传背景不同造成的。

实施例4:

梯度启动子在枯草芽胞杆菌中调控角蛋白酶表达水平的应用：

1、以phy-pubay-gfp、phy-pbaca-gfp、phy-pundh-gfp和地衣芽胞杆菌wx-02基因组dna为模板，通过设计引物来分别扩增载体骨架phy-pubay、phy-pbaca、phy-pundh和角蛋白酶基因ker片段，并进行dna回收；

其中，所需引物如下：

phy-f：gtttattatccatacccttac；

phy-r：cagatttcgtgatgcttgtc；

ubay-f：acaaatctccccctttgttg；

baca-f：ataaaaattctcctttttgat；

undh-f：cgtgaatcctccgtccttattc；

t5-r：aagagcagagaggacggatttcc；

ubay-ker-f：acaaagggggagatttgtatgagaggcaaaaaggtatg；

baca-ker-f：aaaaaggagaatttttatatgagaggcaaaaaggtatg；

undh-ker-f：aaggacggaggattcacgatgagaggcaaaaaggtatg；

ker-r：tccgtcctctctgctcttttactgagctgccgcctgtac；

注：划线为同源臂区，18-20bp。

2、利用dpni酶分别对载体骨架phy-pubay、phy-pbaca、phy-pundh中残留的模板进行消化；

3、采用vazyme的同源重组酶(exnaseii)对纯化的载体骨架phy-pubay、phy-pbaca、phy-pundh和ker基因片段进行处理，并在37℃条件下反应30min，使载体骨架和片段相连；随后进行钙转，将其转入大肠杆菌中；最后通过测序验证后，即得到重组质粒(phy-pubay-ker、phy-pbaca-ker、phy-pundh-ker)；

4、将重组质粒(phy-pubay-ker、phy-pbaca-ker、phy-pundh-ker)转入枯草芽胞杆菌168中，以四环抗生素作为筛选标记，随后，通过菌落pcr筛选得到阳性转化子，从而获得梯度启动子介导的ker工程菌bs168/pubay-ker、bs168/pbaca-ker、bs168/pundh-ker；

5、工程菌bs168/pubay-ker、bs168/pbaca-ker、bs168/pundh-ker的种子活化和发酵阶段的相关操作除了发酵培养基外，与实施例2中的步骤5和6相同；

角蛋白酶发酵培养基：20g/l葡萄糖、10g/l大豆蛋白胨、10g/l玉米浆，5g/l酵母粉，10g/l氯化钠，1g/lk2hpo4和1g/l(nh4)2so4。

6、角蛋白酶酶活测定参照中华人民共和国国家标准中所描述的福林酚法进行，该角蛋白酶发酵检测结果：在b.s168中，梯度启动子pundh、pbaca和pubay表达的角蛋白酶酶活分别为156.71u/ml，1021.47u/ml，1589.28u/ml，说明了三种梯度启动子实现了对角蛋白酶的不同水平输出，且规律和上述结果一致。同时表明本发明涉及的梯度启动子在芽胞杆菌中调控蛋白表达水平具有一定的普适性。

一个单位酶活(u)定义为：一定温度、一定ph条件下，蛋白酶液在1min内水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需要的酶量。

实施例5：

梯度启动子在解淀粉芽胞杆菌中调控红色荧光蛋白rfp表达水平的应用：

1.以本实验室保存的质粒phy-p43-rfp(doi:10.1016/j.jbiotec.2020.02.015)和地衣芽胞杆菌dw2为模板，通过引物设计，分别pcr扩增出载体骨架phy-rfp和启动子片段pbaca，并进行dna回收；

其中，所需引物如下：

rfp-r:atggtttccaaaggagaagaa；

pbaca-r/r:ttctcctttggaaaccatataaaaattctcctttttg；

pubay-r/r:caacaaagggggagatttgtatggtttccaaaggagaagaa；

pundh-r/r:agaataaggacggaggattcacgatggtttccaaaggagaagaa；

注：划线为同源臂区，18-20bp。

2.利用dpni酶对载体骨架phy-rfp中残留的phy-p43-rfp模板进行消化；

3.采用vazyme的同源重组酶(exnaseii)对载体骨架进行处理，并在37℃条件下反应30min，使载体骨架phy-rfp和片段pbaca相连；得到重组质粒phy-pbaca-rfp；

4.以步骤(3)得到的重组质粒phy-pbaca-rfp为模板，通过特定的引物设计，分别pcr扩增出包含启动子pubay和pundh的载体骨架，并进行dna回收；

5.利用dpni酶对步骤(4)得到的载体骨架中残留的phy-pbaca-rfp模板进行消化；

6.采用vazyme的同源重组酶(exnaseii)对载体骨架进行处理，并在37℃条件下反应30min，使载体骨架自连；得到重组质粒phy-pubay-rfp和phy-pundh-rfp；

7.将重组质粒(phy-pundh/pbaca/pubay-rfp)分别转入解淀粉芽胞杆菌hz-12中，以四环抗生素作为筛选标记，随后，通过菌落pcr筛选得到阳性转化子，从而获得梯度启动子的工程菌hz-12/pundh-rfp、hz-12/pbaca-rfp、hz-12/pubay-rfp。

8.工程菌种子活化：从甘油管以体积百分比1％将步骤7得到的工程菌分别接种于装有5mllb培养基中，230r/min、温度37℃，培养12小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1％接种量接种于种子发酵培养基于230r/min、37℃中培养10小时，得到种子培养的菌液；

9.工程菌发酵：向500ml三角瓶中装入50mllb液体发酵培养基，然后将种子培养的菌液以接种量为2％(体积百分比)，转速230r/min，温度37℃，发酵培养48小时，得到生产发酵的菌液。

rfp表达水平检测：取0.2ml发酵液于2mlep管，加入1.8mlpbs缓冲液，用可见光分光光度计测其生物量(od600)。然后用pbs缓冲液将发酵液相应稀释到终浓度(od600)为1，终体积2ml，随后7000rpm，2min，接着用2mlpbs缓冲液重悬，重复一次，最后用酶标仪检测其荧光强度。在解淀粉芽胞杆菌hz-12中，梯度启动子pundh、pbaca和pubay表达的rfp荧光强度分别为17.20×10⁵，39.65×10⁵，53.60×10⁵，说明了三种启动子的活性存在差异，且呈梯度，进而，实现了对红色荧光蛋白的不同水平输出。

序列表

<110>湖北大学

<120>梯度调控芽胞杆菌启动子启动效率的序列组合及应用

<160>52

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gaaacaacaaagggggagatttgt24

<210>2

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

attttatcaaaaaggagaatttttat26

<210>3

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cattcagaataaggacggaggattcacg28

<210>4

<211>333

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

cctgcgatttcggcgagattcaagcccgggtctaatctatttttccttcttcggacgctt60

caaaaattacttttattataatcggaacagtgttttttagatcttttgatctatttggtg120

tttatcttgtctcataaatacatgtttaaacaatgtaaaatataaaatatccaattcata180

aaaaattaaccattattaaacaatattcctatggaaaataatgattatttttgataatct240

gttttcacaagacggaggttcaataaaaaatcggtaaaagagcaactacagaccaatatt300

atggtgaatgaaacaacaaagggggagatttgt333

<210>5

<211>335

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cctgcgatttcggcgagattcaagcccgggtctaatctatttttccttcttcggacgctt60

caaaaattacttttattataatcggaacagtgttttttagatcttttgatctatttggtg120

tttatcttgtctcataaatacatgtttaaacaatgtaaaatataaaatatccaattcata180

aaaaattaaccattattaaacaatattcctatggaaaataatgattatttttgataatct240

gttttcacaagacggaggttcaataaaaaatcggtaaaagagcaactacagaccaatatt300

atggtgaatattttatcaaaaaggagaatttttat335

<210>6

<211>337

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

cctgcgatttcggcgagattcaagcccgggtctaatctatttttccttcttcggacgctt60

caaaaattacttttattataatcggaacagtgttttttagatcttttgatctatttggtg120

tttatcttgtctcataaatacatgtttaaacaatgtaaaatataaaatatccaattcata180

aaaaattaaccattattaaacaatattcctatggaaaataatgattatttttgataatct240

gttttcacaagacggaggttcaataaaaaatcggtaaaagagcaactacagaccaatatt300

atggtgaatcattcagaataaggacggaggattcacg337

<210>7

<211>48

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

agaagcacccttgccaaatgcagactatcaatgaaggaggtcgcctta48

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

ttattttaggagggtaaatc20

<210>9

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

attaaaaggggtagaaaac19

<210>10

<211>357

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

cctgcgatttcggcgagattcaagcccgggtctaatctatttttccttcttcggacgctt60

caaaaattacttttattataatcggaacagtgttttttagatcttttgatctatttggtg120

tttatcttgtctcataaatacatgtttaaacaatgtaaaatataaaatatccaattcata180

aaaaattaaccattattaaacaatattcctatggaaaataatgattatttttgataatct240

gttttcacaagacggaggttcaataaaaaatcggtaaaagagcaactacagaccaatatt300

atggtgaatagaagcacccttgccaaatgcagactatcaatgaaggaggtcgcctta357

<210>11

<211>329

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

cctgcgatttcggcgagattcaagcccgggtctaatctatttttccttcttcggacgctt60

caaaaattacttttattataatcggaacagtgttttttagatcttttgatctatttggtg120

tttatcttgtctcataaatacatgtttaaacaatgtaaaatataaaatatccaattcata180

aaaaattaaccattattaaacaatattcctatggaaaataatgattatttttgataatct240

gttttcacaagacggaggttcaataaaaaatcggtaaaagagcaactacagaccaatatt300

atggtgaatttattttaggagggtaaatc329

<210>12

<211>328

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

cctgcgatttcggcgagattcaagcccgggtctaatctatttttccttcttcggacgctt60

caaaaattacttttattataatcggaacagtgttttttagatcttttgatctatttggtg120

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