一种长白落叶松LobHLH34基因、蛋白及应用的制作方法

本发明涉及植物育种技术领域，具体涉及一种长白落叶松lobhlh34基因、蛋白及应用。

背景技术：

落叶松(larixmill.)具早期速生、抗逆性强、轮伐期短等优势^[1]，是东北地区三大针叶用材树种之一。长白落叶松(larixolgensis)又称朝鲜落叶松，为松科(pinaceae)落叶松属的落叶乔木，作为北半球所独有的一种针叶用材树种，广泛分布在我国东北以及华北的高山地区^[2]，作为东北地区的优良乡土树种^[3]，在干旱且寒冷的困难立地条件下其抗逆性和适应性较其他树种更强^[4]。目前该树种已建立高效的体胚发生及悬浮培养体系^[5,6]，因此，它是进行落叶松抗逆基因克隆和机制研究的理想材料。

bhlh(basic/helix-loop-helix)是植物中最大的转录因子家族之一，它存在于真核生物中^[7]，由两个保守区域构成：碱性区域和bhlh(螺旋-环-螺旋)区域，前者含有大量碱性氨基酸，主要参与dna的结合；后者由疏水氨基酸残基构成，利于hlh之间相互作用形成二聚体^[8]。植物基因组中包含许多转录因子，其中wrky、nac、cbf、myb、ap2/erebp等均参与非生物胁迫应答且被广泛研究^[9]。而bhlh转录因子家族的研究相对滞后，目前对bhlh基因功能的研究主要集中在水稻(rice)和拟南芥(arabidopsisthaliana)这两种模式植物中，对其他植物的研究还相对较少^[10]。通过全基因组测序及生物信息学分析发现在拟南芥及水稻中bhlh转录因子的家族成员分别有164和180个，拟南芥的系统发育树中将bhlh转录因子家族分为12个亚家族^[11]，水稻中将其分为22个亚家族^[12]。它们在植物生长发育、形态建成、花器官形成、激素应答、次生产物代谢和抗逆性等方面发挥了重要作用^[13-15]。目前对于长白落叶松转录因子的研究仍较少，这限制了长白落叶松基因的功能应用。

参考文献：

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技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种长白落叶松lobhlh34基因、蛋白及应用。本发明所述基因定位在细胞核中，具有转录因子特性，所述基因的过表达能够促进植株耐盐能力增强，这为抗性长白落叶松的培育奠定了理论基础。

本发明提供了一种长白落叶松lobhlh34基因，所述基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了长白落叶松lobhlh34基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。

本发明还提供了用于扩增长白落叶松lobhlh34基因的引物，所述引物包括正向引物lobhlh34-f和反向引物lobhlh34-r，所述lobhlh34-f的核苷酸序列如seqidno.3所示，所述lobhlh34-r的核苷酸序列如seqidno.4所示。

本发明还提供了基于qrt-pcr方法检测长白落叶松lobhlh34基因用引物，所述引物包括正向引物lobhlh34-fq和反向引物lobhlh34-rq，所述lobhlh34-fq的核苷酸序列如seqidno.5所示，所述lobhlh34-rq的核苷酸序列如seqidno.6所示。

本发明还提供了一种含上述技术方案所述长白落叶松lobhlh34基因的表达载体。

优选的是，所述表达载体的骨架载体包括puc19-gfp。

本发明还提供了一种含上述技术方案所述基因或上述技术方案所述表达载体的宿主菌。

优选的是，所述宿主菌包括大肠杆菌。

本发明还提供了过表达上述技术方案所述基因在培育耐盐能力增强的植物中的应用。

优选的是，所述植株包括长白落叶松。

本发明提供了一种长白落叶松lobhlh34基因。本发明对长白落叶松lobhlh34基因进行了克隆及功能鉴定，长白落叶松lobhlh34基因的确定解决了长白落叶松中lobhlh34基因的序列准确性以及其蛋白结构的未知性，同时确定了该基因的转录因子特性，为后续探究该基因在长白落叶松中的功能及作用机制奠定基础。本发明所述基因编码不稳定的酸性亲水蛋白，属于bhlh-sfsuperfamily家族，包含ilr3保守结构域，能够定位在细胞核中，具有转录因子特性，且由系统进化分析表明，长白落叶松和云杉的距离最为接近，和其他植物均相差较远，并且，本发明所述基因的过表达能够促进植株耐盐能力增强，这一系列研究结果为后续探究该基因在长白落叶松中的功能及作用机制奠定基础。

附图说明

图1为本发明提供的电泳结果图；其中，a为本发明中长白落叶松总rna提取结果，b为lobhlh34基因pcr产物电泳图，其中m为dl2000dnamarker，1～2为pcr产物，marker和1之间为阴性对照；

图2为本发明提供的长白落叶松lobhlh34基因的核苷酸和氨基酸序列；

图3为本发明提供的长白落叶松lobhlh34蛋白的亲/疏水性分析预测；

图4为本发明提供的长白落叶松lobhlh34蛋白的二级结构预测；

图5为本发明提供的长白落叶松lobhlh34蛋白的三级结构预测；

图6为本发明提供的长白落叶松lobhlh34蛋白的结构域预测；

图7为本发明提供的不同植物lobhlh34蛋白系统进化树分析；

图8为本发明提供的长白落叶松lobhlh34基因亚细胞定位分析；

图9为本发明提供的长白落叶松lobhlh34基因组织特异性表达分析；

图10为本发明提供的长白落叶松lobhlh34基因nacl胁迫处理下在长白落叶松根、茎、叶中的相对表达量；

图11为本发明提供的长白落叶松lobhlh34基因peg胁迫处理下在长白落叶松根、茎、叶中的相对表达量；

图12为本发明提供的长白落叶松lobhlh34基因aba处理下在长白落叶松根、茎、叶中的相对表达量。

具体实施方式

本发明提供了一种长白落叶松lobhlh34基因，所述基因的核苷酸序列如seqidno.1所示：atgatgggatcacctcagagcagtaaatggatgtcgtttttggaggataatctgctggaggacgtgggccaaccggcaaattcattcttctggcccgttcagcccgtcaatgttcagccagatagcagtgccatacccagcgatgctaaaaatgacgaggatcaagaaaaaatgtgtcctcgaaagaggccaagagatgagtcatgtagtaaacatggcataaaagcttgccgagaaaagatgaggagggacagactaaatgacaggttcacggagctaagcatcttgttggaacctggccggcctccaaagacggataaatctacaatattaagtgatgctctttctcttgtgaatcaactacgagaggaggcaggcaaggtgaaacactcaaatgaagagcttcggcaatccattaaagaattgaagacagagaaaaatgaacttcgcgatgaaaagacaaggttaaaagcagaaaaggaaagattggatcaacaaatgaaggctatgatgacttcgcctccagggttcatgccgcatctggctgtagctcatgcattctcagctcaaagtcaagcagcaaatagcaagaccctacctattccaggttttcctgggatggcaatgtggcaatggatgccaccagctgcagttgatacatctcaagatcatgcgctaaggcctcctgttgcctaa。长白落叶松lobhlh34基因的编码区全长序列696bp，如图2奇数行所示。本发明所述长白落叶松lobhlh34基因蛋白分子式为c1129h1813n331o349s15，完整的开放阅读框(orf)长度为696bp，共编码231个氨基酸。该基因蛋白分子量为26.09kd，在组成蛋白的20种氨基酸中，脯氨酸(pro)和丝氨酸(ser)所占比例最高，均占9.1％，半胱氨酸(cys)所占比例最低，占1.3％。含有带负电的氨基酸(asp+glu)和带正电的氨基酸(arg+lys)个数分别为33和34个，理论等电点(pi)为7.73，脂溶指数61.73，总平均亲水系数为-0.830，不稳定系数为67.17；且该蛋白中第64位亲水性最强，得分为-3.156，第114位疏水性最强，得分为1.867。本发明长白落叶松lobhlh34基因编码不稳定的酸性亲水蛋白，属于bhlh-sfsuperfamily家族，包含ilr3保守结构域，且长白落叶松lobhlh34基因由系统进化分析表明，长白落叶松和云杉的距离最为接近，和其他植物均相差较远。本发明所述基因定位在细胞核中，具有转录因子特性。高盐、干旱和aba等非生物胁迫均对lobhlh34基因的相对表达量产生不同程度的影响，表明本发明所述基因功能具有重要的生物学意义。

本发明还提供了长白落叶松lobhlh34基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示：mmgspqsskwmsflednlledvgqpansffwpvqpvnvqpdssaipsdakndedqekmcprkrprdescskhgikacrekmrrdrlndrftelsillepgrppktdkstilsdalslvnqlreeagkvkhsneelrqsikelkteknelrdektrlkaekerldqqmkammtsppgfmphlavahafsaqsqaansktlpipgfpgmamwqwmppaavdtsqdhalrppva*。长白落叶松lobhlh34基因编码的蛋白由232个氨基酸组成，如图2偶数行所示。lobhlh34蛋白二级结构：含α-螺旋(alphahelix)101个，占43.72％；β-转角(betaturn)2个，占0.87％；延伸链(extendedstrand)1个，占0.43％；无规则卷曲(randomcoil)127个，占54.98％；三级结构如图5所示。本发明利用ncbi中的在线工具conserveddomainsearchservice(cdsearch)对lobhlh34蛋白的保守结构域进行预测，保守区包含从75位至150位的氨基酸，该基因属于bhlh-sfsuperfamily家族，包含ilr3保守结构域。lobhlh34转录因子是核定位蛋白。

本发明优选利用生物信息学分析网站及软件对长白落叶松lobhlh34基因编码蛋白的结构和功能进行预测，生物信息学网站及软件如表1所示。

表1生物信息学分析网站及软件

本发明对长白落叶松lobhlh34基因功能进行了鉴定，所述鉴定包括验证所述基因是否具有转录因子特性。

本发明利用毛果杨的原生质体瞬时转化体系(cy,wangjp,chenhc,chuangl,qugz,sederoffrr,chiangvl.asimpleimproved-throughputxylemprotoplastsystemforstudyingwoodformation.natprotoc.2014sep；9(9):2194-205)将长白落叶松中基因转入毛果杨原生质体，并观察其蛋白定位，结果如图8所示。

本发明还提供了用于扩增长白落叶松lobhlh34基因的引物，所述引物包括正向引物lobhlh34-f和反向引物lobhlh34-r，所述lobhlh34-f的核苷酸序列如seqidno.3所示：cgggatccatgatgggatcacctcagagc，所述lobhlh34-r的核苷酸序列如seqidno.4所示：gcgtcgacggcaacaggaggccttagc。本发明使用上述引物进行基因的扩增时，优选以长白落叶松的cdna为模板(本发明对所述cdna的获取方法没有特殊限定，采用本领域常规的cdna获取方法即可，如提取植株总rna后进行反转录)，优选使用kod-fxpcr酶进行扩增，扩增体系每50μl优选包括ddh2o10μl，2xpcrbufferforkodfx25μl，2mmol·l^-1dntps10μl，上下游引物(lobhlh34-f和lobhlh34-r)各1.5μl，模板cdna1μl和kodfx1μl，扩增条件优选为：94℃2min；98℃10s，58℃30s，68℃42s，35个循环；68℃10min；16℃保温。本发明对所述kod-fxpcr酶的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售kod-fxpcr酶即可。

本发明还提供了基于qrt-pcr方法检测长白落叶松lobhlh34基因用引物，所述引物包括正向引物lobhlh34-fq和反向引物lobhlh34-rq，所述lobhlh34-fq的核苷酸序列如seqidno.5所示：ggctgtagctcatgcattctc，所述lobhlh34-rq的核苷酸序列如seqidno.6所示：attgccatcccaggaaaac。

本发明还提供了一种含上述技术方案所述长白落叶松lobhlh34基因的表达载体。在本发明中，所述表达载体的骨架载体优选包括puc19-gfp。本发明对所述载体的构建方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规方法即可。

本发明还提供了一种含上述技术方案所述基因或上述技术方案所述表达载体的宿主菌。在本发明中，所述宿主菌优选包括大肠杆菌，更优选包括dh5α感受态细胞。

本发明还提供了过表达上述技术方案所述基因在培育耐盐能力增强的植物中的应用。在本发明中，所述植株包括长白落叶松。本发明进行了长白落叶松lobhlh34基因响应激素及环境的表达模式分析。具体的，分别以长白落叶松根、茎、叶为模板，通过qrt-pcr检测分析lobhlh34基因在长白落叶松各组织部位的相对表达量。同时检测lobhlh34基因在逆境胁迫下长白落叶松各组织部位的表达量。最终得出长白落叶松lobhlh34基因过表达后能够促进植株耐盐能力增强的结论。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种长白落叶松lobhlh34基因、蛋白及应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例使用的材料、试剂、酶、感受态细胞和质粒等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

1.长白落叶松lobhlh34基因的获得如下：

1.1目的基因序列的获得

在目的基因序列两端设计引物如表2。

表2引物序列

取苗龄4个月左右的长白落叶松土培苗全株，经无菌水冲洗、吸干表面水分后加液氮迅速研磨成粉末，采用ctab法提取植株总rna，用超微量分光光度计(产品型号：microdrop)检测rna的浓度，用1％琼脂糖凝聚胶电泳检测rna完整性，28srna约为18srna条带亮度的2倍，说明rna提取过程没有问题，最终获得rna模板(如图1中的a)。再根据cdna反转录试剂盒的操作说明，在pcr仪上进行反转录，合成cdna第一链，并放在-20℃冰箱内保存备用。

pcr反应体系(50μl)：ddh2o10μl，2xpcrbufferforkodfx25μl，2mmol·l^-1dntps10μl，上下游引物(lobhlh34-f和lobhlh34-r)各1.5μl，模板cdna1μl，kodfx1μl，扩增条件：94℃2min；98℃10s，58℃30s，68℃42s，35个循环；68℃10min；16℃保温。

1.2目的基因连接puc19-gfp载体测序

pcr扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，并用dl2000dnamarker比对扩增得到的目的片段长度(如图1中的b，其中，m为dl2000dnamarker，1～2为pcr产物，marker和1之间为阴性对照，用无菌水(阴性对照)与样品同时进行pcr扩增，阴性对照未产生条带说明实验过程不存在其它dna污染，得到的条带可信)，确认正确后，使用胶回收试剂盒对扩增产物进行胶回收，操作步骤与方法参考试剂盒说明书。胶回收后用bamhⅰ和salⅰ限制性内切酶将基因和载体同时双酶切，后将目的片段与puc19-gfp载体连接，并转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞中，37℃过夜培养后挑取单菌落进行pcr检测，提取阳性质粒后进行测序。将目的条带大小正确的菌株公司进行测序。经过检测，核苷酸序列如图2奇数行所示，该基因片段命名为lobhlh34，由696个碱基组成。编码的氨基酸序列如图2偶数行所示。

1.3实验结果

根据长白落叶松转录组数据库中获得bhlh34基因的全长序列，lobhlh34基因的开放阅读框为696bp。利用primer5.0软件设计引物(如表1所示)，引物由公司合成。以整株的rna反转录所得的cdna为模板，采用kod-fxpcr酶进行pcr扩增，克隆出lobhlh34基因的全长片段。连接到puc19-gfp载体上，将重组质粒转化大肠杆菌，涂布于加amp的筛选平板上。将阳性菌落随机挑出几个，进行菌液pcr检验，有条带。送去测序。测序结果如图2。序列如下：

atgatgggatcacctcagagcagtaaatggatgtcgtttttggaggataatctgctggaggacgtgggccaaccggcaaattcattcttctggcccgttcagcccgtcaatgttcagccagatagcagtgccatacccagcgatgctaaaaatgacgaggatcaagaaaaaatgtgtcctcgaaagaggccaagagatgagtcatgtagtaaacatggcataaaagcttgccgagaaaagatgaggagggacagactaaatgacaggttcacggagctaagcatcttgttggaacctggccggcctccaaagacggataaatctacaatattaagtgatgctctttctcttgtgaatcaactacgagaggaggcaggcaaggtgaaacactcaaatgaagagcttcggcaatccattaaagaattgaagacagagaaaaatgaacttcgcgatgaaaagacaaggttaaaagcagaaaaggaaagattggatcaacaaatgaaggctatgatgacttcgcctccagggttcatgccgcatctggctgtagctcatgcattctcagctcaaagtcaagcagcaaatagcaagaccctacctattccaggttttcctgggatggcaatgtggcaatggatgccaccagctgcagttgatacatctcaagatcatgcgctaaggcctcctgttgcctaa(seqidno.1)

mmgspqsskwmsflednlledvgqpansffwpvqpvnvqpdssaipsdakndedqekmcprkrprdescskhgikacrekmrrdrlndrftelsillepgrppktdkstilsdalslvnqlreeagkvkhsneelrqsikelkteknelrdektrlkaekerldqqmkammtsppgfmphlavahafsaqsqaansktlpipgfpgmamwqwmppaavdtsqdhalrppva*(seqidno.2)

2.lobhlh34基因的生物信息学分析

2.1lobhlh34蛋白的一级结构亲/疏水性分析预测

expasy分析结果显示，长白落叶松lobhlh34基因蛋白分子式为c1129h1813n331o349s15，完整的开放阅读框(orf)长度为696bp，共编码231个氨基酸。该基因蛋白分子量为26.09kd，在组成蛋白的20种氨基酸中，脯氨酸(pro)和丝氨酸(ser)所占比例最高，均占9.1％，半胱氨酸(cys)所占比例最低，占1.3％。含有带负电的氨基酸(asp+glu)和带正电的氨基酸(arg+lys)个数分别为33和34个，理论等电点(pi)为7.73，脂溶指数61.73，总平均亲水系数为-0.830，不稳定系数为67.17；且该蛋白中第64位亲水性最强，得分为-3.156，第114位疏水性最强，得分为1.867，推测该蛋白为不稳定的酸性亲水蛋白(如图3)。

2.2lobhlh34蛋白二级结构预测

采用在线软件sopma对长白落叶松bhlh34氨基酸序列的二级结构进行预测。结果表明，含α-螺旋(alphahelix)101个，占43.72％；β-转角(betaturn)2个，占0.87％；延伸链(extendedstrand)1个，占0.43％；无规则卷曲(randomcoil)127个，占54.98％(如图4)。

2.3lobhlh34蛋白三级结构预测

蛋白质的三级结构是在二级结构的延伸基础上进一步盘绕和折叠。采用swiss-model工具，运用同源建模法对lobhlh34基因编码蛋白进行三级结构建模^[11](如图5)。其中建模范围是83-166个氨基酸，序列对比一致性为30.95％。

2.4lobhlh34蛋白结构域预测

利用ncbi中的在线工具conserveddomainsearchservice(cdsearch)对lobhlh34蛋白的保守结构域进行预测(图6)，结果表明，保守区包含从75位至150位的氨基酸，该基因属于bhlh-sfsuperfamily家族，包含ilr3保守结构域。

2.5不同植物lobhlh34蛋白系统进化树分析

用mega5.0软件通过近临相接法(neighbor-joining)构建蛋白序列的进化树，由系统进化分析表明，长白落叶松和云杉的距离最为接近，和其他植物均相差较远(如图7)。

3.长白落叶松lobhlh34基因的亚细胞定位分析

为了解lobhlh34基因是否是典型的转录因子，在细胞核表达功能，构建了lobhlh34基因融合绿色荧光蛋白(gfp)瞬时表达载体。结果如图8(图8中的a、b、c、d为阳性对照，a为核定位标记基因h2a融合mcherry标签后在细胞核中产生的红色信号、b为35s启动子直接启动gfp基因后在全细胞中定位产生绿色信号的情况、c为红色和绿色信号叠加后的细胞状态、d为明场下细胞形态)所示：lobhlh34基因融合gfp发出的绿色荧光与细胞核定位的h2a基因融合mcherry发出的红色荧光完全重叠，重叠区域显示出黄色的光。表明lobhlh34转录因子是核定位蛋白，符合转录因子的特征。

4.长白落叶松lobhlh34基因的表达模式分析

4.1lobhlh34基因在长白落叶松不同组织部位的表达模式

分别以长白落叶松根、茎、叶为模板，通过qrt-pcr检测分析lobhlh34基因在长白落叶松各组织部位的相对表达量(如图9，图9同时为图10、图11和图12的空白对照)。结果表明：lobhlh34基因在落叶松各个组织部位中均有表达，以叶中的相对表达量为参照，茎中的相对表达量最高，约为叶中的10倍，根的相对表达量约为叶中的7倍。

4.2lobhlh34基因在长白落叶松逆境胁迫下的表达模式

为更深入了解长白落叶松lobhlh34基因的生物学功能，本发明对其进行了高盐、干旱和外源激素胁迫处理，采用荧光实时定量qrt-pcr分别对lobhlh34基因在根、茎、叶中的表达情况进行了初步分析。结果表明：高盐、干旱和aba等非生物胁迫均对lobhlh34基因的相对表达量产生不同程度的影响。不同胁迫处理24h后，发现在nacl胁迫处理后，落叶松根中lobhlh34基因表达量呈现升高的趋势，是对照的1.4倍；在茎中lobhlh34基因为下调表达；在叶中该基因表达量呈现上升的趋势(如图10)，由此可见叶对高盐胁迫反应更敏感；在peg干旱胁迫下，落叶松根、叶和茎部lobhlh34基因表现为下调表达，在叶中该基因的表达量略微下降(如图11)，而在茎中则该基因受到peg诱导下调更明显，总的来说，该基因在干旱诱导下表达量稍微下降，但变化不明显；在aba处理后，根部表达量与对照相比差异显著，呈现出明显的降低趋势，茎呈现略下降趋势；叶基本对照持平(如图12)，可见aba对根的胁迫作用更明显。

结果表明，将长白落叶松lobhlh34基因过表达后可能会促进植株耐盐能力增强，而在耐旱和渗透胁迫的能力则不会有太明显的变化，这为未来创制耐盐的种质植物提供了良好的研究基础。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>东北林业大学

<120>一种长白落叶松lobhlh34基因、蛋白及应用

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>696

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atgatgggatcacctcagagcagtaaatggatgtcgtttttggaggataatctgctggag60

gacgtgggccaaccggcaaattcattcttctggcccgttcagcccgtcaatgttcagcca120

gatagcagtgccatacccagcgatgctaaaaatgacgaggatcaagaaaaaatgtgtcct180

cgaaagaggccaagagatgagtcatgtagtaaacatggcataaaagcttgccgagaaaag240

atgaggagggacagactaaatgacaggttcacggagctaagcatcttgttggaacctggc300

cggcctccaaagacggataaatctacaatattaagtgatgctctttctcttgtgaatcaa360

ctacgagaggaggcaggcaaggtgaaacactcaaatgaagagcttcggcaatccattaaa420

gaattgaagacagagaaaaatgaacttcgcgatgaaaagacaaggttaaaagcagaaaag480

gaaagattggatcaacaaatgaaggctatgatgacttcgcctccagggttcatgccgcat540

ctggctgtagctcatgcattctcagctcaaagtcaagcagcaaatagcaagaccctacct600

attccaggttttcctgggatggcaatgtggcaatggatgccaccagctgcagttgataca660

tctcaagatcatgcgctaaggcctcctgttgcctaa696

<210>2

<211>231

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

metmetglyserproglnserserlystrpmetserpheleugluasp

151015

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