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您当前的位置： 兔源对氧磷酶1突变体及其重组表达方法与流程
2021-02-02 18:02:15|
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起点商标网 本发明涉及对氧磷酶1突变体，尤其涉及兔源对氧磷酶1突变体及其编码基因及其在原核表达系统中的重组表达方法，属于兔源对氧磷酶1突变体及其重组表达领域。
背景技术：
：：pon1(paraoxonase1)对氧磷酶1，酶学分类ec3.1.8.1，属于内酯酶家族。自上个世纪50年代以来，不断分离到了源自于哺乳动物血清的对氧磷酶pon1，从兔子、老鼠、牛和人等动物体内均已克隆到pon1以及同源基因(mackness,m.andb.mackness,humanparaoxonase-1(pon1):genestructureandexpression,promiscuousactivitiesandmultiplephysiologicalroles.gene,2015.567(1):p.12-21.)。对氧磷酶是哺乳动物尤其是人类防护和解毒的一道天然屏障，对于保护机体免受有机磷损害具有十分重要的作用，可高效降解内酯、芳香酯和有机磷酸酯；作用的酯键有p-o、p-f、p-cn以及p-s，对有机磷神经毒剂沙林、梭曼、塔崩和vx均具有降解作用，也可降解一些有机磷农药，如对氧磷、毒死碑氧磷、敌匹硫磷等，在有机磷中毒防治中具有重要的作用。同时，研究发现pon1在体内通过降解同型半胱氨酸硫内酯、芳香酯和抑制脂蛋白氧化而发挥pon1对心血管系统和肝脏的保护作用，具有抗氧化、抗炎，调节脂质代谢的功能，参与预防和抑制ⅱ型糖尿病、动脉粥样硬化、冠心病、肿瘤等多种疾病的发生。天然pon1的产量低，从血清中分离提取的方法获得大量pon1制剂并不现实，近年来通过将pon1整合到昆虫表达系统和哺乳动物细胞表达系统中，解决了pon1体外重组表达的难题，并且可以提供高纯度的活性蛋白(gaidukov,l.,etal.,invivoadministrationofbl-3050:highlystableengineeredpon1-hdlcomplexes.bmcclinpharmacol,2009.9:p.18.kirby,s.d.,etal.,humanparaoxonasedoublemutantshydrolyzevandgclassorganophosphorusnerveagents.chembiolinteract,2013.203(1):p.181-5.杨硕,熊.,熊维宁,许淑云,史雪梅,徐国鹏,兰芬,陆小霞,胡琼洁,大鼠对氧磷酶1真核表达载体的构建及在体外的表达.医学分子生物学杂志,2008.5(3):p.206-209.)；但是这两种表达系统蛋白产量低，生产成本高，因此，也并不适用于批量表达pon1蛋白。而野生型pon1在原核表达系统中的重组产物以无活性的包涵体形式存在，复性后也不能恢复正常的蛋白功能(bajaj,p.,etal.,expressionandpurificationofbiologicallyactiverecombinanthumanparaoxonase1frominclusionbodiesofescherichiacoli.proteinexprpurif,2015.115:p.95-101.)。大肠杆菌表达系统操作简单，周期短，遗传背景单一，成本低，表达产物容易纯化；但针对哺乳动物来源的血清对氧磷酶pon1，因大肠杆菌中缺乏蛋白质翻译后修饰系统，同时大肠杆菌和哺乳动物的密码子偏好性差异较大，因此，在大肠杆菌中表达可溶且有活性的repon1蛋白有一定的困难。技术实现要素：本发明的目的之一是将兔源对氧磷酶1进行位点突变得到突变体；本发明的目的之二是将所述兔源对氧磷酶1突变体的编码基因进行密码子优化得到适于在大肠杆菌表达的优化基因；本发明的目的之三将所述的兔源对氧磷酶1突变体在大肠杆菌中进行重组表达。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：本发明首先提供了兔源对氧磷酶1突变体，该突变体的编码基因选自seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8中的任何一种。作为本发明优选的一种实施方案，所述的兔源对氧磷酶1突变体的编码基因是seqidno.7或seqidno.8所示。本发明进一步提供了一种兔源对氧磷酶1突变体的重组表达方法，包括：将兔源对氧磷酶1突变体的编码基因可操作的与原核表达载体连接得到重组原核表达载体；将重组原核表达载体在大肠杆菌中诱导表达，收集并纯化所表达的重组蛋白。作为参考，所述的原核表达载体可以是pet28a、pet32a或pmal-c5x等带有标签的原核表达载体；其中，pet28a带有his-tag，pet32a载体带有trx-tag，pmal-c5x载体带有mbp-tag；从重组产物和酶活检测结果可以看出，his-repon1难以形成完整的重组蛋白，且多以包涵体形式存在，因此几乎不具有对氧磷酶活性，但仍具有一定的乙酸苯酯酶活性；乙酸苯酯是pon1已报道的最佳底物，表明乙酸苯酯酶活性对pon1蛋白结构正确折叠依赖度低。trx-repon1则可形成大量可溶的活性蛋白，对氧磷酶活性也明显提高；但仍有少量的不完整蛋白产物。而mbp-repon1上清液中目的蛋白的浓度显著高于另两个重组载体，相应地对氧磷酶和乙酸苯酯酶活性也更高。因此，本发明优选采用repon1-pmal-c5x作为pon1突变体在大肠杆菌中重组表达的最优选载体。本发明通过基因突变、密码子修饰和选择合宜的表达载体，最终得到了完整且活性高于其他表达系统来源的repon1。现有技术中，从血清中分离提取pon1的酶活为0.336u/ml，采用家蚕表达系统所表达的pon1的酶活为0.1036u/ml；本发明将pon1进行位点突变后进行密码子优化后采用pet32a为表达载体所表达的pon1的酶活达到了0.9u/ml，采用pmal-c5x为表达载体所表达的pon1的酶活提升到2.01u/ml。本发明整体技术方案详述本发明参考多条哺乳动物pon1基因编码序列，设计简并引物，从大耳白兔肝脏cdna文库中克隆rabpon1基因，通过同源克隆获得rabpon1基因编码区全长，为1080bp，与genbankaf220943序列相似度高达99.9％。计算后选取71位酪氨酸、115位组氨酸和192位精氨酸作为突变目标，分别替换为丙氨酸、色氨酸和赖氨酸。同时采用易错pcr技术对rabpon1基因进行随机突变，引进新的突变位点。测序后共获得8个突变的基因序列，结合大肠杆菌密码子识别系统进行序列优化。引进pet28a、pet32a和pmal-c5x三种标签表达载体，分别融合pon1c端构建了24个标签载体，标签依次为his-tag、trx-tag和mbp-tag。通过常规分子克隆和载体构建方法将8个repon1等位基因分别连接到上述三个表达载体中，分别与his-tag、trx-tag和mbp-tag三种标签融合，共构建24个表达载体。将构建的表达载体转化至大肠杆菌进行诱导表达，将所表达的重组蛋白分别测定了氧磷酶活性、乙酸苯酯酶活性、温度应答曲线、ph应答曲线、酶动力学催化常数以及降解率等酶学性能数据。突变酶重组表达检测结果显示，his-repon1系列标签蛋白分子量约为40kd，还有大量大小约29kd的蛋白产物，推测是提前终止的pon1翻译本，均以包涵体形式存在于沉淀中，几乎丧失对氧磷酶水解活性，有较弱的乙酸苯酯酶活性。trx-repon1标签蛋白大小约为51.6kd，其中trx-tag标签大小为11.6kd，在上清液和包涵体中均含有完整的标签融合蛋白，且8个突变酶的蛋白活性明显提升，都具有对氧磷酶和乙酸苯酯酶活性。mbp-repon1标签蛋白大小则为79.6kd，mbp标签几乎和pon1蛋白具有等同的分子量；上清液中重组蛋白丰度显著提高，相应地，对氧磷酶和乙酸苯酯酶活性也都明显改善。尤其是m7和m8基因型，在pet32a和pmal-c5x两个表达系统中酶活都上升明显，尤其是对氧磷酶活性，高于其他基因型3-5倍以上；因此，本发明重点测定m7和m8基因型重组蛋白的酶学活性和动力学方程。在最适温度和最佳ph条件下，测定m7-pet32a、m8-pet32a、m7-pmal-c5x和m8-pmal-c5x四个重组蛋白的最高酶活，结果表明重组蛋白的对氧磷酶活性可达0.7-2u/ml，乙酸苯酯酶活性可达3-5u/ml，并且repon1-pet32a重组蛋白的对氧磷酶和乙酸苯酯酶活性均低于repon1-pmal-c5x，达到差异显著水平。分别测定m7-pet32a、m8-pet32a、m7-pmal-c5x和m8-pmal-c5x这4个重组蛋白对温度的应答反应时发现，repon1对epo最适作用温度是30℃，在20℃-55℃范围内，repon1均具有40％以上的催化活性；而对pa的最适作用温度是25℃；低于20℃或者高于30℃时，乙酸苯酯酶酶活下降40-60％。温度响应测定表明repon1的对氧磷酶活性相对于乙酸苯酯酶活性，具有更广泛的温度适应性，乙酸苯酯酶水解活性更对温度变化更加敏感。ph应答检测结果表明repon1的对氧磷酶和乙酸苯酯酶的最适作用ph是9.0。ph低于6.0时，repon1几乎不具有对氧磷酶活性，表明repon1适宜于在中性偏碱的环境下发挥对epo的水解功能；在ph5.0-10.0之间，repon1对pa的水解效率均较高，ph应答曲线比较平稳，降解效率维持在50％以上。这一结果表明repon1的乙酸苯酯酶活性对于酸碱度的适应性高于对氧磷酶。动力学方程测定则表明这四个蛋白对epo和pa的催化效率达到中等偏上水平，平均催化效率约为～104m-1s-1，对pa的转化数和催化效率高于epo。同时，从催化常数的对比可以看出，mbp-repon1的催化效率约高于trxa-repon11.5-3.3倍，表明pmal-c5x表达载体的重组酶具有更好的酶学性能。降解率测定结果也显示repon1对单位浓度10倍于epo的pa具有更高的降解率。repon1-pet32a浓度为5.9×10-8时，反应10min时，对pa降解率即可达到84％以上；而repon1-pmal-c5x浓度仅为3.6×10-8时，同等条件下降解率即可达99％，与动力学参数测定结果一致。本发明通过克隆分离大耳白兔pon1基因，经基因工程改造后获得多个点突变基因，根据大肠杆菌密码子偏好性对各突变基因进行密码子优化，并构建携带不同标签的原核表达载体。经诱导表达后，筛选到trx-repon1和mbp-repon1蛋白均可在大肠杆菌表达系统中产生完整、具有活性的可溶性蛋白，对乙酸苯酯和乙基对氧磷均具有较强的水解能力，对乙基对氧磷的水解活性分别是兔源本底血清pon1和家蚕中重组表达pon1活性的5和19倍。本发明实现了兔源pon1在大肠杆菌中的高效重组表达，为pon1在有机磷降解和生物医药领域的应用提供了新的选择。本发明所涉及到的术语定义除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括pna(肽核酸)、在反义技术中所用的dna类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(batzer等人,nucleicacidres.19:5081(1991)；ohtsuka等人,j.biol.chem.260:2605-2608(1985)；和cassol等人,(1992)；rossolini等人,molcell.probes8:91-98(1994))。术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。术语“转化”指将编码基因导入到宿主细胞内部这样的方式将多核苷酸或多肽遗传转化到宿主细胞中。术语“表达”：内源性基因或转基因在宿主细胞中的转录和/或翻译。术语“编码基因”：转录成rna的核酸序列。附图说明图18个优化后的pon1基因序列比对。图2repon1原核重组表达载体图谱。图33种标签融合蛋白sds-page图谱。图4三种标签融合蛋白酶活比较。图5repon1对epo和pa的温度应答曲线。图6repon1对epo和pa的ph应答曲线。图7repon1对epo和pa的动力学方程测定。图8repon1对epo和pa的降解率测定。具体实施方式以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1突变基因克隆和蛋白质诱导表达、重组蛋白酶学性能测定1试验方法1.1基因克隆，突变和密码子优化参考多条哺乳动物pon1基因编码序列，设计简并引物，从大耳白兔肝脏cdna文库中克隆rabpon1基因，测序，获得完整基因序列。结合蛋白三维结构设计突变位点，用discoverystudio软件bulidmutant程序对候选的点突变位点进行结构模拟，并对比分析突变前和突变后位点的三级结构作用力；同时采用易错pcr技术引进随机突变，共获得m1-m88个pon1等位基因型，并对这8个基因进行密码子优化，使之适配于大肠杆菌表达系统。1.2重组表达载体设计和构建针对pet28a、pet32a和pmal-c5x各自的多克隆位点，设计添加了相应酶切位点的引物序列，并通过常规分子克隆和载体构建方法将8个repon1等位基因分别连接到上述三个表达载体中，分别与his-tag、trx-tag和mbp-tag三种标签融合，共构建24个表达载体，标签信息和酶切位点图谱如图2。1.3重组蛋白质诱导和电泳检测1.3.1将repon1-pet28a和repon1-pet32a载体转化至e.colibl21(de3)菌株，将repon1-pmal-c5x载体转化至e.colistb13菌株，获得单克隆转化子后，经两代纯化后培养菌种至od600约0.8左右时，向100mllb培养物中加入iptg(终浓度0.18mm)进行诱导，16℃，150rpm诱导24h后收集菌体。1.3.2加入10ml破碎缓冲液50mmpbs(ph7.5,0.5mnacl,1mmmgcl2,0.2mmpmsf)悬浮菌体，通过超声波破碎方法分离诱导产物，超3s，停9s，总超声时间依超声效果而调整；低温离心60min，提取蛋白。1.3.3分离上清液和沉淀，分别取样进行sds-page凝胶电泳检测，同时测定蛋白质浓度，如图3和表1所示。1.4重组蛋白酶活测定1.4.1对氧磷酶活性测定取100μl稀释后待测酶液，加入到含有5μl10mg/ml的epo和900μl50mmtris-hcl(2mmcacl2，ph8.5)的体系中，37℃孵育10min，加入1ml10％ccl3cooh终止反应，再加入1ml10％na2co3显色，410nm测定吸光值，计算水解产物对硝基酚的含量和酶的活性；酶活单位定义和计算公式如下：注:od410：410nm处吸光值；3×10-3：反应体积(l)；n：酶液稀释倍数；10①：将100μl稀释酶液中的酶活性折算为1ml的酶活性；t：反应时间min。1.4.2乙酸苯酯酶活性测定取100μl发酵液上清(稀释20倍)+2.7ml50mmtris-hcl(2mmcacl2ph8.5)+5μl40.84mg/mlpa(乙酸苯酯)，室温反应一定时间后，加入200μl0.2medta(ph8.0)终止反应，测定od270读值，计算水解产物苯酚的含量，并计算对应酶的活性；注:od270：270nm处吸光值；3×10-3：反应体积(l)；n：酶液稀释倍数；10①：将100μl稀释酶液中的酶活性折算为1ml的酶活性；t：反应时间min。1.4.3温度应答曲线测定1.4.3.1以epo为底物测定突变酶在20℃-55℃区间的温度曲线，每间隔5℃测定一次，确定最适作用温度。1.4.3.2以pa为底物测定突变酶在20℃-35℃区间的温度曲线，每间隔5℃测定一次，确定最适作用温度。1.4.4ph应答曲线测定1.4.4.1以epo为底物测定突变酶在ph6.0-10.0区间的温度曲线，每间隔1个ph测定一次，确定最适作用ph值。1.4.4.2以pa为底物测定突变酶在ph5.0-10.0区间的温度曲线，每间隔1个ph测定一次，确定最适作用ph值。1.4.5酶动力学催化常数测定测定底物为epo和pa，缓冲液为50mmtris-hcl(2mmcacl2ph8.5)，分别在30℃和25℃测定。1.4.6降解率测定测定底物为epo和pa，缓冲液为50mmtris-hcl(2mmcacl2ph8.5)，分别在30℃和25℃测定。2.实验结果2.1基因克隆和表达载体构建2.1.1等位基因克隆和密码子优化通过同源克隆获得rabpon1基因编码区全长，为1080bp，与genbankaf220943序列相似度高达99.9％。计算后选取71位酪氨酸、115位组氨酸和192位精氨酸作为突变目标，分别替换为丙氨酸、色氨酸和赖氨酸。同时采用易错pcr技术对rabpon1基因进行随机突变，引进新的突变位点。测序后共获得8个突变的基因序列，结合大肠杆菌密码子识别系统进行序列优化，优化后序列比对如图1。2.1.2重组表达载体构建引进pet28a、pet32a和pmal-c5x三种标签表达载体，分别融合pon1c端构建了24个标签载体，标签依次为his-tag、trx-tag和mbp-tag(图2)。2.2.repon1表达检测2.2.1重组蛋白电泳图谱和酶活测定采用e.colide3和e.colistb13作为宿主，以iptg作为诱导剂，表达24个重组蛋白。超声破碎后分离上清液和沉淀，并进行sds-page分析检测重组蛋白产物(图3)，同时以epo和pa为底物，测定重组蛋白酶活和动力学性能。突变酶重组表达检测结果显示，his-repon1系列标签蛋白分子量约为40kd，还有大量大小约29kd的蛋白产物，推测是提前终止的pon1翻译本，均以包涵体形式存在于沉淀中，几乎丧失对氧磷酶水解活性，有较弱的乙酸苯酯酶活性。trx-repon1标签蛋白大小约为51.6kd，其中trx-tag标签大小为11.6kd，在上清液和包涵体中均含有完整的标签融合蛋白，且8个突变酶的蛋白活性明显提升，都具有对氧磷酶和乙酸苯酯酶活性。mbp-repon1标签蛋白大小则为79.6kd，mbp标签几乎和pon1蛋白具有等同的分子量；上清液中标签融合蛋白丰度显著提高，相应地，对氧磷酶和乙酸苯酯酶活性也都明显改善(图4)。尤其是m7和m8基因型，在pet32a和pmal-c5x两个表达系统中酶活都上升明显，尤其是对氧磷酶活性，高于其他基因型3-5倍以上；因此，本发明重点测定m7和m8基因型重组蛋白的酶学活性和动力学方程。在最适温度和最佳ph条件下，测定m7-pet32a、m8-pet32a、m7-pmal-c5x和m8-pmal-c5x四个重组蛋白的最高酶活(表1)，结果表明重组蛋白的对氧磷酶活性可达0.7-2u/ml，乙酸苯酯酶活性可达3-5u/ml，并且repon1-pet32a重组蛋白的对氧磷酶和乙酸苯酯酶活性均低于repon1-pmal-c5x，达到差异显著水平。表1repon1最高酶活测定2.2.2温度应答曲线测定分别测定m7-pet32a、m8-pet32a、m7-pmal-c5x和m8-pmal-c5x这4个重组蛋白对温度的应答反应时，发现repon1对epo最适作用温度是30℃，在20℃-55℃范围内，repon1均具有40％以上的催化活性；而对pa的最适作用温度是25℃；低于20℃或者高于30℃时，乙酸苯酯酶酶活下降40-60％(图5)。温度响应测定表明repon1的对氧磷酶活性相对于乙酸苯酯酶活性，具有更广泛的温度适应性，乙酸苯酯酶水解活性更对温度变化更加敏感。2.2.3ph应答曲线测定ph应答检测结果表明repon1的对氧磷酶和乙酸苯酯酶的最适作用ph是9.0。ph低于6.0时，repon1几乎不具有对氧磷酶活性，表明repon1适宜于在中性偏碱的环境下发挥对epo的水解功能；在ph5.0-10.0之间，repon1对pa的水解效率均较高，ph应答曲线比较平稳，降解效率维持在50％以上(图6)。这一结果表明repon1的乙酸苯酯酶活性对于酸碱度的适应性高于对氧磷酶。2.2.4动力学方程测定动力学方程测定则表明这四个蛋白对epo和pa的催化效率达到中等偏上水平，平均催化效率约为～104m-1s-1，对pa的转化数和催化效率高于epo(表2和图7)。同时，从催化常数的对比可以看出，mbp-repon1的催化效率约高于trxa-repon11.5-3.3倍，表明pmal-c5x表达载体的重组酶具有更好的酶学性能。表2.repon1对epo和pa的催化常数2.2.5降解率测定降解率测定结果也显示repon1对单位浓度10倍于epo的pa具有更高的降解率(图8)，表3显示在一定的酶液浓度条件下，epo底物浓度为6-109μmol/l之间、pa浓度在50-800μmol/l之间时，底物降解率的变化趋势。repon1-pet32a浓度为5.9×10-8时，反应10min时，对pa降解率即可达到84％以上；而repon1-pmal-c5x浓度仅为3.6×10-8时，同等条件下降解率即可达99％，与动力学参数测定结果一致。表3.底物降解率测定sequencelisting<110>北京森根比亚生物工程技术有限公司<120>兔源对氧磷酶1突变体及其重组表达方法<130>bj-3010-200814a<160>8<170>patentinversion3.5<210>1<211>1068<212>dna<213>artificalsequence<400>1atggccaagctgattgcactgactttactgggtatgggtctggctttatttcgcaatcac60cagagtagctatcagacccgtttaaatgccttacgtgaagtgcagccggtggagctgccg120aactgcaatctggtgaagggcattgagaccggcagtgaagatttagagattttaccgaat180ggtttagcctttattagcagtggtttaaaggcccccggtatcaagagctttaatccgaac240agcccgggcaagattttattaatggatttaaacgaggaagatccgaccgtgctggaactg300ggcattaccggcagcaaattcgacgtgagtagcttcaacccgcatggtattagcaccttt360accgacgaggacaacgccatgtatttactggtggtgaatcacccggatgccaagagcacc420gtggagctgttcaagttccaagaagaggagaagtctttactgcatctgaagaccattcgc480cataagctgctgccgaatctgaacgatatcgtggcagttggtccggagcacttctacggc540accaacgaccattactttttagatccgtatttacgtagctgggaaatgtatttaggtctg600gcatggagctacgtggtttactacagcccgagcgaagtgcgcgtggttgccgaaggcttt660gattttgccaacggtatcaacatcagcccggacggcaagtatgtgtatatcgccgaactg720ctggcccacaaaatccacgtgtacgaaaagcacgccaattggactttaaccccgctgaaa780agtctggattttaacactttagttgacaacattagcgttgacccggaaaccggtgattta840tgggtgggctgtcacccgaatggtatgaagatcttcttttatgatagcgagaacccgccg900gccagcgaagtgctgcgcattcagaacattctgaccgaagagccgaaagtgacccaagtt960tatgccgaaaatggcacagttctgcaaggtagcaccgtggccagtgtgtataaaggcaag1020ctgctgatcggcaccgtgtttcacaaagcactgtactgtgaactgtaa1068<210>2<211>1068<212>dna<213>artificalsequence<400>2atggccaaactgatcgcactgacactgctgggcatgggtttagctttatttcgcaatcac60cagagcagctaccagacccgtttaaacgctttacgtgaagttcagccggttgagctgccg120aattgcaacttagtgaaaggcatcgagaccggcagtgaggatctggagattctgccgaac180ggtttagcctttatcagtagcggtttaaaatacccgggcatcaagagcttcaacccgaat240agcccgggtaaaattttactgatggatttaaacgaagaagatccgaccgttctggaactg300ggtatcaccggcagcaagttcgacgtgagcagctttaatccttggggcatcagcaccttc360accgacgaagacaacgccatgtatttactggttgtgaaccatccggatgccaaaagcacc420gttgagctgtttaaatttcaagaagaagaaaaatctttactgcatttaaaaaccattcgc480cataagctgctgccgaacttaaacgacatcgtggcagtgggcccggaacacttttacggc540accaacgaccactactttttagatccgtatctgcgcagctgggagatgtatctgggtctg600gcttggagctatgtggtgtactacagcccgagcgaagttcgcgttgtggccgagggtttc660gatttcgccaacggcatcaacattagcccggacggtaagtacgtgtacattgccgagctg720ctggcccataaaattcacgtgtacgaaaaacatgccaactggactttaaccccgttaaag780tctttagactttaacaccttagtggacaacatcagcgtggatccggagactggtgatctg840tgggtgggctgccacccgaatggtatgaaaatcttcttctacgatagcgaaaatccgccg900gccagcgaggttttacgtattcagaacattctgaccgaagaaccgaaagtgacccaagtt960tacgcagaaaatggcaccgtgttacaaggtagtaccgtggcaagcgtttacaagggcaaa1020ctgctgatcggcaccgtgtttcataaggctttatactgcgaactgtaa1068<210>3<211>1068<212>dna<213>artificalsequence<400>3atggccaagctgattgctttaactttactgggcatgggtctggcactgtttcgcaaccat60cagagcagctatcagacccgtctgaacgctttacgcgaagttcagcccgttgaactgccg120aactgcaatctggtgaagggcattgagaccggtagcgaagatttagagattttaccgaac180ggtctggcctttatcagtagcggtttaaagtatccgggtattaagagctttaatccgaat240agcccgggcaagattctgctgatggatctgaatgaagaggatccgaccgtgctggagctg300ggcatcaccggcagtaaattcgacgtgagcagcttcaacccgcatggcattagcaccttt360accgatgaggacaacgccatgtatttactggtggtgaatcatccggatgccaaaagcacc420gtggaactgttcaagttccaagaagaagagaagagtctgctgcatttaaaaaccattcgc480cacaaactgctgccgaatttaaatgacatcgttgccgttggccccgaacatttttacggt540accaacgaccactattttttagacccgtatttaaagagttgggaaatgtatttaggttta600gcatggagctatgtggtgtactacagcccgagcgaggttcgcgttgttgccgaaggcttt660gacttcgccaatggcattaatatcagcccggacggcaagtacgtgtatatcgccgagctg720ctggcccataagatccacgtgtacgagaaacacgccaactggactttaaccccgctgaag780agtctggatttcaacactttagtggacaacatcagcgtggacccggaaaccggcgattta840tgggttggctgccatccgaacggcatgaaaattttcttttatgatagcgaaaatccgccg900gcaagcgaggtgctgcgcatccagaatattttaaccgaggaaccgaaggtgacccaagtt960tacgccgaaaacggtacagttttacaaggtagcacagtggccagtgtgtataagggcaaa1020ctgctgattggcaccgtgttccacaaggcactgtattgtgagctgtaa1068<210>4<211>1068<212>dna<213>artificalsequence<400>4atggccaagctgattgcactgactttactgggtatgggtctggctttatttcgcaatcac60cagagtagctatcagacccgtttaaatgccttacgtgaagtgcagccggtggagctgccg120aactgcaatctggtgaagggcattgagaccggcagtgaagatttagagattttaccgaat180ggtttagcctttattagcagtggtttaaaggcccccggtatcaagagctttaatccgaac240agcccgggcaagattttattaatggatttaaacgaggaagatccgaccgtgctggaactg300ggcattaccggcagcaaattcgacgtgagtagcttcaacccgtggggtattagcaccttt360accgacgaggacaacgccatgtatttactggtggtgaatcacccggatgccaagagcacc420gtggagctgttcaagttccaagaagaggagaagtctttactgcatctgaagaccattcgc480cataagctgctgccgaatctgaacgatatcgtggcagttggtccggagcacttctacggc540accaacgaccattactttttagatccgtatttacgtagctgggaaatgtatttaggtctg600gcatggagctacgtggtttactacagcccgagcgaagtgcgcgtggttgccgaaggcttt660gattttgccaacggtatcaacatcagcccggacggcaagtatgtgtatatcgccgaactg720ctggcccacaaaatccacgtgtacgaaaagcacgccaattggactttaaccccgctgaaa780agtctggattttaacactttagttgacaacattagcgttgacccggaaaccggtgattta840tgggtgggctgtcacccgaatggtatgaagatcttcttttatgatagcgagaacccgccg900gccagcgaagtgctgcgcattcagaacattctgaccgaagagccgaaagtgacccaagtt960tatgccgaaaatggcacagttctgcaaggtagcaccgtggccagtgtgtataaaggcaag1020ctgctgatcggcaccgtgtttcacaaagcactgtactgtgaactgtaa1068<210>5<211>1068<212>dna<213>artificalsequence<400>5atggccaagctgattgctttaactttactgggcatgggtctggcactgtttcgcaaccat60cagagcagctatcagacccgtctgaacgctttacgcgaagttcagcccgttgaactgccg120aactgcaatctggtgaagggcattgagaccggtagcgaagatttagagattttaccgaac180ggtctggcctttatcagtagcggtttaaagtatccgggtattaagagctttaatccgaat240agcccgggcaagattctgctgatggatctgaatgaagaggatccgaccgtgctggagctg300ggcatcaccggcagtaaattcgacgtgagcagcttcaacccgtggggcattagcaccttt360accgatgaggacaacgccatgtatttactggtggtgaatcatccggatgccaaaagcacc420gtggaactgttcaagttccaagaagaagagaagagtctgctgcatttaaaaaccattcgc480cacaaactgctgccgaatttaaatgacatcgttgccgttggccccgaacatttttacggt540accaacgaccactattttttagacccgtatttaaagagttgggaaatgtatttaggttta600gcatggagctatgtggtgtactacagcccgagcgaggttcgcgttgt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：：pon1(paraoxonase1)对氧磷酶1，酶学分类ec3.1.8.1，属于内酯酶家族。自上个世纪50年代以来，不断分离到了源自于哺乳动物血清的对氧磷酶pon1，从兔子、老鼠、牛和人等动物体内均已克隆到pon1以及同源基因(mackness,m.andb.mackness,humanparaoxonase-1(pon1):genestructureandexpression,promiscuousactivitiesandmultiplephysiologicalroles.gene,2015.567(1):p.12-21.)。对氧磷酶是哺乳动物尤其是人类防护和解毒的一道天然屏障，对于保护机体免受有机磷损害具有十分重要的作用，可高效降解内酯、芳香酯和有机磷酸酯；作用的酯键有p-o、p-f、p-cn以及p-s，对有机磷神经毒剂沙林、梭曼、塔崩和vx均具有降解作用，也可降解一些有机磷农药，如对氧磷、毒死碑氧磷、敌匹硫磷等，在有机磷中毒防治中具有重要的作用。同时，研究发现pon1在体内通过降解同型半胱氨酸硫内酯、芳香酯和抑制脂蛋白氧化而发挥pon1对心血管系统和肝脏的保护作用，具有抗氧化、抗炎，调节脂质代谢的功能，参与预防和抑制ⅱ型糖尿病、动脉粥样硬化、冠心病、肿瘤等多种疾病的发生。天然pon1的产量低，从血清中分离提取的方法获得大量pon1制剂并不现实，近年来通过将pon1整合到昆虫表达系统和哺乳动物细胞表达系统中，解决了pon1体外重组表达的难题，并且可以提供高纯度的活性蛋白(gaidukov,l.,etal.,invivoadministrationofbl-3050:highlystableengineeredpon1-hdlcomplexes.bmcclinpharmacol,2009.9:p.18.kirby,s.d.,etal.,humanparaoxonasedoublemutantshydrolyzevandgclassorganophosphorusnerveagents.chembiolinteract,2013.203(1):p.181-5.杨硕,熊.,熊维宁,许淑云,史雪梅,徐国鹏,兰芬,陆小霞,胡琼洁,大鼠对氧磷酶1真核表达载体的构建及在体外的表达.医学分子生物学杂志,2008.5(3):p.206-209.)；但是这两种表达系统蛋白产量低，生产成本高，因此，也并不适用于批量表达pon1蛋白。而野生型pon1在原核表达系统中的重组产物以无活性的包涵体形式存在，复性后也不能恢复正常的蛋白功能(bajaj,p.,etal.,expressionandpurificationofbiologicallyactiverecombinanthumanparaoxonase1frominclusionbodiesofescherichiacoli.proteinexprpurif,2015.115:p.95-101.)。大肠杆菌表达系统操作简单，周期短，遗传背景单一，成本低，表达产物容易纯化；但针对哺乳动物来源的血清对氧磷酶pon1，因大肠杆菌中缺乏蛋白质翻译后修饰系统，同时大肠杆菌和哺乳动物的密码子偏好性差异较大，因此，在大肠杆菌中表达可溶且有活性的repon1蛋白有一定的困难。技术实现要素：本发明的目的之一是将兔源对氧磷酶1进行位点突变得到突变体；本发明的目的之二是将所述兔源对氧磷酶1突变体的编码基因进行密码子优化得到适于在大肠杆菌表达的优化基因；本发明的目的之三将所述的兔源对氧磷酶1突变体在大肠杆菌中进行重组表达。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：本发明首先提供了兔源对氧磷酶1突变体，该突变体的编码基因选自seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8中的任何一种。作为本发明优选的一种实施方案，所述的兔源对氧磷酶1突变体的编码基因是seqidno.7或seqidno.8所示。本发明进一步提供了一种兔源对氧磷酶1突变体的重组表达方法，包括：将兔源对氧磷酶1突变体的编码基因可操作的与原核表达载体连接得到重组原核表达载体；将重组原核表达载体在大肠杆菌中诱导表达，收集并纯化所表达的重组蛋白。作为参考，所述的原核表达载体可以是pet28a、pet32a或pmal-c5x等带有标签的原核表达载体；其中，pet28a带有his-tag，pet32a载体带有trx-tag，pmal-c5x载体带有mbp-tag；从重组产物和酶活检测结果可以看出，his-repon1难以形成完整的重组蛋白，且多以包涵体形式存在，因此几乎不具有对氧磷酶活性，但仍具有一定的乙酸苯酯酶活性；乙酸苯酯是pon1已报道的最佳底物，表明乙酸苯酯酶活性对pon1蛋白结构正确折叠依赖度低。trx-repon1则可形成大量可溶的活性蛋白，对氧磷酶活性也明显提高；但仍有少量的不完整蛋白产物。而mbp-repon1上清液中目的蛋白的浓度显著高于另两个重组载体，相应地对氧磷酶和乙酸苯酯酶活性也更高。因此，本发明优选采用repon1-pmal-c5x作为pon1突变体在大肠杆菌中重组表达的最优选载体。本发明通过基因突变、密码子修饰和选择合宜的表达载体，最终得到了完整且活性高于其他表达系统来源的repon1。现有技术中，从血清中分离提取pon1的酶活为0.336u/ml，采用家蚕表达系统所表达的pon1的酶活为0.1036u/ml；本发明将pon1进行位点突变后进行密码子优化后采用pet32a为表达载体所表达的pon1的酶活达到了0.9u/ml，采用pmal-c5x为表达载体所表达的pon1的酶活提升到2.01u/ml。本发明整体技术方案详述本发明参考多条哺乳动物pon1基因编码序列，设计简并引物，从大耳白兔肝脏cdna文库中克隆rabpon1基因，通过同源克隆获得rabpon1基因编码区全长，为1080bp，与genbankaf220943序列相似度高达99.9％。计算后选取71位酪氨酸、115位组氨酸和192位精氨酸作为突变目标，分别替换为丙氨酸、色氨酸和赖氨酸。同时采用易错pcr技术对rabpon1基因进行随机突变，引进新的突变位点。测序后共获得8个突变的基因序列，结合大肠杆菌密码子识别系统进行序列优化。引进pet28a、pet32a和pmal-c5x三种标签表达载体，分别融合pon1c端构建了24个标签载体，标签依次为his-tag、trx-tag和mbp-tag。通过常规分子克隆和载体构建方法将8个repon1等位基因分别连接到上述三个表达载体中，分别与his-tag、trx-tag和mbp-tag三种标签融合，共构建24个表达载体。将构建的表达载体转化至大肠杆菌进行诱导表达，将所表达的重组蛋白分别测定了氧磷酶活性、乙酸苯酯酶活性、温度应答曲线、ph应答曲线、酶动力学催化常数以及降解率等酶学性能数据。突变酶重组表达检测结果显示，his-repon1系列标签蛋白分子量约为40kd，还有大量大小约29kd的蛋白产物，推测是提前终止的pon1翻译本，均以包涵体形式存在于沉淀中，几乎丧失对氧磷酶水解活性，有较弱的乙酸苯酯酶活性。trx-repon1标签蛋白大小约为51.6kd，其中trx-tag标签大小为11.6kd，在上清液和包涵体中均含有完整的标签融合蛋白，且8个突变酶的蛋白活性明显提升，都具有对氧磷酶和乙酸苯酯酶活性。mbp-repon1标签蛋白大小则为79.6kd，mbp标签几乎和pon1蛋白具有等同的分子量；上清液中重组蛋白丰度显著提高，相应地，对氧磷酶和乙酸苯酯酶活性也都明显改善。尤其是m7和m8基因型，在pet32a和pmal-c5x两个表达系统中酶活都上升明显，尤其是对氧磷酶活性，高于其他基因型3-5倍以上；因此，本发明重点测定m7和m8基因型重组蛋白的酶学活性和动力学方程。在最适温度和最佳ph条件下，测定m7-pet32a、m8-pet32a、m7-pmal-c5x和m8-pmal-c5x四个重组蛋白的最高酶活，结果表明重组蛋白的对氧磷酶活性可达0.7-2u/ml，乙酸苯酯酶活性可达3-5u/ml，并且repon1-pet32a重组蛋白的对氧磷酶和乙酸苯酯酶活性均低于repon1-pmal-c5x，达到差异显著水平。分别测定m7-pet32a、m8-pet32a、m7-pmal-c5x和m8-pmal-c5x这4个重组蛋白对温度的应答反应时发现，repon1对epo最适作用温度是30℃，在20℃-55℃范围内，repon1均具有40％以上的催化活性；而对pa的最适作用温度是25℃；低于20℃或者高于30℃时，乙酸苯酯酶酶活下降40-60％。温度响应测定表明repon1的对氧磷酶活性相对于乙酸苯酯酶活性，具有更广泛的温度适应性，乙酸苯酯酶水解活性更对温度变化更加敏感。ph应答检测结果表明repon1的对氧磷酶和乙酸苯酯酶的最适作用ph是9.0。ph低于6.0时，repon1几乎不具有对氧磷酶活性，表明repon1适宜于在中性偏碱的环境下发挥对epo的水解功能；在ph5.0-10.0之间，repon1对pa的水解效率均较高，ph应答曲线比较平稳，降解效率维持在50％以上。这一结果表明repon1的乙酸苯酯酶活性对于酸碱度的适应性高于对氧磷酶。动力学方程测定则表明这四个蛋白对epo和pa的催化效率达到中等偏上水平，平均催化效率约为～104m-1s-1，对pa的转化数和催化效率高于epo。同时，从催化常数的对比可以看出，mbp-repon1的催化效率约高于trxa-repon11.5-3.3倍，表明pmal-c5x表达载体的重组酶具有更好的酶学性能。降解率测定结果也显示repon1对单位浓度10倍于epo的pa具有更高的降解率。repon1-pet32a浓度为5.9×10-8时，反应10min时，对pa降解率即可达到84％以上；而repon1-pmal-c5x浓度仅为3.6×10-8时，同等条件下降解率即可达99％，与动力学参数测定结果一致。本发明通过克隆分离大耳白兔pon1基因，经基因工程改造后获得多个点突变基因，根据大肠杆菌密码子偏好性对各突变基因进行密码子优化，并构建携带不同标签的原核表达载体。经诱导表达后，筛选到trx-repon1和mbp-repon1蛋白均可在大肠杆菌表达系统中产生完整、具有活性的可溶性蛋白，对乙酸苯酯和乙基对氧磷均具有较强的水解能力，对乙基对氧磷的水解活性分别是兔源本底血清pon1和家蚕中重组表达pon1活性的5和19倍。本发明实现了兔源pon1在大肠杆菌中的高效重组表达，为pon1在有机磷降解和生物医药领域的应用提供了新的选择。本发明所涉及到的术语定义除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括pna(肽核酸)、在反义技术中所用的dna类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(batzer等人,nucleicacidres.19:5081(1991)；ohtsuka等人,j.biol.chem.260:2605-2608(1985)；和cassol等人,(1992)；rossolini等人,molcell.probes8:91-98(1994))。术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。术语“重组宿主细胞株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。术语“转化”指将编码基因导入到宿主细胞内部这样的方式将多核苷酸或多肽遗传转化到宿主细胞中。术语“表达”：内源性基因或转基因在宿主细胞中的转录和/或翻译。术语“编码基因”：转录成rna的核酸序列。附图说明图18个优化后的pon1基因序列比对。图2repon1原核重组表达载体图谱。图33种标签融合蛋白sds-page图谱。图4三种标签融合蛋白酶活比较。图5repon1对epo和pa的温度应答曲线。图6repon1对epo和pa的ph应答曲线。图7repon1对epo和pa的动力学方程测定。图8repon1对epo和pa的降解率测定。具体实施方式以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1突变基因克隆和蛋白质诱导表达、重组蛋白酶学性能测定1试验方法1.1基因克隆，突变和密码子优化参考多条哺乳动物pon1基因编码序列，设计简并引物，从大耳白兔肝脏cdna文库中克隆rabpon1基因，测序，获得完整基因序列。结合蛋白三维结构设计突变位点，用discoverystudio软件bulidmutant程序对候选的点突变位点进行结构模拟，并对比分析突变前和突变后位点的三级结构作用力；同时采用易错pcr技术引进随机突变，共获得m1-m88个pon1等位基因型，并对这8个基因进行密码子优化，使之适配于大肠杆菌表达系统。1.2重组表达载体设计和构建针对pet28a、pet32a和pmal-c5x各自的多克隆位点，设计添加了相应酶切位点的引物序列，并通过常规分子克隆和载体构建方法将8个repon1等位基因分别连接到上述三个表达载体中，分别与his-tag、trx-tag和mbp-tag三种标签融合，共构建24个表达载体，标签信息和酶切位点图谱如图2。1.3重组蛋白质诱导和电泳检测1.3.1将repon1-pet28a和repon1-pet32a载体转化至e.colibl21(de3)菌株，将repon1-pmal-c5x载体转化至e.colistb13菌株，获得单克隆转化子后，经两代纯化后培养菌种至od600约0.8左右时，向100mllb培养物中加入iptg(终浓度0.18mm)进行诱导，16℃，150rpm诱导24h后收集菌体。1.3.2加入10ml破碎缓冲液50mmpbs(ph7.5,0.5mnacl,1mmmgcl2,0.2mmpmsf)悬浮菌体，通过超声波破碎方法分离诱导产物，超3s，停9s，总超声时间依超声效果而调整；低温离心60min，提取蛋白。1.3.3分离上清液和沉淀，分别取样进行sds-page凝胶电泳检测，同时测定蛋白质浓度，如图3和表1所示。1.4重组蛋白酶活测定1.4.1对氧磷酶活性测定取100μl稀释后待测酶液，加入到含有5μl10mg/ml的epo和900μl50mmtris-hcl(2mmcacl2，ph8.5)的体系中，37℃孵育10min，加入1ml10％ccl3cooh终止反应，再加入1ml10％na2co3显色，410nm测定吸光值，计算水解产物对硝基酚的含量和酶的活性；酶活单位定义和计算公式如下：注:od410：410nm处吸光值；3×10-3：反应体积(l)；n：酶液稀释倍数；10①：将100μl稀释酶液中的酶活性折算为1ml的酶活性；t：反应时间min。1.4.2乙酸苯酯酶活性测定取100μl发酵液上清(稀释20倍)+2.7ml50mmtris-hcl(2mmcacl2ph8.5)+5μl40.84mg/mlpa(乙酸苯酯)，室温反应一定时间后，加入200μl0.2medta(ph8.0)终止反应，测定od270读值，计算水解产物苯酚的含量，并计算对应酶的活性；注:od270：270nm处吸光值；3×10-3：反应体积(l)；n：酶液稀释倍数；10①：将100μl稀释酶液中的酶活性折算为1ml的酶活性；t：反应时间min。1.4.3温度应答曲线测定1.4.3.1以epo为底物测定突变酶在20℃-55℃区间的温度曲线，每间隔5℃测定一次，确定最适作用温度。1.4.3.2以pa为底物测定突变酶在20℃-35℃区间的温度曲线，每间隔5℃测定一次，确定最适作用温度。1.4.4ph应答曲线测定1.4.4.1以epo为底物测定突变酶在ph6.0-10.0区间的温度曲线，每间隔1个ph测定一次，确定最适作用ph值。1.4.4.2以pa为底物测定突变酶在ph5.0-10.0区间的温度曲线，每间隔1个ph测定一次，确定最适作用ph值。1.4.5酶动力学催化常数测定测定底物为epo和pa，缓冲液为50mmtris-hcl(2mmcacl2ph8.5)，分别在30℃和25℃测定。1.4.6降解率测定测定底物为epo和pa，缓冲液为50mmtris-hcl(2mmcacl2ph8.5)，分别在30℃和25℃测定。2.实验结果2.1基因克隆和表达载体构建2.1.1等位基因克隆和密码子优化通过同源克隆获得rabpon1基因编码区全长，为1080bp，与genbankaf220943序列相似度高达99.9％。计算后选取71位酪氨酸、115位组氨酸和192位精氨酸作为突变目标，分别替换为丙氨酸、色氨酸和赖氨酸。同时采用易错pcr技术对rabpon1基因进行随机突变，引进新的突变位点。测序后共获得8个突变的基因序列，结合大肠杆菌密码子识别系统进行序列优化，优化后序列比对如图1。2.1.2重组表达载体构建引进pet28a、pet32a和pmal-c5x三种标签表达载体，分别融合pon1c端构建了24个标签载体，标签依次为his-tag、trx-tag和mbp-tag(图2)。2.2.repon1表达检测2.2.1重组蛋白电泳图谱和酶活测定采用e.colide3和e.colistb13作为宿主，以iptg作为诱导剂，表达24个重组蛋白。超声破碎后分离上清液和沉淀，并进行sds-page分析检测重组蛋白产物(图3)，同时以epo和pa为底物，测定重组蛋白酶活和动力学性能。突变酶重组表达检测结果显示，his-repon1系列标签蛋白分子量约为40kd，还有大量大小约29kd的蛋白产物，推测是提前终止的pon1翻译本，均以包涵体形式存在于沉淀中，几乎丧失对氧磷酶水解活性，有较弱的乙酸苯酯酶活性。trx-repon1标签蛋白大小约为51.6kd，其中trx-tag标签大小为11.6kd，在上清液和包涵体中均含有完整的标签融合蛋白，且8个突变酶的蛋白活性明显提升，都具有对氧磷酶和乙酸苯酯酶活性。mbp-repon1标签蛋白大小则为79.6kd，mbp标签几乎和pon1蛋白具有等同的分子量；上清液中标签融合蛋白丰度显著提高，相应地，对氧磷酶和乙酸苯酯酶活性也都明显改善(图4)。尤其是m7和m8基因型，在pet32a和pmal-c5x两个表达系统中酶活都上升明显，尤其是对氧磷酶活性，高于其他基因型3-5倍以上；因此，本发明重点测定m7和m8基因型重组蛋白的酶学活性和动力学方程。在最适温度和最佳ph条件下，测定m7-pet32a、m8-pet32a、m7-pmal-c5x和m8-pmal-c5x四个重组蛋白的最高酶活(表1)，结果表明重组蛋白的对氧磷酶活性可达0.7-2u/ml，乙酸苯酯酶活性可达3-5u/ml，并且repon1-pet32a重组蛋白的对氧磷酶和乙酸苯酯酶活性均低于repon1-pmal-c5x，达到差异显著水平。表1repon1最高酶活测定2.2.2温度应答曲线测定分别测定m7-pet32a、m8-pet32a、m7-pmal-c5x和m8-pmal-c5x这4个重组蛋白对温度的应答反应时，发现repon1对epo最适作用温度是30℃，在20℃-55℃范围内，repon1均具有40％以上的催化活性；而对pa的最适作用温度是25℃；低于20℃或者高于30℃时，乙酸苯酯酶酶活下降40-60％(图5)。温度响应测定表明repon1的对氧磷酶活性相对于乙酸苯酯酶活性，具有更广泛的温度适应性，乙酸苯酯酶水解活性更对温度变化更加敏感。2.2.3ph应答曲线测定ph应答检测结果表明repon1的对氧磷酶和乙酸苯酯酶的最适作用ph是9.0。ph低于6.0时，repon1几乎不具有对氧磷酶活性，表明repon1适宜于在中性偏碱的环境下发挥对epo的水解功能；在ph5.0-10.0之间，repon1对pa的水解效率均较高，ph应答曲线比较平稳，降解效率维持在50％以上(图6)。这一结果表明repon1的乙酸苯酯酶活性对于酸碱度的适应性高于对氧磷酶。2.2.4动力学方程测定动力学方程测定则表明这四个蛋白对epo和pa的催化效率达到中等偏上水平，平均催化效率约为～104m-1s-1，对pa的转化数和催化效率高于epo(表2和图7)。同时，从催化常数的对比可以看出，mbp-repon1的催化效率约高于trxa-repon11.5-3.3倍，表明pmal-c5x表达载体的重组酶具有更好的酶学性能。表2.repon1对epo和pa的催化常数2.2.5降解率测定降解率测定结果也显示repon1对单位浓度10倍于epo的pa具有更高的降解率(图8)，表3显示在一定的酶液浓度条件下，epo底物浓度为6-109μmol/l之间、pa浓度在50-800μmol/l之间时，底物降解率的变化趋势。repon1-pet32a浓度为5.9×10-8时，反应10min时，对pa降解率即可达到84％以上；而repon1-pmal-c5x浓度仅为3.6×10-8时，同等条件下降解率即可达99％，与动力学参数测定结果一致。表3.底物降解率测定sequencelisting<110>北京森根比亚生物工程技术有限公司<120>兔源对氧磷酶1突变体及其重组表达方法<130>bj-3010-200814a<160>8<170>patentinversion3.5<210>1<211>1068<212>dna<213>artificalsequence<400>1atggccaagctgattgcactgactttactgggtatgggtctggctttatttcgcaatcac60cagagtagctatcagacccgtttaaatgccttacgtgaagtgcagccggtggagctgccg120aactgcaatctggtgaagggcattgagaccggcagtgaagatttagagattttaccgaat180ggtttagcctttattagcagtggtttaaaggcccccggtatcaagagctttaatccgaac240agcccgggcaagattttattaatggatttaaacgaggaagatccgaccgtgctggaactg300ggcattaccggcagcaaattcgacgtgagtagcttcaacccgcatggtattagcaccttt360accgacgaggacaacgccatgtatttactggtggtgaatcacccggatgccaagagcacc420gtggagctgttcaagttccaagaagaggagaagtctttactgcatctgaagaccattcgc480cataagctgctgccgaatctgaacgatatcgtggcagttggtccggagcacttctacggc540accaacgaccattactttttagatccgtatttacgtagctgggaaatgtatttaggtctg600gcatggagctacgtggtttactacagcccgagcgaagtgcgcgtggttgccgaaggcttt660gattttgccaacggtatcaacatcagcccggacggcaagtatgtgtatatcgccgaactg720ctggcccacaaaatccacgtgtacgaaaagcacgccaattggactttaaccccgctgaaa780agtctggattttaacactttagttgacaacattagcgttgacccggaaaccggtgattta840tgggtgggctgtcacccgaatggtatgaagatcttcttttatgatagcgagaacccgccg900gccagcgaagtgctgcgcattcagaacattctgaccgaagagccgaaagtgacccaagtt960tatgccgaaaatggcacagttctgcaaggtagcaccgtggccagtgtgtataaaggcaag1020ctgctgatcggcaccgtgtttcacaaagcactgtactgtgaactgtaa1068<210>2<211>1068<212>dna<213>artificalsequence<400>2atggccaaactgatcgcactgacactgctgggcatgggtttagctttatttcgcaatcac60cagagcagctaccagacccgtttaaacgctttacgtgaagttcagccggttgagctgccg120aattgcaacttagtgaaaggcatcgagaccggcagtgaggatctggagattctgccgaac180ggtttagcctttatcagtagcggtttaaaatacccgggcatcaagagcttcaacccgaat240agcccgggtaaaattttactgatggatttaaacgaagaagatccgaccgttctggaactg300ggtatcaccggcagcaagttcgacgtgagcagctttaatccttggggcatcagcaccttc360accgacgaagacaacgccatgtatttactggttgtgaaccatccggatgccaaaagcacc420gttgagctgtttaaatttcaagaagaagaaaaatctttactgcatttaaaaaccattcgc480cataagctgctgccgaacttaaacgacatcgtggcagtgggcccggaacacttttacggc540accaacgaccactactttttagatccgtatctgcgcagctgggagatgtatctgggtctg600gcttggagctatgtggtgtactacagcccgagcgaagttcgcgttgtggccgagggtttc660gatttcgccaacggcatcaacattagcccggacggtaagtacgtgtacattgccgagctg720ctggcccataaaattcacgtgtacgaaaaacatgccaactggactttaaccccgttaaag780tctttagactttaacaccttagtggacaacatcagcgtggatccggagactggtgatctg840tgggtgggctgccacccgaatggtatgaaaatcttcttctacgatagcgaaaatccgccg900gccagcgaggttttacgtattcagaacattctgaccgaagaaccgaaagtgacccaagtt960tacgcagaaaatggcaccgtgttacaaggtagtaccgtggcaagcgtttacaagggcaaa1020ctgctgatcggcaccgtgtttcataaggctttatactgcgaactgtaa1068<210>3<211>1068<212>dna<213>artificalsequence<400>3atggccaagctgattgctttaactttactgggcatgggtctggcactgtttcgcaaccat60cagagcagctatcagacccgtctgaacgctttacgcgaagttcagcccgttgaactgccg120aactgcaatctggtgaagggcattgagaccggtagcgaagatttagagattttaccgaac180ggtctggcctttatcagtagcggtttaaagtatccgggtattaagagctttaatccgaat240agcccgggcaagattctgctgatggatctgaatgaagaggatccgaccgtgctggagctg300ggcatcaccggcagtaaattcgacgtgagcagcttcaacccgcatggcattagcaccttt360accgatgaggacaacgccatgtatttactggtggtgaatcatccggatgccaaaagcacc420gtggaactgttcaagttccaagaagaagagaagagtctgctgcatttaaaaaccattcgc480cacaaactgctgccgaatttaaatgacatcgttgccgttggccccgaacatttttacggt540accaacgaccactattttttagacccgtatttaaagagttgggaaatgtatttaggttta600gcatggagctatgtggtgtactacagcccgagcgaggttcgcgttgttgccgaaggcttt660gacttcgccaatggcattaatatcagcccggacggcaagtacgtgtatatcgccgagctg720ctggcccataagatccacgtgtacgagaaacacgccaactggactttaaccccgctgaag780agtctggatttcaacactttagtggacaacatcagcgtggacccggaaaccggcgattta840tgggttggctgccatccgaacggcatgaaaattttcttttatgatagcgaaaatccgccg900gcaagcgaggtgctgcgcatccagaatattttaaccgaggaaccgaaggtgacccaagtt960tacgccgaaaacggtacagttttacaaggtagcacagtggccagtgtgtataagggcaaa1020ctgctgattggcaccgtgttccacaaggcactgtattgtgagctgtaa1068<210>4<211>1068<212>dna<213>artificalsequence<400>4atggccaagctgattgcactgactttactgggtatgggtctggctttatttcgcaatcac60cagagtagctatcagacccgtttaaatgccttacgtgaagtgcagccggtggagctgccg120aactgcaatctggtgaagggcattgagaccggcagtgaagatttagagattttaccgaat180ggtttagcctttattagcagtggtttaaaggcccccggtatcaagagctttaatccgaac240agcccgggcaagattttattaatggatttaaacgaggaagatccgaccgtgctggaactg300ggcattaccggcagcaaattcgacgtgagtagcttcaacccgtggggtattagcaccttt360accgacgaggacaacgccatgtatttactggtggtgaatcacccggatgccaagagcacc420gtggagctgttcaagttccaagaagaggagaagtctttactgcatctgaagaccattcgc480cataagctgctgccgaatctgaacgatatcgtggcagttggtccggagcacttctacggc540accaacgaccattactttttagatccgtatttacgtagctgggaaatgtatttaggtctg600gcatggagctacgtggtttactacagcccgagcgaagtgcgcgtggttgccgaaggcttt660gattttgccaacggtatcaacatcagcccggacggcaagtatgtgtatatcgccgaactg720ctggcccacaaaatccacgtgtacgaaaagcacgccaattggactttaaccccgctgaaa780agtctggattttaacactttagttgacaacattagcgttgacccggaaaccggtgattta840tgggtgggctgtcacccgaatggtatgaagatcttcttttatgatagcgagaacccgccg900gccagcgaagtgctgcgcattcagaacattctgaccgaagagccgaaagtgacccaagtt960tatgccgaaaatggcacagttctgcaaggtagcaccgtggccagtgtgtataaaggcaag1020ctgctgatcggcaccgtgtttcacaaagcactgtactgtgaactgtaa1068<210>5<211>1068<212>dna<213>artificalsequence<400>5atggccaagctgattgctttaactttactgggcatgggtctggcactgtttcgcaaccat60cagagcagctatcagacccgtctgaacgctttacgcgaagttcagcccgttgaactgccg120aactgcaatctggtgaagggcattgagaccggtagcgaagatttagagattttaccgaac180ggtctggcctttatcagtagcggtttaaagtatccgggtattaagagctttaatccgaat240agcccgggcaagattctgctgatggatctgaatgaagaggatccgaccgtgctggagctg300ggcatcaccggcagtaaattcgacgtgagcagcttcaacccgtggggcattagcaccttt360accgatgaggacaacgccatgtatttactggtggtgaatcatccggatgccaaaagcacc420gtggaactgttcaagttccaagaagaagagaagagtctgctgcatttaaaaaccattcgc480cacaaactgctgccgaatttaaatgacatcgttgccgttggccccgaacatttttacggt540accaacgaccactattttttagacccgtatttaaagagttgggaaatgtatttaggttta600gcatggagctatgtggtgtactacagcccgagcgaggttcgcgttgt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