一种磁珠法快速核酸提取试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及核酸提取技术领域，特别涉及核酸提取裂解液技术领域，具体是指一种磁珠法快速核酸提取裂解液、及其制备方法和在呼吸道病毒检测中的应用。

背景技术：

呼吸道感染疾病，尤其是急性呼吸道传染病，一直是全球致死、致残的重要病因。病毒是造成呼吸道感染疾病最主要的原因，50％以上的呼吸道感染是由病毒引起。常见的呼吸道感染病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞体病毒、冠状病毒等。据统计，上世纪流感病毒致死人数超过1亿人，其中1918年爆发的“西班牙流感”，在不超过11个月的时间里造成全球大约5000万人死亡，成为人类历史上最大的传染病灾难。而进入本世纪以来，新型呼吸道病毒频现，近二十年中已造成三次大规模大流行，包括2003年的重症急性呼吸综合征病毒（sars）、2012年的中东呼吸综合症病毒（mers）和2019年底爆发目前仍肆虐于全球的新型冠状病毒(sars-cov2)，严重危害人类健康甚至生命，导致惨重的社会经济损失。

快速、准确的病原诊断是有效治疗、病情监测和控制疾病蔓延的重要前提。随着检测技术的发展，病原核酸检测由于其高敏感和高特异的检测性能，已成为呼吸道病原诊断的主流检测手段。通过检测患者的鼻咽拭子、气道抽取物或痰液等呼吸道标本中病原体核酸，准确、快速地检测与区分普通呼吸道系统感染与恶性病原感染，对病原感染做出快速诊断，且能快速区分病原型别和亚型/系，为后续采取针对性的防控、治疗措施提供依据和指导。

核酸提取是病原核酸检测的第一步，提取产物的得率和质量直接影响到后续检测结果的准确性和可靠性。高纯度、高浓度的核酸样品是分子生物学实验过程中获得良好实验结果的重要条件之一。目前最常用的核酸提取方法是磁珠吸附法和硅胶膜吸附柱法。硅胶膜吸附柱法快速简便，获得的核酸纯度高，但是对小片段dna或rna提取效率不高，而且不适用于自动化提取流程。磁珠法以超顺磁纳米微球为载体，在微观界面上能与核酸分子特异性地识别和高效结合，可快速分离纯化dna或rna，提取过程无需离心或过滤，既可以手工操作，也可以使用自动化工作平台的形式完成，提取通量高、自动化程度好，适用于大样本量提取的需求。但是目前磁珠法提取也存在一些问题，对微量核酸提取效率不高，提取纯度低且易出现盐分残留，对后续分子检测造成不利影响。尤其是鼻咽拭子这种样本量及其中病毒含量均不高（微量）的样本检测，高效的核酸提取更是至关重要。另外，目前市场上的基于磁珠法的商品化提取试剂盒提取过程一般需要加热步骤进行裂解孵育和核酸洗脱，而加热会对核酸产生一定程度的损伤，特别是对样本中的rna，提取过程中如果采用50-60℃的加热会使样本中自带的、试剂耗材或环境中引入的rnase达到最适温度条件，进而导致rna样本降解损失。这种损失，对检测样本量不高、样本中病毒含量微量的情况更是无法接受的，容易造成严重的结果误判。此外，无论是吸附柱式提取还是磁珠法核酸提取，都存在操作复杂、提取时间长等问题，整个提取过程通常需要30分钟甚至更长时间，不能满足在疫情爆发情况下更简单、更快速的核酸提取需求。因此，在疫情大范围大规模爆发的情况下，改进传统的磁珠提取法，开发出一套更简单、更快速、适用于自动化工作平台的核酸提取纯化方法，为病原核酸检测提供高质量核酸模板，提高检测效率和检测准确度，是疫情防控的当务之急。

技术实现要素：

为解决当前核酸提取（包括磁珠法核酸提取）存在的上述问题，本申请发明人对目前的磁珠法核酸提取步骤进一步优化，对试剂进行改进，自主研发整套提取试剂，提出一种快速核酸（dna/rna）提取试剂盒。本发明的试剂盒及其应用方法快速高效、低成本、无需加热，能够应用于自动化操作平台，且本发明的试剂盒特别适合呼吸道病毒样本（尤其是鼻咽拭子）等微量病毒含量样本的检测，为疫情防控提供有力的支持。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

本发明的第一方面提供一种适用于鼻咽拭子样本的磁珠法快速核酸（dna/rna）提取试剂盒，该试剂盒主要包括飞磁裂解液、磁珠悬浮液、飞磁漂洗液和飞磁洗脱液；其中：

所述飞磁裂解液由以下成分组成：1-50mmtris-hcl（ph6.0-8.0）、1-5m盐酸胍、10-100mm氯化钠、1-50mmedta缓冲液（ph6.5-8.5）、0.1-10%triton-x、50-80%异丙醇、5-10mg/ml的核酸保护肽，以及余量的水，飞磁裂解液的ph为6.5-8.5。优选地，所述裂解液组成为：50mmtris-hcl（ph6.0-8.0）、3m盐酸胍、100mm氯化钠、20mmedta缓冲液（ph6.5-8.5）、0.5%tritonx-100、50%异丙醇、8mg/ml的核酸保护肽，裂解液的ph为7.0。

本发明的核酸保护肽具备良好的抗变性剂能力，在裂解液中能够保持多肽形态，并能够在ph6.5以上与核酸结合，防止其降解；但在ph低于6.5以下时（如6.0）时能够与核酸分离，使其不受影响最大程度与磁珠吸附。同时，本发明的多肽能够起到一定的核酸酶活性抑制剂功能，进一步起到防止核酸酶对核酸的降解。

所述磁珠悬浮液由以下成分组成：体积分数为70-80％的超顺磁微球，所述超顺磁微球的粒径介于10～50nm，磁珠悬浮液ph4.0-6.0。优选地，所述磁珠悬浮液组成为体积分数为70％的磁球，磁珠粒径介于10～50nm，30%的无核酸酶水，磁珠悬浮液ph5.0。所述磁珠悬浮液于4-8℃储存，不能冷冻。

所述飞磁漂洗液由以下成分组成：1-50mmtris-hcl（ph6.0-8.0），10-100mm氯化钠，1-10mmedta缓冲液，50-80％无水乙醇。优选地，所述飞磁漂洗液的组成为：20mmtris-hcl、10mm氯化钠，2mmedta，80％乙醇。

所述飞磁洗脱液由以下成分组成：1-10mmtris-hcl（ph6.0-8.0），以及余量的无核酸酶水。优选地，所述飞磁洗脱液组成为：5mmtris-hcl（ph8.0）。

另一方面，本发明提供一种利用本发明试剂盒从呼吸道病毒样本（尤其是鼻咽拭子样本）中提取病毒核酸的方法。所述方法包括如下步骤：

（1）样本准备：取采样鼻咽拭子样本浸泡于生理盐水中，充分震荡混匀后，静置2-5min，然后800-12,000rpm离心，制成病毒样本保存液，取200-400μl病毒样本保存液用于检测；

（2）样本裂解：向步骤（1）检测样本中加入1-2倍体积的本申请的飞磁裂解液，震荡混匀后离心，得样品裂解液；

（3）核酸吸附：向步骤（2）所述样品裂解液中加入10-50μl磁珠悬浮液，混匀后置于磁力架上，静置，待磁珠完全吸附后用弃去液体，得吸附后磁珠；

（4）漂洗：向步骤（3）所得磁珠中加入300-600μl飞磁漂洗液，震荡混匀后置于磁力架上，静置至磁珠完全吸附后，弃去所有液体，保证无液体残留；

（5）样本洗脱：向步骤（4）所得漂洗后磁珠中加入40-100μl飞磁洗脱液，震荡混匀后置于磁力架上，待磁珠吸附后，收集洗脱后所得的核酸溶液，置于-80℃保存。

优选地，所述步骤（1）为：取采样鼻咽拭子样本浸泡于500μl生理盐水中，充分震荡混匀后，静置2-5min，然后800-12,000rpm离心，制成病毒样本保存液，取200-400μl病毒样本保存液用于检测；

优选地，所述步骤（2）为：向步骤（1）检测样本中加入1-2倍体积的飞磁裂解液，漩涡震荡3-8秒后离心，得样品裂解液；

优选地，所述步骤（3）为：向步骤（2）所述样品裂解液中加入10-50μl磁珠悬浮液，漩涡震荡3-8秒后，室温下在恒温混匀仪上800-1200rpm混匀2-5min，混匀后置于磁力架上，静置1-2min，待磁珠完全吸附后用弃去液体，得吸附后磁珠；

优选地，所述步骤（4）为：向步骤（3）所得磁珠中加入300-600μl飞磁漂洗液，漩涡震荡5-10秒后，置于磁力架上，静置至磁珠完全吸附后，弃去所有液体，保证无液体残留；

优选地，所述步骤（5）为：向步骤（4）所得漂洗后磁珠中加入40-100μl飞磁洗脱液，漩涡震荡5-10秒后，室温条件下，恒温混匀仪上800-1200rpm震荡混匀3-5分钟后，置于磁力架上，待磁珠吸附后，收集洗脱后所得的核酸溶液，置于-80℃保存。

本发明提供的飞磁裂解缓冲液在裂解病毒和细胞样本时，在室温无需加热的条件下，能保证核酸与核酸结合蛋白迅速彻底分离，释放大量核酸，并且在裂解后能使变性蛋白质仍然具有较高的溶解度，裂解液中的核酸保护肽不仅能够与核酸结合，起到核酸保护作用，且具备一定的核糖核酸酶活性抑制剂功能，防止核酸酶对核酸的降解作用，进一步保护核酸分子。此外，裂解液还兼具核酸结合液的功能，裂解、结合两步合并为一步法，操作简单，后续加入磁珠悬浮液以后，裂解液中释放出来的核酸与磁珠高效特异吸附结合。

本申请所述核酸保护肽的氨基酸序列为：mvrsssrtpsdkpvahrranallaqlqwlnvvanpqrranallangvelrdnqlvvpseglyliysgcpsthvlkspcqretlthtisriavsyqtkqvlfkgqlthtivnllsaiwyepiylsriavsyqtkyfgiialdfaesgqvakpwyepiylakpwyepiylpegaeakpwyepiylinrpdylggvfqlekgdrlsae。

本发明的飞磁裂解液中，tris-hcl可以提供ph6.0-9.0稳定的缓冲环境，维持核酸磷酸基团与磁珠的带电状态，利于氢键的保持，对dna碱基起保护作用，不易破坏其完整性或产生断裂。盐酸胍是破坏蛋白质三维结构的离液剂，它们可以使多数蛋白质转换成一随机的卷曲状态，盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂，可以使蛋白变性，强度一般，在核酸提取中的主要作用是使蛋白质变性并抑制核酸酶活性，盐酸胍能够快速破坏细胞膜或病毒，释放核酸，使蛋白质变性，从而让核酸能够摆脱蛋白质的缠绕，并与edta协同作用防止dna/rna被核酸酶降解。nacl能提供一个高盐环境，在高盐条件下，蛋白与dna/rna分离，盐的阳离子会与dna/rna形成dna/rna-阳离子盐，使dna/rna充分溶解于液相中。乙二胺四乙酸(edta)是一种二价离子螯合剂，能够螯合mg²⁺、ca²⁺或mn²⁺等二价阳离子，抑制金属依赖性的酶如dnase和rnase的活性，能够抑制核酸酶对裂解后游离暴露出来核酸的降解，从而减少提取过程中游离核酸的损失。而本发明的核酸保护肽能够在ph6.5以上时与核酸结合，防止其降解；但在ph低于6.5以下时（如6.0）时能够与核酸完全分离，使其不受影响最大程度与磁珠吸附；并且，本发明的多肽能够起到一定的核酸酶活性抑制剂功能，进一步起到防止核酸酶对核酸的降解，保证核酸最大程度的保留。tritonx-100是一种比较温和的非离子型表面活性剂（或称去污剂），它能溶解脂质，同时具有促进氢键和阳离子桥形成的作用，常作为添加剂使蛋白保持稳定，特别是使膜蛋白保持其天然构象。异丙醇：主要作用是沉淀核酸。

超顺磁微球简称磁珠，是运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后制备成的超顺磁性氧化硅纳米磁珠。磁珠的内部是一个磁核，外部是一层包覆层，表面分布着许多活性基团，能在微观界面上与细胞、蛋白质、核酸、酶等生化试剂发生偶联，在外部磁场的作用下，磁珠可以定向移动，实现与介质溶液的分离。在胍盐(盐酸胍、异硫氰酸胍等)和外加磁场的作用下，磁珠与核酸分子特异性地识别和高效结合，能将生物制品以及环境、食品等样本中的核酸分子（dna和rna）分离出来。本发明所选磁珠具有超强的顺磁性，粒径介于10～50nm，粒径小、颗粒均一且粒径分布范围窄，有足够强的磁响应性，在外加磁场的作用下能迅速聚集，离开磁场能够均匀分散，不出现聚集现象，也不会因粒径太大而发生沉降，结合本发明的飞磁裂解液，能高效特异吸附样本裂解释放出来的核酸分子，并在漂洗和洗脱过程中，漂洗液和洗脱液分散或聚集，缩短提取时间。

发明人发现，使用本发明提供的磁珠法快速核酸提取方法和配套试剂和耗材，能够快速完成对拭子样本的核酸提取，操作快速简便，手动操作仅需要5分钟即可完成一次提取过程；而使用康为的cwe2100和cwe9600全自动核酸提取仪，而且操作简单，一次可在10分钟内完成96个样本的高质量提取，简便快捷。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：

使用的磁珠法快速核酸（dna/rna）提取试剂盒包括飞磁裂解液、磁珠悬浮液、飞磁漂洗液和飞磁洗脱液；其中：（1）飞磁裂解液组成为：50mmtris-hcl、3m盐酸胍、100mm氯化钠、20mmedta缓冲液、0.5%tritonx-100、50%异丙醇、8mg/ml的核酸保护肽，裂解液的ph为7.0；（2）磁珠悬浮液组成为体积分数为70％的磁球，磁珠粒径介于10～50nm，30%的无核酸酶水，磁珠悬浮液ph5.0；（3）飞磁漂洗液由以下成分为20mmtris-hcl、10mm氯化钠，2mmedta，80％乙醇；（4）飞磁洗脱液组成为：5mmtris-hcl（ph8.0）。

我们以猪圆环病毒（pcv，dna病毒，对人不具有感染性）和禽ibv病毒（rna病毒，对人不具有感染性）作为模型，检测本试剂盒对呼吸道病毒拭子样本的提取效果。使用本发明提供的试剂盒进行手动核酸提取方法和，对不同病毒滴度的4个猪pcv病毒鼻拭子样本和4个禽ibv病毒拭子样本（由江苏华创信诺医药科技有限公司提供，弱毒株）测试本试剂盒对拭子样本的核酸提取效果。具体包括以下步骤：

（1）样本准备：取采样鼻咽拭子样本浸泡于500μl生理盐水中，充分震荡混匀后，静置3min，然后10,000rpm离心，制成病毒样本保存液，取300μl病毒样本保存液加入1.5ml离心管中；

（2）样本裂解：向步骤（1）检测样本中加入300μl的飞磁裂解液，漩涡震荡5秒后，瞬时离心，确保管壁、管盖上无液体残留；

（3）核酸吸附：向步骤（2）所述样品裂解液中加入50μl磁珠悬浮液，漩涡震荡5秒后，置于室温，恒温混匀仪上1200rpm震荡混匀2分钟后，将离心管置于磁力架上，静置1分钟，待磁珠完全吸附后用移液器小心吸弃所有液体，得吸附后磁珠；

（4）磁珠漂洗：向步骤（3）所得磁珠中加入500μl飞磁漂洗液，漩涡震荡5秒后，恒温下置于磁力架上，静置至磁珠完全吸附后，弃去所有液体，保证无液体残留；

（5）核酸洗脱：向步骤（4）所得漂洗后磁珠中加入100μl飞磁洗脱液，漩涡震荡5秒后，室温条件下，恒温混匀仪上1200rpm震荡混匀3分钟后，将离心管置于磁力架上，待磁珠吸附后，收集洗脱后所得的核酸溶液，置于-80℃保存。

同时，按照上述相同方法，设置手动对照组，手动对照组使用上述相同方法进行核酸提取，区别在于，使用的试剂盒中，以等摩尔浓度的蛋白酶k代替本申请的核酸保护肽。

实施例2

使用实施例1相同的试剂盒，与自动核酸提取仪cwe2100配套使用，对实施例1中的4个猪pcv病毒拭子样本和4个禽ibv病毒拭子样本进行核酸提取测试，具体包括以下步骤：

（1）样本及试剂准备

取96孔深孔板（cwe2100配套耗材），按照下表向96孔深孔板中加入相应试剂：

（2）核酸提取

将上一步加好样本和试剂的96孔深孔加样板放入cwe2100仪器，放入磁棒套，运行程序

约7分钟后取出96孔深孔板，将第6、12列的核酸样本转移至干净的离心管（无核酸酶，自备）中，-80℃保存。

同样，按照相同方法，设置对照组，对照组使用上述相同方法进行核酸提取，区别在于，使用的试剂盒中，以等摩尔浓度的蛋白酶k代替本申请的核酸保护肽。

实施例3

（1）核酸浓度纯度检测：

实施例1、实施例2中提取的猪pcv和禽ibv病毒拭子样本，提取后的总核酸使用qubit测定浓度，并采用nanodrop测定dna纯度，结果如表1所示，采用手动提取和cwe系列自动提取仪提取的核酸，提取总量（浓度）和纯度（od260/280）基本相当，没有明显差异，核酸纯度较好，蛋白质污染较少；效果明显优于使用蛋白酶k的对照组。

表1.采用手动提取和cwe2100自动提取仪提取总核酸质量检测

实施例4

重复实施例1的实验，其中除磁珠悬浮液ph分别采用7.0、6.5、6.0和5.0，其余试剂及方法均与实施例1相同，取2个猪pcv病毒鼻拭子样本和2个禽ibv病毒拭子样本检测；结果如表2所示。

由实施例4结果可知，本申请使用的飞磁裂解液中的核酸保护肽在飞磁裂解液中（ph7.0左右）能够与裂解释放出来的核酸结合起到很好的保护作用，在加入磁珠悬浮液以后，溶液ph降低的情况下，能够释放核酸，不会影响核酸提取结果。

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