小麦籽粒大小性状相关基因TaSRK、其编码蛋白及应用的制作方法

2021-02-02 18:02:20|

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本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种小麦籽粒大小性状相关基因tasrk、其编码蛋白及应用。

背景技术：

小麦是我国重要的粮食作物之一，它为人类提供50%的食物能量。基于此，提高小麦单产和总产对我国经济发展及粮食安全具有着重要的意义；同时提高单产及总产也是我国小麦育种家长期追求的重要目标之一。

目前，小麦的籽粒大小相关基因主要是通过从模式作物水稻同源克隆的方式，克隆后进一部验证是否具有功能特征。水稻作为模式作物之一，对于籽粒大小相关的研究取得了较大的进展。主要通过数量遗传学和图位克隆的方法分离与籽粒大小、粒重有关的基因。

关于此类研究机制主要涉及以下几种途径：通过由泛素介导的蛋白酶体（gw2andgw5/qsw5）降解、g蛋白信号途径（gs3和dep1）、转录调控相关途径（gs2）、植物激素（tgw6、ckx2、gs6和gnp4/lax2）四个途径，还有其它未知途径（gs5和gw8）。而小麦拥有庞大、复杂的基因组。根据基因的同线性和共线性，比较基因组学为不同谷类作物之间克隆序列保守基因提供了可能。

通过同源克隆的方法从普通小麦中分离出一些与籽粒大小相关的基因。例如，编码普通小麦蔗糖合成酶2（tasus2）的基因、编码假定细胞分裂素氧化酶的基因（tackx2.1和tackx2.2）、细胞壁蔗糖转化酶基因tacwi-a1等被成功克隆出来，并进行了染色体定位。控制小麦粒宽与粒重的tagw2和tagw7基因也被同源克隆分离出来，它们负调控小麦粒宽和千粒重。tada1基因（da1-related1）作为小麦籽粒大小的负调控因子与tagw2相互作用影响小麦籽粒重量，具有加性遗传效应。同源克隆小麦籽粒大小相关基因tags5-a1也被证实与籽粒大小、千粒重和株高等有关联，并挖掘了能使籽粒增大的优良基因型tags5-a1b或tags5-3a-t，可应用于小麦高产育种中。

然而，新的小麦籽粒大小性状相关基因挖掘工作进展缓慢，迄今为止，对控制小麦籽粒大小相关新基因的克隆仍鲜有报道，这也限制了其在育种方面的应用。因此，另辟蹊径分离获取新的籽粒大小相关基因并对其功能进行研究，对于解析小麦籽粒大小背后的分子机制具有重要意义。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种小麦籽粒大小性状相关基因tasrk、其编码蛋白及应用，以获得更加丰富的小麦籽粒大小性状相关基因，提供更多样化的小麦育种手段。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

筛选得到一种小麦籽粒大小性状相关基因tasrk，其基因组核苷酸序列如seqidno.1所示；其全长cdna核苷酸序列如seqidno.2所示；其cds核苷酸序列如seqidno.3所示。

一种小麦籽粒大小性状相关蛋白tasrk，其氨基酸序列为：

（1）如seqidno.4所示的氨基酸序列；或

（2）在seqidno.4所示的氨基酸序列的基础上进行一个或多个氨基酸的添加、删除或替换而获得活性片段或保守性变异体的序列。

扩增上述基因的引物对，其全核苷酸序列为：

tasrk-1f：5’-tgatttacactcgttccaacca-3’；

tasrk-1r：5’-cttccggaacgacaggcacg-3’；或

tasrk-2f：5’-atgtctgtcccgcgtcccattg-3’；

tasrk-2r：5’-ctaggtgcatgctgagtgtg-3’。

设计一种包含任一项所述基因构建的表达载体和一种由所述表达载体构建的重组菌。使用本发明的基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子；为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记（gus基因、萤光素酶基因等）或具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素、卡那霉素等）。

将任一项所述基因在制备转基因植物细胞中应用。将任一项所述基因和/或所述蛋白在植物育种中应用。携带有本发明tasrk的表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株；被转化的宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。

与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：

1.本发明首次公开、并确认了一个全新的小麦籽粒大小相关基因，命名为tasrk，明确了小麦籽粒大小相关基因tasrk的dna序列，cds序列和编码蛋白序列，该基因位于小麦染色体2a上，编码框的长度为2508bp，其表达的蛋白可调控小麦粒长和粒重。

2.本发明有助于揭示小麦籽粒大小的分子遗传基础，同时对利用基因工程技术提高小麦产量和快速高效培育高产小麦品种起到重要作用，为小麦育种的应用实践打下基础。

附图说明

图1为tasrk在种子不同发育阶段的豫农201（yn201）和豫农3114（yn3114）中的相对表达量图；

图2为tasrk在过表达转基因株系（oe-1、oe-2和oe-3）与对照轮选987（lx987）中相对表达量图；

图3为plgy-02载体质粒图谱；

图4为过表达转基因株系（oe-1、oe-2和oe-3）与对照（lx987）的在抽穗期或者开花期的田间表型图；

图5为过表达转基因株系（oe-1、oe-2和oe-3）与对照（lx987）不同种子发育阶段的比较图；

图6为过表达转基因株系（oe-1、oe-2和oe-3）与对照（lx987）中粒长、粒宽、籽粒大小以及粒重的统计比较图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。引物合成及测序工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

实施例1：小麦籽粒大小性状相关基因tasrk的获取

采用正向遗传学结合转录组测序进行小麦籽粒大小性状相关基因挖掘，具体如下：

（1）对来自黄淮麦区的163份小麦资源构建的自然群体，进行3年14个环境点的粒长、粒宽、千粒重和粒重的调查；结合小麦90k基因芯片数据，对上述材料进行小麦籽粒大小性状全基因组关联分析（genome-wideassociationstudy，gwas）。

结果鉴定到4个籽粒大小相关的显著性snp位点，分别是tdurum_contig27861_306、wsnp_ex_c42720_49228237、rac875_c69068_71、wsnp_ku_c2413_4626451，位于2a染色体上的504278926～526300474区段。

（2）用0.8%甲基磺酸乙酯（ems）对优质面条小麦品种豫农201种子进行诱变处理，从2000个m2代诱变群体中筛选出一个具有不同株型、长籽粒、高粒重小麦品系，连续自交4次后，得到m6代稳定品系豫农3114。高产豫农3114籽粒长度（7.5cm/10粒）和千粒重（45.1g）显著增加，而野生型豫农201的10粒长度和千粒重分别为6.4cm和39.7g。

在2011-2012年度，将豫农201(yn201)和豫农3114(yn3114)种植在河南农业大学科教园区（郑州：n34.9°、e113.6°）无胁迫的自然土壤环境中。对豫农201和豫农3114开花后不同发育阶段（开花后7d、14d、21d、28d和35d）的种子以及成熟的种子进行取材，取样的种子进行转录组测序；并对转录本进行无参拼接。

生物信息学分析结果显示：380个差异unigenes在豫农201和豫农3114富集在“recognitionofpollen”途经。69个上调unigenes和54个下调unigenes在swissprot数据库中有注释信息，分别编码蛋白19和22个。大多数编码受体蛋白激酶（receptor-likeproteinkinase，rlk）家族蛋白，特别是g型凝集素受体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（g-typelectins-receptor-likeserine/threonineproteinkinase，srk）。其中，1个rlk蛋白（sp|o64477|y2913）被18个unigenes和10个unigenes编码；用unigenes进行中国春数据库检索，发现该基因位于2a染色体上的515292584～515295492，定位在上述粒重gwas的关联区间。由于该基因属于srk家族基因，将该基因命名为tasrk。

（3）为验证上述豫农201和豫农3114的粒长和粒重的差异是否由基因tasrk的点突变控制，将该基因在豫农201和豫农3114中分别进行克隆测序。

具体步骤如下：

1）dna的提取

利用sls法分别提取豫农201和豫农3114苗期dna。

2）总rna提取及cdna第一条链的合成

利用trizol试剂分别提取豫农201和豫农3114苗期总rna。取质量符合要求的总rna，参照primescript^tmrtreagentkit（perfectrealtime）说明书进行cdna第一条链的合成。

3）tasrk基因的克隆及序列分析

设计巢式pcr引物，tasrk-2f和tasrk-2r分别设计在起始密码子atg和终止密码子taa两端，分别如下：

tasrk-1f：5’-tgatttacactcgttccaacca-3’；

tasrk-1r：5’-cttccggaacgacaggcacg-3’；

tasrk-2f：5’-atgtctgtcccgcgtcccattg-3’；

tasrk-2r：5’-ctaggtgcatgctgagtgtg-3’。

以豫农201和豫农3114的dna为模板，用tasrk-1f和tasrk-1r组成的引物对进行pcr扩增，pcr产物进行1%琼脂糖胶电泳，回收后连接到pmd18载体（takara），送生工进行测序；

pcr反应液（50μl体系）：10×pcrbuffer（25μl），ddh2o(9μl），dntp（10μl），tasrk-1f（1.5μl），tasrk-1r（1.5μl），dna（2μl），takaralataq酶（1μl）；pcr参数：先94℃4min；随后94℃30s，60℃30s，72℃2min30s，共35个循环；再72℃10min。

用上述类似的方法再以豫农201和豫农3114的cdna为模板，用tasrk-1f和tasrk-1r组成的引物对进行pcr扩增，以得到的pcr产物为模板，用tasrk-2f和tasrk-2r组成的引物对进行巢式pcr扩增跑胶，回收后连接到pmd18载体（takara），送生工进行测序；pcr反应体系和参数同上述方法。

测序结果表明：以小麦豫农201的dna为模板进行pcr扩增得到的dna片段为tasrk基因的基因组水平序列，如序列表seqidno.1所示，其长度为3965bp，不含内含子。以小麦豫农201的cdna为模板第一次pcr扩增得到的dna片段为tasrk基因的cdna序列，如序列表中seqidno.2所示，其长度为3965bp；用tasrk-2f和tasrk-2r组成的引物对进行巢式pcr扩增得到的dna片段为tasrk基因的完整开放阅读框架（orf）序列，如序列表中seqidno.3所示，其长度为2508bp，为序列表seqidno.1中自5'末端第783～3290位的脱氧核糖核苷酸序列，并编码如序列表seqidno.4所示的氨基酸序列，氨基酸的个数为835。将豫农3114基因序列同野生型豫农201序列进行比对发现，在该基因cds序列的第1033碱基处，有1个核苷酸由c突变为t，从而导致翻译的氨基酸由精氨酸变成的半胱氨酸，该基因cds序列如seqidno.3所示。推测tasrk是造成豫农201和豫农3114的粒长和粒重差异的关键候选基因。

实施例2：tasrk的荧光定量分析

（1）对转录组测序的豫农201和豫农3114开花后不同发育阶段的种子进行荧光定量分析；总rna的提取及cdna的反转录同实施例1。

针对tasrk基因序列设计荧光定量特异性引物如下：

tasrk-3f：5’-acacatgccaaacagttccc-3’；

tasrk-4r：5’-tgacccggctaaaatccctt-3’；

内参基因选用β-actin（genbankaccessionno.ab181991），引物序列如下：

β-actin-f：gttccaatctatgagggatacacgc；

β-actin-r：gaacctccactgagaacaacattacc。

荧光定量用美国伯乐bio-radiq5real-timepcrdetectionsystem进行。20μl的反应体系，上下游引物各0.4μl，gotaq®qpcrmastermix(perfectrealtime；promega)10μl，nuclease-freewater7.2μl。pcr程序：95℃for3min，95℃for5s，60℃for30s，72℃for30s，40个循环数。

取2μlpcr反应产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（eb）染色，uv扫描成像后确认是否与扩增曲线结果吻合。以7d的豫农201种子为对照，采用2^-△△ct法计算tasrk基因的相对表达量，结果如图1所示。

如图1所示，豫农201相比，tasrk在豫农3114不同发育种子中表达下调，符合转录组数据的表达模式。

实施例3：tasrk转基因小麦的获得及其鉴定

（1）tasrk植物过表达载体的构建

根据实施例1中克隆的tasrk的全长cdna序列设计引物，并在引物两端分别引入限制性内切酶bamhi和spei识别位点及保护碱基，引物序列如下：

tasrk-5f：5’-cgggatccatgcctctcccggtcctg-3’；

tasrk-6f：5’-cgactagtcaggtgcatgctgagtg-3’；

表达载体选择plgy-02，其载体图谱如图2所示。

将上述2508bp的dna片段克隆入植物表达载体plgy-02的酶切位点bamhi和spei之间，得到含有小麦tasrk基因的重组表达载体，命名为plgy-02-tasrk。

（2）tasrk转基因小麦的获得

将plgy-02-tasrk用农杆菌浸染法转化小麦轮选987（lx987）的幼胚愈伤组织，经过筛选、预分化、分化得到转基因小麦植株。

（3）转基因小麦的pcr鉴定

利用潮酶素标签（hyg）引物hyg-1f和hyg-2f引物对t1代转基因植株进行阳性鉴定，引物序列如下：

hyg-1f：5’-cgagtacttctacacagccatc-3’；

hyg-2f：5’-gtctgtcgagaagtttctgatcg-3’；

共获得10个阳性转基因植株，经过加代，获得t3代纯合转基因株系oe1、oe2和oe3。

实施例4：tasrk转基因小麦的表型鉴定

利用tasrk-3f和tasrk-4r引物，荧光实时定量pcr检测基因tasrk在t3代阳性转基因株系叶片中的表达量，结果如图3所示。

从图3可以看出，tasrk在t3代阳性转基因株系oe1、oe2和oe3叶片中的表达量显著高于对照，为对照叶片中表达量的7倍左右。

2019年，对t3代过表达转基因株系（oe1、oe2和oe3）与对照lx987进行田间抽穗期和开花期的调查和记录，表型结果如图4所示。

由图4可知，与对照lx987植株比较，t3代过表达转基因株系（oe1、oe2和oe3）抽穗期（a）和开花期（b）均提前4d左右。

分别在开花后第7、14、21、28、35d取t3代过表达转基因株系（oe1、oe2和oe3）和对照lx987的种子和成熟种子，对不同发育阶段的5粒种子的长和宽进行了拍照，并进行测量和称重。结果如图5和图6所示。

由图5可知，与对照lx987比较，不同发育时期的种子的粒长在t3代过表达转基因株系（oe1、oe2和oe3）有所增大，而粒宽变化不明显。

由图6-a可知，在籽粒长度方面，t3代过表达转基因株系（oe1、oe2和oe3）与对照lx987在开花后7d、14d和21时没有显著差异，直到灌浆后期和种子成熟时呈现显著的增加。

由图6-b可知，t3代过表达转基因株系（oe1、oe2和oe3）与对照x987在籽粒宽度上无显著差异。

由图6-c可知，与对照lx987比较，t3代过表达转基因株系（oe1、oe2和oe3）籽粒面积变小。

由图6-d可知，与对照lx987比较，t3代过表达转基因株系（oe1、oe2和oe3）在灌浆中后期和成熟种子中粒重呈现显著的降低。

综上，本发明的小麦籽粒大小性状相关基因tasrk可调控小麦籽粒长度和粒重，可用于研究控制小麦籽粒大小相关性状的分子机理研究，在小麦育种方面有着重要的应用价值。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明；但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明技术构思的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，或者是对相关技术特征进行等同替代，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

序列表

<110>河南农业大学

<120>小麦籽粒大小性状相关基因tasrk、其编码蛋白及应用

<130>2020

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3965

<212>dna

<213>triticumaestivum

<400>1

attggggttagtatacaattaccttttttctttcttttctgtcatattctcccctttgac60

cattgttcaaggtttttaccatattcatgtagccatcttggcaacttagtaatgccactt120

cacttccttgacctttcttgagggttttcaccctattcttgtggctaagctgaattcatc180

caaaaaaacacgcaaacaattatataatatttcaacgtgagctcccggatgtttcgtgtc240

ccagacaccgctttgacctgaacacctcgttcactcgccatgcctctccttctatgctcc300

cgtcgagctccgccaagagatggacaagccgtgaaattcttatcgattccatgacgtcga360

gattcattgcaagacacgttttttggaagaaaaaaatagcagcgcggtcaccatcggaga420

aaagttccattctactccctccgtaactaaatataaggcattttttatgccctatactaa480

ataaaaaaaacatgttacaatttgatacaaatgtagtgttttttaacacggtataaacgc540

agatgtttactgcacacacacctacattatcacacgcacagaaggagcgttccgcgaaca600

gcccgaatgggcagcacaagttgccaaccctcgttttcacccatgaagtcaatcctcaaa660

tgatgatttacactcgttccaaccatcgattattcaaagactcgttttcaccaaggatgt720

ctgtcccgcgtcccattgaccaacccacgcaccgtcctcacctcaacagctctcgcctcg780

ccatgtctgtcccgcgtcccattgaccaacccacgcaccgtcctcacctcaacagctctc840

gcctcgccatgcctctcccggtcctgctcgccctgctctgcgccctacacgcccccgcga900

gctccgcgtccacggcgacctactccctctcgccaggccagtcgctcgccggcgacgaca960

agctcgtctccggcggcggcaagttcgcgctcggcttcatccagatcccaggcagcgaca1020

gcaacccctccggctccggcggcaacagcactcagctgggcatatggttcagcctcaacc1080

gtgttcccaagctgacactggtgtgggtggccaacaggggaggcagcccggtggccggcg1140

ccgcgtccccggagctcacgatctccggcgacggcaacctcgtcatcgtggaccgcggca1200

aagtcgcctggtccacccgagccgacgtcacagccaacaacaacaacaacagggcggtcc1260

tccttctcctggacaccgggaacctcgtgttgcgcagcgcctccaacgcctccgacgtga1320

tgtggcagagcttcgaccaccccacggacactctgctccccggcgccaccatcgggctgg1380

acaaggtcaccggccggagccgccgcctcgtctccaggaagaaccggatcgaccaggctc1440

cgggcgcctactccatggagctgggccggagcggcgtcgtccagatgctgtgggacgcgt1500

ccgtgccctactggtccagcggggagtggaacggcgactacttcagctcggtgccggaga1560

tgaccgcccgccacctgataggctccaccttcgtcaacgacgaccgggaggtgtccttcg1620

cctaccacctgctcgacgaaaccatcaccatgtacagcttcctggacgtgtccgggcaga1680

ggaagatgctggtctggcaggatgccacgcgggactgggtgacggtctacgtccacccca1740

ccacccagtgcgaggtgcacgccgtctgcgggccattcacggcctgcgacgagagcgcgc1800

cggcgccgtgcagccgcatgaaggggttctccgtgggttcgcctgaggattgggaccttg1860

acgatcggagcacgagcggttgcagaaggaacactcagctgaattgtgctagcattagca1920

acggcaccatggttggcatggctgacatgttctacgccatgccggccgtcaggttaccct1980

ataacccccacggcgccgcgggatatgtcgccagcgcagccgaatgcgagcaggtctgtc2040

tgagcaactgctcttgcactgcatattcctttggcagtggtggctgttctatgtggcatg2100

gtggattgctgaacgtaaaacaacgccagattgatggtgcttcttccagcggtgatggcg2160

aaattcttcacatccgcctcgcggcgaaagagttccggacccggaaaaacaacagtgtag2220

ttatcattttggttgccattggtgcaggcctcaacgctttggttatcttggtactcgtcg2280

tagcgctacgcaggaccaggaggaacaaaaggtacagtgaaacattggacaaaatccatg2340

gtggcagtgggcttgtttcattcagatacagcgatttgcggcgtgcaactagagatttct2400

cagagaagattggggcaggtggttttggttctgtgttcaaggggtcgctaaatgattcga2460

ccactatagcggtgaagaggctttacggttgttatcaacaagagaagcagttcagggctg2520

aggcgagttcaattggaatcctccaccatacaaatttagtcaaaatggttggtttctgtt2580

gtgagggcgacaagaagcttcttgtctacgaacacatgccaaacagttcccttgatgccc2640

atctgttcaggagcagtgccaaagctctgaattggagaaccagataccagatagctcttg2700

gagttgccagggggctggcatacttgcacgagagctgcctggactacatcatacactgcg2760

atataaagccgcaaaacatacttctcgacgcgttgttcgttcctaagatcgccgacttcg2820

ggatggcaaagcttctcacaagggattttagccgggtcatgaccacaaccaggggcacaa2880

ttgggtaccttgcccctgaatggatcagtggagtggccatcacgcccaaagtcgatgtgt2940

atggatatgggatggtgctactggagatcatatccgggaggatgaacgcgaacgaagaat3000

gcggcagcagtggtgatggcattgtttatttccccatccagatggcgcgcaagcttctcg3060

agggaaacgtcatgagcttcgtggatgataggttaaacggtgatgttatcgtcgacgagg3120

ttgaaagggcttgcaaggttgcctgttggtgcattcaggacagggagtttgaacggccaa3180

cgatgggcaaggtagtccagattcttgagggtcttgttgaagtcgacacccctccgatgc3240

ctaagctactcgaagctatcgccggaagatcacactcagcatgcacctagcctggtaacc3300

gcggacggccgttagcgtggcttgcattcacctggtctaacatatatgtccatgtaccag3360

tctcaaagaagccaagcgtcgtgcctgtcgttccggaagccgagcttgtcgccgctgcca3420

agtggttggcgagctgacatggtgtccgtcgcagcagagcttgtcacaacgatgtgtagg3480

tggaagatcacggtgaaaacaaagatgggtaaaagatgtgtagctattcaagtacaacca3540

tcaaattaactagtggagggaaaatatgttccaatggcgatctaagaccggatgttaggc3600

ttaacttagtgatgagctgcacgaccaatgggcattacaacgaccgacgtcgtctcgtct3660

tcctagaatatagtactactgttcatgaacctaaaataatttttgtttgacagtttcctg3720

aatgaacctaaaataagttgacagtggggcacggcgcaagaactcaagtgatctgctggc3780

gcaacaccaaaacagcagagacaccaccagattgatgtagagtttattacgtacttccct3840

gaatttaacaaactgaaaatgggcaagttttgagactaacggagggaggctattgattgt3900

cttttgagtggacatgttactactatcagttgatgaattttttttaaaaaaaagaggtaa3960

aaata3965

<210>2

<211>3965

<212>dna

<213>triticumaestivum

<400>2