一种遗传性配子发生障碍的致病突变及其检测试剂的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及一种遗传性雌雄配子发生障碍的致病突变及其检测试剂。

背景技术：

原发性卵巢功能不全(primaryovarianinsufficiency，poi)是指女性40岁以前闭经，并伴有促性腺素水平升高和雌激素水平降低，以及一定程度的一系列低雌激素引起的围绝经期症状如潮热多汗、面部潮红、性欲低下、情绪改变等，约1-2％的育龄妇女患有此病。根据疾病发生发展进程，原发性卵巢功能不全分为隐匿期、生化异常期和临床衰竭期三个发展阶段，卵巢早衰(prematureovarianfailure，pof)是其终末阶段。pof意味着能发育及排卵的卵子极少，且目前仍然无有效手段恢复或改善卵巢功能，严重影响病患的心理状态及生活质量，给患者带来极大的身体和精神痛苦，其社会适应性明显降低。

对于三次或三次以上精液离心后镜检未发现精子，同时排除不射精和逆行射精等因素即可诊断为无精子症。男性不育无精子症可分为梗阻性无精子(oa)、非梗阻性无精子症(noa)、混合型无精子症(combinedazoospermia)3类。非梗阻性无精子症(nonobstructiveazoospermia，noa)作为预后较差的男性不育发病类型，一直是男性不育领域研究的热点和重要方向。

因此，寻找潜在的能够辅助原发性卵巢功能不全及非梗阻性无精子症临床诊断的其他早期诊断方式显得尤为重要。

poi的遗传学病因研究结果表明，遗传物质的异常既可发生在染色体水平，也可发生在单个基因水平，目前已发现几十种基因通过各种致病途径和发病机制干扰卵巢功能。然而这些基因的突变并不能够解释全部poi患者的遗传病因，仍有大量poi患者的致病基因尚未找到，提示存在未知的poi的新致病基因有待挖掘。针对poi的分子遗传学研究必须建立在一定的分子生物学技术的基础上。研究poi致病基因的一个重要目的是进行poi的分子诊断，鉴于其遗传异质性，寻求一种全新的poi致病基因的研究方法显得尤为迫切。

原发性睾丸衰竭引起的精子发生数量障碍约占男性因素不育病例的75％，是最常见的精子发生障碍病因，某些遗传因素与生殖功能受损有着明显的因果关系，对这些因素的检测能够为20％的男性不育病例提供遗传诊断。无精子症患者遗传异常的风险最高可达到25％，并且这一风险伴随着精子产量的增加而逐渐降低。遗传因素主要包括：染色体异常、卡尔曼综合征、轻度雄激素不敏感综合征、y染色体微缺失、特发性男性不育等。

高通量二代测序技术能够高效的针对大量基因的遗传信息进行捕获，具有传统技术所不可及的优势。

pof1b(prematureovarianfailure1b)基因(nc_000023.11)位于x染色体长臂xq21.1位置，该基因含有17个外显子，其编码的pof1b蛋白含有589个氨基酸，目前研究有报道pof1b基因突变能够引起卵巢早衰，但其与原发性卵巢功能不全及非梗阻性无精子症间的关系国内外均未见报道。

遗传性原发性卵巢功能不全或非梗阻性无精子症是常见的、严重的遗传性生殖障碍，严重危害了国民健康。挖掘其新致病突变和新致病基因有利于进一步探索遗传性原发性卵巢功能不全或无精子症的分子遗传学病因，是分利用我国的生殖遗传病资源，造福不孕不育患者的现实需要，是后基因组时代最重要的研究方向之一。本专利旨在探索遗传性原发性卵巢功能不全或非梗阻性无精子症的遗传学病因，从而帮助了解发病机制、辅助临床诊断、产前诊断和转基因治疗。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种遗传性原发性卵巢功能不全及非梗阻性无精子症的致病突变。

本发明的另一目的是提供所述的致病突变的应用。

本发明的又一目的是提供遗传性原发性卵巢功能不全及非梗阻性无精子症的诊断试剂。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

非梗阻性无精子症的诊断：

男性染色体核型为xy，只有一条x染色体。一种突变的pof1b基因，突变的pof1b基因位于x号染色体，为缺失突变pof1bc.312_316delp.s104fs，野生型pof1b基因在ensemble数据库中的基因编号为:ensg00000124429，所述的缺失突变的pof1b基因所在物理位置为第三个外显子，chrx-84622738-84622742位碱基缺失五个碱基tacat，后续序列造成移码突变。

突变的pof1b蛋白，所述的突变的pof1b蛋白由所述的突变的pof1b基因编码，野生型pof1b蛋白有两个转录本，在ensemble数据库中的基因转录本编号为enst00000262753.9及enst00000262753；突变的pof1b蛋白在第104位氨基酸移码突变，在翻译11个新的氨基酸后遇到终止密码子，翻译终止，其他部分与野生型相同。

本发明所述的突变的pof1b基因或所述的突变的pof1b蛋白作为检测靶点在制备男性非梗阻性无精症辅助诊断试剂或检测设备中的应用。

所述的辅助诊断试剂优选引物或引物对、探针、核酸芯片或抗体中的一种或多种。

所述的检测设备优选含有检测突变的pof1b基因的基因芯片的检测平台。

检测本发明所述的突变的pof1b基因或所述的突变的pof1b蛋白的试剂在制备男性非梗阻性无精症或女性遗传性原发性卵巢功能不全辅助诊断试剂或检测设备中的应用。

作为本发明的优选，所述的检测突变的pof1b基因的试剂为检测pof1b基因物理位置chrx-84622738-84622742位核苷酸位点的试剂，优选seqidn0.4所示的杂交探针；所述的检测突变的pof1b蛋白的试剂为检测pof1b蛋白在第104位氨基酸的试剂。

一种非梗阻性无精症的辅助诊断试剂盒，所述的试剂盒包括:检测pof1b基因物理位置chrx-84622738-84622742位核苷酸位点的试剂；或检测pof1b蛋白第104位氨基酸位点的试剂。

所述的试剂优选引物或引物对、探针、抗体、或核酸芯片中的一种或多种；所述的试剂进一步优选基于深度测序为平台的基因芯片杂交探针；检测chrx-84622738-84622742位核苷酸位点的杂交探针序列更进一步优选为chrx|84622673-84622793，序列如seqidn0.4所示。

遗传性原发性卵巢功能不全的诊断：

女性染色体核型为xx，有两条x染色体。突变的pof1b基因位于x号染色体，包括以下两种，为复合杂合突变：缺失突变pof1bc.312_316delp.s104fs以及错义突变pof1bc.1325a>gp.e442g。野生型pof1b基因在ensemble数据库中的基因编号为:ensg00000124429，所述的缺失突变的pof1b基因所在物理位置为第三个外显子，chrx-84622738-84622742位缺失五个碱基tacat，后续序列造成移码突变。错义突变的pof1b基因所在的物理位置为第十三个外显子，chrx-84560909-84560909位碱基由a突变为g。

突变的pof1b蛋白，由所述的突变的pof1b基因编码，野生型pof1b蛋白有两个转录本，在ensemble数据库中的基因转录本编号为enst00000262753.9及enst00000262753；缺失突变的pof1b蛋白在第104位氨基酸移码突变，在翻译11个新的氨基酸后遇到终止密码子，翻译终止，其他部分与野生型相同。错义突变的pof1b蛋白在第442位氨基酸错义突变，由谷氨酸突变为甘氨酸，其他部分与野生型相同。

本发明所述的突变的pof1b基因或所述的突变的pof1b蛋白作为检测靶点在制备女性遗传性原发性卵巢功能不全辅助诊断试剂或检测设备中的应用。

所述的辅助诊断试剂优选引物或引物对、探针、核酸芯片或抗体中的一种或多种。

所述的检测设备优选含有检测突变的pof1b基因的基因芯片的检测平台。

一种女性遗传性原发性卵巢功能不全辅助诊断试剂盒，所述的试剂盒包括:检测pof1b基因物理位置chrx-84622738-84622742位核苷酸位点的试剂以及检测pof1b基因物理位置第十三个外显子，chrx-84560909位核苷酸位点的试剂；或包含检测pof1b蛋白第104位氨基酸位点和pof1b蛋白在第442位氨基酸位点的试剂。

所述的试剂优选引物或引物对、探针、抗体、或核酸芯片中的一种或多种；所述的试剂进一步优选基于深度测序为平台的基因芯片杂交探针；检测chrx-84622738-84622742位核苷酸位点的杂交探针序列更进一步优选为chrx|84622673-84622793，序列如seqidn0.4所示；检测chrx-84560909-84560909位核苷酸位点的杂交探针序列更进一步优选为chrx|84560856-84560976，序列如seqidn0.17所示。

有益效果：

目前并没有研究指出pof1b基因缺失突变与遗传性原发性卵巢功能不全或非梗阻性无精子症间的关系。因此，针对pof1b基因与遗传性原发性卵巢功能不全或非梗阻性无精子症的相关研究显得尤为必要。本专利选择pof1b基因作为遗传性原发性卵巢功能不全或非梗阻性无精子症的候选基因，是由申请人在多年从事临床医疗、遗传学研究的基础上所筛选出的。

一个基因可以对应多个不同的转录本，且不同转录本所编码的rna及蛋白有所不同。本专利中申请人根据长期从事遗传学研究的经验，筛选出pof1b基因的最优转录本，并根据不同的转录本设计相应的探针，从而使筛查效益达到最高，最终获得遗传性原发性卵巢功能不全的致病突变pof1bc.312_316delp.s104fs以及pof1bc.1325a>gp.e442g；非梗阻性无精子症的致病突pof1bc.312_316delp.s104fs。

遗传性原发性卵巢功能不全或非梗阻性无精子症具有一定的遗传异质性，目前已知一些致病基因，但仍存在未知的致病基因。本发明提供了新的致病基因的致病位点，为该疾病的诊断提供了新的分子生物学基础。

附图说明

图1:家系图

图2:遗传性原发性卵巢功能不全患者(患者iii:6)病史、内分泌检查结果

图3:遗传性原发性卵巢功能不全患者(患者iii:6)获卵结果

图4:无精子症患者睾丸(患者iii:8)病史、其他检查结果

图5:无精子症患者睾丸(患者iii:8)穿刺切组织切片he染色结果

图6:pof1b突变及野生型序列测序图

图7:物种间保守性分析

图8:野生型及携带有突变的pof1b蛋白三维结构

具体实施方式

实施例1

对一个遗传性原发性卵巢功能不全及无精症家系的pof1b基因突变进行检测。

实验方法:

1.该家系临床资源的采集及遗传资源库的建立:

收集该家系中各成员的临床资料及两名患者(iii:6,iii:8)及父母血液样本。该家系中先证者为患者iii:8，男性，两年前就诊于我院诊断为非梗阻性无精子症；其兄生育能力正常；其姐(iii:6)为遗传性原发性卵巢功能不全，其父母非近亲婚配。(家系图见图1)。临床资料主要包括个人病史、家族史、生育史等。并用血液基因组dna提取试剂盒(qiagen,hilden,germany)对两名患者(iii:6,iii:8)及父母的血液基因组dna进行提取。

2.借助于高通量二代测序挖掘该家系的致病突变:

2.1设计并订制捕获芯片:

2.1.1pof1b基因及转录本序列信息:

该基因捕获芯片为全外显子组捕获芯片，可对目前所有已知基因进行检测，其中包括全部目前已知的遗传性原发性卵巢功能不全及无精症相关的致病基因。我们所参照的pof1b基因在ensemble数据库中的基因编号为:ensg00000124429(注:该编号来自ensemble数据库，www.ensembl.org，可输入基因编码检索基因详细信息及基因序列)。

2.1.2转录本的选择:

针对不同基因选择特定的转录本，每个基因均含有多个转录本，在选择转录本时，我们的原则是:首先考虑拥有pof1b编码蛋白的转录本，若一个基因有多个转录本均编码蛋白，则首选含氨基酸数最多的蛋白相对应的转录本，若多个转录本氨基酸含量相同，则进一步选择含碱基数最多的转录本。据以上原则，我们所筛选出的pof1b基因转录本编号为:enst00000262753(注:该编号来自ensemble数据库，www.ensembl.org，可输入转录本编码检索转录本详细信息及转录本序列)。

2.1.2杂交探针的设计:

杂交探针的设计标准为:(1)探针覆盖所有候选基因的目标区域，即外显子区域以及外显子和内含子拼接处(外显子上下游各100个bp)；(2)去除重复序列:对于在基因组出现的高度重复序列以及在人类基因组中出现2-5倍的较低频率的重复片段，我们予以去除，避免捕获其他同源基因，增加假阳性，从而降低检测效率。申请人将所有候选基因的目标区域与人类基因组dna序列进行比对，共移除了2.5％的重复序列；(3)在探针设计过程中，我们对临近的外显子进行了特定的整合，其相邻探针整合标准为:当相邻外显子的综合目标区域(即前个外显子的上游100bp起至后一个外显子的下游100bp止)总和小于600bp，即将其整合为一个探针，以求通过一对探针完成多对外显子区域的捕获；(4)当所设计探针序列小于250bp时，在其两端各包含上下游100bp的内含子的基础上，各继续增加相同by数的内含子，使探针大小达到250bp。根据以上设计原则，我们针对pof1b基因所设计的探针序列如seqidn0.1—seqidno.24所示。

2.2目标区域捕获及深度测序:

首先将基因组dna片段化，并在dna末端标记‘`a"，与工lluminape接头一寡核苷酸混合物相连接，连接产物经pcr富集，获得dna文库。然后将dna文库与已知致病基因捕获芯片杂交、洗脱、纯化，获得编码序列。最后创建配对末端，在hiseqtm2000(illumina，inc.,sandiego,ca,usa)平台上对目标序列进行测序。

2.3对测序数据进行生物信息学分析，筛选出候选致病基因:

2.3.1采用mosaik软件(http://bioinformatics.bc.edu/marthlab/mosaik)处理工llumina原始测序数据(配对末端数据)，产生.bam类型文件。将.bam文件输入gatk，利用gatk检测单核普酸变异体(singlenucleotidevariant)和小的插入或缺失(insertion/deletions)，同时进行质量评估，便于下游的生物信息学分析，最后产生.vcf类型文件。

2.3.2将患者的测序结果在包括

dbsnp144(http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenpath/hgl9/database/snpl44.txt.gz.),hapma计划(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/hapmap)，1000genomeproject(ftp://ftp.l000genomes.ebi.ac.uk/voll/ftp)，炎黄数据库((http://yh.genomics.org.cnj)以及exomevariantserver(http://evs.gs.washington.edu/evs/)在内的五个单核普酸多态性(snp)数据库中筛查，滤过所有已知的snp位点；

2.3.3将患者的测序结果所对应的基因序列进行比较和分析，优先分析插入/缺失突变、无义突变和错义突变，结果可分为三类，包括已知突变、已知基因的新突变和新基因的突变。

2.4经sanger测序验证，鉴定致病基因:

pcr法分别针对筛选出的突变位点及邻近dna序列在相应家系中进行扩增，所用引物序列采用primer3(http://frodo.wi.mit.edu/)引物设计软件设计。所用pcr的反应体系(20μl体系)为:5*buffer4μl，25mmmgcl22μl，dnalμl，正向引物f1μl，反向引物r1μl，10mmdntp0.4μl，taq酶0.1μl，ddh2o10.5μl。pcr反应程序:98℃5min,35个循环(98℃10s，60℃15s，72℃1min)，72℃7min，4℃5min。1％琼脂糖凝胶电泳检测，与紫外线切胶仪下切取pcr产物凝胶并纯化。对所有的pcr产物分别以正、反向引物测序，并对测序结果进行进一步分析，使用ncb工在线对比工具blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，排除假阳性结果，并筛选出在家族中共分离的突变位点。其中检测chrx-84622737-84622742位核苷酸位点的正向引物序列为seqidn0.25，反向引物序列为seqidn0.26。

实验结果:

1.家系临床资料:

生殖医学临床专家对该家系中的参与研究的两名患者(iii:6,iii:8)进行了详细全面的临床检查后，对该家系内患者iii:6做出了“遗传性原发性卵巢功能不全”的临床诊断，对该家系内患者iii:8做出了“非梗阻性无精子症”的临床诊断。

患者iii:6遗传性原发性卵巢功能不全患者的病史、内分泌检查结果如图2；

患者iii:6遗传性原发性卵巢功能不全患者获卵结果如图3；

患者iii:8无精子症患者睾丸(患者iii:8)病史、其他检查结果如图4；

患者iii:8无精子症患者睾丸穿刺切组织切片he染色结果如图5。

2.该家系遗传检测结果:

通过对家族中的两名患者(iii:6,iii:8)及父母进行了全外显子组测序及生物信息学分析后，我们发现男性患者携带可疑的缺失突变pof1bc.312_316delp.s104fs，而女性患者携带复合杂合突变pof1bc.312_316delp.s104fs以及pof1bc.1325a>gp.e442g。测序结果见图6。缺失突变pof1bc.312_316delp.s104fs位于x号染色体，物理位置为chrx-84622738-84622742位缺失五个碱基tacat；rna水平:pof1b基因编码rna第312至316位碱基缺失；蛋白水平：pof1b基因编码蛋白第104位氨基酸移码突变，该基因相关的缺失突变从未在遗传性卵巢功能不全及无精子症患者中发现。错义突变的pof1b基因所在的物理位置为chrx-84560909-84560909位碱基由a突变为g；蛋白水平：第442号氨基酸错义突变，由谷氨酸突变为甘氨酸，该基因相关的错义突变从未在遗传性卵巢功能不全患者中发现。

根据我们所设计的筛选流程，借助我们所设计的基因芯片及深度测序技术，我们成功证实所检测到的该pof1b基因缺失突变为无精子症新致病基因，pof1bc.312_316delp.s104fs为该疾病的新致病位点。pof1b基因缺失突变及错义突变的遗传性卵巢功能不全的新致病基因，pof1bc.312_316delp.s104fs以及pof1bc.1325a>gp.e442g为该疾病的新致病位点。

实施例2:

针对实施例1中所检测出的致病突变pof1bc.312_316delp.s104fs以及pof1bc.1325a>gp.e442g进行生物学分析。

实验方法:

1.保守性分析:

采用ncbihomologene数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene)对所筛选得到突变在多个物种中进行保守性评估及预测。改为点在进化过程中保守，侧面印证了改位点的突变可能会引起较为严重的病理疾病，结果见图7。

2.蛋白晶体结构改变研究:

采用swissmodel(http://swissmodel.expasy.org/)预测软件对pof1b野生型蛋白及携带有p.s104fs突变的突变蛋白结构分别进行预测，评估突变所引起的蛋白结构改变。蛋白晶体结构预测结果显示，c.312_316delp.s104fs突变引起野生型pof1b蛋白大部分螺旋结构缺失，蛋白三级结构改变；从而进一步影响蛋白功能，结果见图8。

序列表

<110>南京市妇幼保健院

<120>一种遗传性配子发生障碍的致病突变及其检测试剂

<160>26

<170>siposequencelisting1.0

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<213>人工序列(artificialsequence)

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