编码SARS-CoV-2病毒刺突蛋白的核酸及其的应用的制作方法

2021-02-02 18:02:07|

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本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及编码sars-cov-2病毒刺突蛋白的核酸及其的应用。

背景技术：

新型冠状病毒肺炎是一种急性感染性肺炎，2020年2月11日，世界卫生组织(who)将其英文名称定为coronavirusdisease2019(covid-19)。sars-cov-2病毒的核衣壳有核衣壳蛋白(nucleocapsidprotein,n)包裹单股正链rna形成，外有包膜，嵌有三种糖蛋白，刺突蛋白(spikeprotein，s)、包膜蛋白(envelopeprotein，e)和膜蛋白(membraneprotein，m)。其中，e蛋白和m蛋白主要参与病毒的装配过程，s蛋白主要通过与宿主细胞受体结合介导病毒的入侵，并决定病毒组织或宿主嗜性。

目前，仍缺乏针对新冠肺炎病原体的有效抗病毒药物，以隔离治疗、对症支持治疗为主。疫苗是防控传染病最有效的手段。目前在研的covid-19疫苗种类主要有灭活疫苗、减毒活疫苗、核酸疫苗(dna疫苗和mrna疫苗)、蛋白亚单位疫苗及病毒载体疫苗。其中mrna疫苗具有安全、有效、研发周期短等特点，在应对大规模流行病时更具有优势。

近年来moderna和biontech公司开发的mrna(信使核糖核酸)疫苗启动临床试验，提供了mrna疫苗的安全性和有效性的前期数据。目前，mrna研发的关键技术的研究主要集中在：①提高mrna稳定性及翻译效率，②调节免疫原性，③开发高效无毒的递送载体。mrna的组成包括5’帽子结构(cap)、5'utr区、编码抗原蛋白的开放阅读框(openreadingframe,orf)，3'utr区和3'poly(a)尾结构。mrna的合成一般是以含靶蛋白orf的质粒dna为模板，经体外转录合成，最后再加上5'cap和3'poly(a)尾。通过对dna模板上的utr区、poly(a)尾和体外转录时的cap，ntp等合成mrna的元件进行设计，可提高mrna的稳定性和翻译效率。此外，可利用分离和纯化技术来优化mrna。本领域认为，mrna的翻译效率与orf序列密切相关，因此，对编码刺突蛋白的核酸序列进行密码子优化是疫苗研发成功的关键。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供编码sars-cov-2病毒刺突蛋白的核酸及其的应用，进一步提供基于α病毒家族中委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(tc83venezuelanequineencephalitisvirus，veev)的spike蛋白高表达新冠mrna疫苗。

本发明提供了编码sars-cov-2病毒刺突蛋白的核酸，包括i)～iv)中至少一种：

i)、具有如seqidno:1所示核苷酸序列的核酸；

ii)、在i)所述的片段中取代、缺失或添加一个或多个核苷酸的核酸；

iii)、与如i所示的核苷酸序列具有至少70％同源性的序列且编码sars-cov-2病毒刺突蛋白的核酸；

iv)、与i)～iii)中任一项部分互补或完全互补的核酸。

一些具体实施例中，本发明提供的编码sars-cov-2病毒刺突蛋白的核酸序列如seqidno:1所示。

本发明还提供了一种重组载体，其包括骨架载体和所述的核酸。

所述重组载体包括subgenomicpromoter、本发明所述的核酸、3’utr、polya_site、5’utr。一些实施例中，本发明所述核酸插入骨架载体的位点是apai和noti位点之间。一些具体实施例中，本发明所述骨架载体的核酸序列如seqidno:2所示。本发明所述重组载体的质粒图谱如图1所示。

本发明还提供了一种线性化mrna，其核酸序列如seqidno:4。

本发明所述线性化mrna的制备方法，其包括：将所述的重组载体线性化后，经体外转录、模板dna降解、5’端加7-甲基化鸟苷酸帽，获得seqidno:4所示的线性化mrna。一些实施例中，所述线性化采用的酶为bspqi。所述体外转录在t7rna聚合酶存在下进行。所述模板dna的降解采用turbodnase。所述5’端加7-甲基化鸟苷酸帽在加帽酶(vacciniacappingenzyme)存在下进行。

本发明所述的核酸、重组载体、或线性化mrna，在制备新型冠状病毒mrna疫苗中的应用。

一种mrna-lnp复合物，其制备原料包括所述的线性化mrna和脂类。

本发明所述复合物中所述脂类包括：dmg-peg2000、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰胆碱和dlindma；其中dmg-peg2000、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰胆碱和dlindma的摩尔比为2:48:10:40。

本发明所述复合物的制备方法为，将所述的线性化mrna和脂类经快速混合，制成脂质体。

本发明还提供了一种新型冠状病毒疫苗，其包括本发明所述的复合物。

本发明所述的疫苗中还包括疫苗中可接受的辅料；其中所述的复合物的浓度为30μg/ml。

一种预防新型冠状病毒的方法，其为给予本发明所述的疫苗。

通过密码子优化，本发明提供了基于α病毒家族中委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(tc83venezuelanequineencephalitisvirus，veev)的spike高表达新冠mrna疫苗，该疫苗在动物实验中，接种14天后即可检测到spike抗体。

附图说明

图1是本发明的mrna-spike质粒结构图谱，含有卡那霉素抗性基因(kan)、t7启动子基因、nsp基因、spike基因、polya基因；

图2是本发明的mrna-spike体外转录后的电泳结果图；泳道1为mrna-spike，泳道m为rnaladder；

图3是本发明通过western检测，mrna-spike在体外转染bhk细胞后spike蛋白表达图；

图4是本发明通过elisa检测，mrna-spike免疫小鼠后所产生的抗spike抗体滴度结果图，其中，a示未经过密码子优化的野生型序列制备疫苗后的抗体滴度，b示本发明经过密码子的序列制备疫苗后的抗体滴度，其中1#mock～3#mock示不给疫苗也不造模的空白对照组；1#0.5μg～5#0.5μg分别示给药剂量为0.5μg的5只小鼠；1#0.2μg～4#0.2μg分别示给药剂量为0.2μg的4只小鼠；1#1.0μg～5#1.0μg分别示给药剂量为1.0μg的5只小鼠。

具体实施方式

本发明提供了编码sars-cov-2病毒刺突蛋白的核酸及其的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

本发明所述sars-cov-2病毒刺突蛋白，即sars-cov-2病毒的spike蛋白，或称为s蛋白具体为sars-cov-2，wuhanseafoodmarketpneumoniavirusisolatewuhan-hu-1株的spike蛋白，其ncbi登录号为mn908947.3。编码核酸序列进行密码子优化。经优化后的dna序列更有利于在人体内的表达，因此可以获得更高表达水平的spike蛋白，进而提高疫苗接种后spike抗体的产生量和产生速度，从而获得良好的免疫效果。

本发明中，所述核酸是指由多个核苷酸聚合成的生物大分子化合物，本发明所述的核酸可以是dna分子、rna分子、pna分子或lna的形式。其可以为单链、双链形式存在，可为线性或环状。所述dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。所述dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。本发明中，经优化后的编码sars-cov-2病毒的s蛋白的dna序列如seqidno:1所示，具体的，seqidno:1所示核苷酸序列为：atgttcgtgttcctcgtgctgctgcccctggtgtctagccagtgcgtgaacctgaccaccagaacccagctgcctccagcctacaccaacagcttcaccaggggagtgtactaccccgacaaggtgttccggagcagcgtgctgcatagcacccaggacctgttcctgcccttcttcagcaacgtgacttggttccacgccatccacgtcagcggaaccaacggcaccaagcgctttgacaacccagtgctgcccttcaacgacggagtgtacttcgccagcaccgagaagtccaacatcatccggggttggatcttcggcaccacactggacagcaagacccagagcctgctgatcgtgaacaacgccaccaacgtcgtgatcaaggtctgcgagttccagttttgcaacgaccccttcctgggcgtgtactaccacaagaacaacaagtcttggatggagagcgagttccgggtgtacagcagcgccaacaattgcaccttcgagtacgtgtcccagcccttcctgatggacctggaaggcaagcagggcaacttcaagaacctgcgggagttcgtgttcaagaacatcgacggctacttcaagatctacagcaagcacacccccatcaacctcgtgagagacctgccacagggcttcagcgctctggaacctctggtggatctgccaatcggcatcaacatcacccggttccagaccctgctggctctgcacagaagctacctgaccccaggcgattcttctagcggctggacagcaggagccgccgcttattacgtgggctatctgcagccccggaccttcctgctgaagtacaacgagaacggcaccatcaccgacgcagtggattgcgctctggatcctctgagcgagaccaagtgcaccctgaagtccttcaccgtggagaagggcatctaccagaccagcaacttccgggtgcagcctacagagagcatcgtgcggttccctaacatcaccaacctctgccccttcggcgaggtgttcaacgccaccagattcgccagcgtctacgcctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactacagcgtgctgtacaacagcgccagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgatctgtgcttcaccaacgtgtacgccgacagcttcgtgatcaggggcgacgaagtgcgacagatcgccccaggacagacaggaaagatcgccgattacaactacaagctgcccgacgacttcaccggttgcgtgatcgcttggaacagcaacaacctggacagcaaggtcggcggcaactacaactacctgtaccggctgttccggaagtccaacctgaagcccttcgagcgggacatcagcacagagatctaccaggccggcagcacaccttgtaacggcgtggagggcttcaactgctacttccctctgcagagctacggcttccagcctacaaacggcgtgggataccagccttacagggtggtggtgctgagcttcgaactgctgcacgctccagccaccgtctgcggacctaaaaagagcaccaacctggtgaagaacaagtgcgtgaatttcaacttcaacggcctgaccggaaccggcgtgctgaccgagagcaacaagaagttcctgcccttccagcagttcggcagagacatcgcagacaccacagacgccgtgagagatcctcagaccctggagatcctggacatcaccccttgcagctttggcggagtgtccgtgatcaccccaggaaccaacaccagcaatcaggtggccgtgctgtaccaggacgtgaattgcaccgaggtgccagtggccattcacgcagatcagctgacccctacctggagagtgtacagcaccggaagcaacgtgttccagaccagggcaggttgcctgatcggagccgagcacgtgaacaacagctacgagtgcgatatccctatcggcgccggcatttgcgcctcttaccagacccagaccaacagccctaggagagccagaagcgtggcctctcagagcatcatcgcctacaccatgagcctgggagccgagaacagcgtggcctacagcaacaacagcatcgccatccccaccaacttcaccatcagcgtgaccaccgagattctgcccgtgtctatgaccaagaccagcgtcgactgcaccatgtacatctgcggcgacagcaccgagtgctctaacctgctgctgcagtacggctccttttgcacccagctgaacagggctctgacaggcatcgcagtggagcaggacaagaacacccaggaggtcttcgcccaggtcaagcagatctacaagaccccccctatcaaggacttcggcggctttaacttcagccagatcctgcccgatcccagcaagcctagcaagcggagcttcatcgaggacctgctgttcaacaaggtcaccctggccgacgcaggcttcatcaagcagtacggcgattgcctgggcgacattgccgccagagacctgatttgcgcccagaagttcaacggcctgacagtgctgcctcctctgctgaccgacgagatgatcgcccagtatacaagcgctctgctggcaggaaccatcaccagcggttggacctttggagccggagccgctctgcagatcccttttgccatgcagatggcctaccgcttcaacggaatcggcgtgacccagaacgtgctctacgagaaccagaagctgatcgccaaccagttcaacagcgccatcggcaagatccaggacagcctgagcagcacagctagcgctctgggcaagctgcaggatgtggtgaaccagaacgcccaggctctgaacaccctggtgaagcagctgagcagcaacttcggagccatcagcagcgtgctgaacgacatcctgagcaggctggacaaggtggaagccgaagtgcagatcgacaggctgatcaccggcagactgcagtctctgcagacctacgtgacccagcagctgatcagagccgccgagatcagagctagcgctaatctggccgccaccaagatgagcgagtgcgtgctgggacagagcaagagagtggacttctgcggcaagggctaccacctgatgagctttcctcagagcgctcctcacggagtggtgtttctgcacgtgacctacgtgccagcccaggagaagaacttcaccacagccccagccatttgccacgacggaaaggcccacttccccagagaaggcgtgttcgtgtccaacggcacccattggttcgtgacccagcggaacttctacgagccccagatcatcaccaccgacaacaccttcgtgagcggcaattgcgacgtggtcatcggcatcgtgaacaacaccgtgtacgaccccctgcagccagagctggactccttcaaggaggagctggacaagtacttcaagaaccacaccagcccagacgtggacctgggagatatcagcggcatcaacgccagcgtggtgaacatccagaaggagatcgacaggctgaacgaggtggccaagaacctgaacgagagcctgatcgacctgcaggagctgggcaagtacgagcagtacatcaagtggccttggtacatttggctgggcttcatcgccggcctgatcgcaatcgtcatggtgaccatcatgctctgttgcatgaccagttgctgcagctgcctgaagggttgctgcagttgcgggagttgctgcaagttcgacgaggacgacagcgagccagtgctgaaaggcgtgaagctgcactacacatga。本发明所述的核酸，还可以以rna形式存在，即将dna序列中，所有的胸腺嘧啶(t)替换为尿嘧啶(u)。一些实施例中，所述编码sars-cov-2病毒s蛋白的核酸与seqidno:3至少具有85％的同源性。另一些实施例中，所述编码sars-cov-2病毒的s蛋白的核酸与seqidno:3至少具有90％的同源性。另一些实施例中，所述编码sars-cov-2病毒的s蛋白的核酸与seqidno:3至少具有95％的同源性。另一些实施例中，所述编码sars-cov-2病毒的s蛋白的核酸与seqidno:3至少具有98％的同源性。另一些实施例中，所述编码sars-cov-2病毒的s蛋白的核酸与seqidno:3至少具有99％的同源性。

本发明中，所述重组载体，是指利用基因工程重组dna技术，将dna片段连接入骨架载体形成的基因表达载体。本发明提供的重组载体包括骨架载体和所述的核酸。其中，所述骨架载体基于α病毒家族中委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(tc83venezuelanequineencephalitisvirus，veev)进行设计。其包含了可编码α病毒自复制组件的基因，但是缺乏编码用于制造具有传染性的α病毒颗粒的结构蛋白，并且构建到的质粒中做为模板来扩增，将设计好的序列通过合成直接获得，基因序列为序列表中seqidno.2所示。

本发明中，所述线性化的mrna是由重组载体经线性化后，在体外经转录、模板dna降解、5’端加7-甲基化鸟苷酸帽获得的，其核酸序列如seqidno:4所示。本发明中，所述线性化是指在限制性内切酶的作用下，将环状的jcxh-102质粒酶切形成双链线性结构的过程。本发明实施例中，线性化使用的限制性内切酶为bspqi。所述的转录是指t7rna聚合酶存在下的体外转录反应(ivt)，该步骤在无细胞系统中，以线性化的质粒dna为模板，模仿体内转录反应发生的过程，将载体上dna形式的编码s蛋白的核酸片段转录生成相应的rna片段。将产物中的dna模板以turbodnase酶降解去除后，在转录产生的rna片段的5’端添加7-甲基化鸟苷酸帽结构。本发明具体实施例中，本发明制得的线性化的mrna核酸序列如seqidno:4所示。

本发明所述的核酸、重组载体、或线性化mrna都是疫苗制备过程中的原料或中间产物。在疫苗的生产、制备过程中，所述核酸、重组载体或线性化的mrna可以在每次制备开始前，重新合成，也可以合成后于适宜的条件下存储备用。所述的适宜条件包括-80℃～0℃，优选在-80℃～-40℃保存。

本发明中，所述的mrna-lnp复合物是由脂类包裹mrna形成。制备获得的mrna-lnp复合物通过浓缩及换液制得所述疫苗所得疫苗的溶液为pbs缓冲液，其中mrna-lnp复合物的浓度为30μg/ml。本发明所述疫苗能够用于防治因sars-cov-2病毒感染引起的新型冠状肺炎。该疫苗的应用方法采用疫苗的初免-加强给药应用方式；疫苗的初免-加强给药使用相同的mrna-spike疫苗。疫苗的给药方式为肌肉注射。

本发明所述的spike高表达新冠mrna疫苗的制备方法，制备mrna-spike的步骤包括：

步骤一，合成spike基因片段；

查询spike氨基酸序列，然后根据人偏好密码子表进行密码子优化得到优化后的序列，再在其上游加入apai酶切位点(gggccc)和启动子(subgenomicpromoter)，下游加入noti酶切位点(gcggccgc)，将设计好的序列通过合成直接获得，基因序列为序列表中seqidno.1所示；

步骤二，构建tc-83自复制载体；

自复制mrna是根据α病毒家族中委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(tc83venezuelanequineencephalitisvirus，veev)的基因组进行设计的，其包含了可编码α病毒自复制组件的基因，但是缺乏编码用于制造具有传染性的α病毒颗粒的结构蛋白，并且构建到的质粒中做为模板来扩增，将设计好的序列通过合成直接获得，基因序列为序列表中seqidno.2所示

步骤三，重组质粒jcxh-102的制备方法如下：

将上游携带apai、下游携带noti的spike基因插入tc-83复制载体的apai和notⅰ酶切位点之间，得到重组质粒jcxh-102(见图1)，基因序列为序列表中seqidno.3所示；

步骤四，jcxh-102质粒用bspqi酶切线性化；

步骤五，线性化后jcxh-102质粒第一步使用t7rna聚合酶开始的体外转录反应(ivt)，第二步使用turbodnase酶对模板dna进行降解和使用加帽酶(vacciniacappingenzyme)将7-甲基化鸟苷酸帽结构(7-methylguanylatecapstructure，称为cap0)加至转录的mrna的5’端，基因序列为序列表中seqidno.4所示。

步骤六，mrna与脂类(其组成以物质的量计包括2％的1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethyleneglycol-2000(dmg-peg2000)、48％的胆固醇、10％的二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)以及40％的阳离子脂类(dlindma))通过nanoassemblr混合器进行快速的混合，从而引起脂类的沉淀及在电荷作用mrna包裹进入lnp内。mrna-lnp复合物随后通过浓缩及换液至制剂溶液中。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。需要说明的是：mrna-spike体外转录mrna产物，且本申请说明书已经详细描述了体外转录及脂质体包裹的全部过程，任何公司或个人，按照说明书上的步骤均能制备的体外转录脂质体包裹的mrna疫苗。下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1.疫苗mrna-spike的制备；

1.spike基因片段合成

从ncbi上查询spike(sars-cov-2，wuhanseafoodmarketpneumoniavirusisolatewuhan-hu-1株)蛋白基因，然后根据人密码子进行相应优化(seqidno:1所示)，并在上游加入apai酶切位点(gggccc)和启动子(subgenomicpromoter，序列为ctataactctctacggctaacctgaatggactacgacatagtctagtccgccaag)，下游加入noti酶切位点(gcggccgc)和保护碱基(taaggcgcgcccaccca)，最后通过合成直接获得dna序列(以公司提供克隆质粒puc57-spike的形式获得)。

2.构建tc-83自复制载体

3.重组质粒jcxh-102的制备方法如下，

puc57-spike和tc-83自复制载体用apaⅰ和notⅰ双酶切，酶切体系20μl：puc57-spike或tc-83自复制载体＜1μg，apaⅰ1μl，notⅰ1μl，10×cutsmartbuffer2μl，ddh2o将体系补足20μl。25℃水浴1h酶切质粒，然后37℃水浴1h酶切质粒，载体片段需加0.5μlcip，37℃水浴30min去磷酸化。将酶切混合物与6×loadingbuffer混合，电泳(1％琼脂糖，94v)并胶回收相应长度的片段(puc57-spike回收片段spike基因片段，长度为3897bp；tc-83自复制载体回收片段，长度约9.5kb)，以30μlelutionbuffer洗脱。

分别取spike基因片段与tc-83自复制载体片段按照连接体系：载体50ng，插入片段摩尔数：载体片段摩尔数＝5:1，t4ligase1μl，10×ligasebuffer5μl，ddh2o将体系补足10μl，22℃连接1h。将连接产物按体积1:10与大肠杆菌dh5α的感受态细胞轻柔混匀，冰浴30min，42℃热击45s，冰浴3min，加入预热的sob肉汤500μl，混匀后于37℃，180rpm培养1h，涂布于lk平板(lb-kan平板：含50μg/mlkan的lb平板)，37℃培养16-20h。

pcr筛选：以煮沸法提取的细菌质粒为模板，扩增目的条带spike，上游引物f：5’-tatggccatgactactctagcta-3’，下游引物r：5’-gggaaacgcctggtatcttt-3’，反应循环条件为：94℃3min→(94℃1min，47℃30s，72℃3min)×30个循环→72℃10min→4℃；电泳观察pcr结果(电泳条件：1％琼脂糖凝胶；90v，上样量：5μlpcr产物)，预期结果：spike片段约4300bp。

酶切验证：pcr筛选验证的阳性菌提取质粒，按照上述酶切体系以apaⅰ和notⅰ进行酶切，将酶切混合物与6×loadingbuffer混合进行电泳(1％琼脂糖，94v)。

测序验证：提取pcr及酶切验证符合预期的质粒送测序公司测序。将测序验证后完全正确的携带阳性质粒的大肠杆菌保存于-80℃。

4.jcxh-102质粒用bspqi酶切线性化及回收方法如下，

jcxh-102质粒10μg，bspqi1μl，10×nebuffer3.15μl，ddh2o将体系补足50μl，50℃水浴1h酶切质粒。将酶切混合物与6×loadingbuffer混合，电泳(1％琼脂糖，94v)并胶回收相应长度的片段(jcxh-102质粒用，长度约13kb)，以30μlelutionbuffer洗脱。

5.线性化后jcxh-102质粒使用t7rna聚合酶开始的体外转录反应(ivt)，turbodnase酶对模板dna进行降解，和加帽酶(vacciniacappingenzyme)将7-甲基化鸟苷酸帽结构(7-methylguanylatecapstructure，称为cap0)加至转录的mrna的5’端，具体方法如下。

10×reactionbuffer2μl，ntp每种0.5mm，线性化jcxh-1021μg，t7rnapolymerase2μl，补水至20μl，30℃反应1小时后加入，1μlturbo^tmdnase，10×cappingbuffer4μl，gtp(10mm)2μl，sam(2mm)2μl，vacciniacappingenzyme2μl，总体积补水至总体积40μl，30℃反应1小时。后补水至200μl再加入7.5m氯化锂120μl混匀后，-20℃静置30分钟后，14000g4℃离心30分钟，弃上清后用70％酒精清洗沉淀，14000g4℃离心5分钟，弃上清后风干5分钟，溶解在40μl水内。用分光光度计定量后，取400ng和10μlnorthernmax-glysampleloadingdye混合，50℃孵育30分钟后，用northernmax-glygelprep/running缓冲液电泳(1％琼脂糖，70v)。电泳图片见图2。

6.mrna-spike与脂类包裹步骤如下。

摩尔比8:1n:p(n为dlindma，p为rna)，mrna与脂类(摩尔组成包括2％的1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethyleneglycol-2000(dmg-peg2000)、48％的胆固醇、10％的二硬脂酰基磷脂酰胆碱(dspc)以及40％的阳离子脂类(dlindma)，溶解在酒精内。geall,andrewj.,etal.“nonviraldeliveryofself-amplifyingrnavaccines.”proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica,vol.109,no.36,2012,pp.14604–14609.)通过nanoassemblr混合器进行快速的混合，从而引起脂类的沉淀及在电荷作用mrna包裹进入lnp内。mrna-lnp复合物随后通过浓缩及换液至制剂溶液中。

7.westernblot检测mrna-spike在细胞中的表达情况。将购于上海细胞中心的bhk-21细胞传代培养，待细胞数量足够，胰酶消化至细胞培养6孔板每孔，铺板37℃co2培养箱过夜。第二天将脂质体包裹的mrna-spike转染到铺好bhk-21细胞中，培养72h后，将细胞裂解收集蛋白样品。具体方法：

1)细胞培养及铺板：将复苏好的bhk-21细胞接种在75cm²的培养瓶中，培养基为dmem高糖培养基+5％的双抗+10％胎牛血清，待细胞在瓶底的汇集度达到80％以上，用胰酶将细胞消化下来，并计数。在6孔细胞培养板中铺入适宜数量的细胞，37℃co2培养箱过夜。

2)脂质体mrna转染bhk-21细胞：吸干铺好的6孔板中的培养基，用pbs缓冲液清洗一遍，将脂质体包裹的mrna与1mlopti-mem培养基混合，加至清洗好的6孔板中，37℃co2培养箱6h后补充1ml含有20％胎牛血清的dmem高糖培养基。37℃co2培养箱，培养72h。

3)蛋白样品的处理：在72小时后的bhk-21细胞中加入200μl细胞裂解液及1％的pmsf，冰上放置5分钟，离心机14000g离心5分钟，将上清转移至新的离心管，加入5×sds95℃金属浴12分钟。放在-20℃备用。

4)westernblot检测：

电泳：聚丙稀酰胺分离胶浓度为6％，蛋白上样量20μl，积层胶电泳条件150v，10min，分离胶电泳条件为200v，30min。

电转：使用硝酸纤维素膜膜，在100v电压下转膜1小时。

封闭：使用1×pbst配制5％bsa作为封闭液，4℃封闭过夜。

一抗孵育：使用封闭液将sara-cov-2(2019-ncov)spike抗体以1：500进行稀释，在室温下孵育2小时。用1×pbst洗3次，每次5分钟。

二抗孵育：使用封闭液稀释二抗，稀释比为1：10000，在室温下孵育1小时。用1×pbst洗3次，每次5分钟。

显影：显影液a液：b液＝1：1，在成像系统中进行显影。结果见图片3。

8.mrna-spike免疫小鼠诱导的抗spike抗体滴度检测

6～8周龄的balb/c雌鼠适应性喂养3天后，3只为对照组注射pbs，5只为0.5μg组，分别肌肉免疫未经过密码子优化后mrna-spike的疫苗，注射0.5μg剂量。35天后，再加强注射0.5μg剂量。70天后，取血检测针对spike抗体滴度。

或者6～8周龄的balb/c雌鼠适应性喂养3天后，2只为对照组注射pbs，4只为0.2μg组，2只为0.5μg组，5只为1μg组，分别肌肉免疫经过密码子优化后mrna-spike的疫苗，注射0.2μg，0.5μg和1μg剂量。35天后，再加强注射0.2μg，0.5μg和1μg剂量。70天后，取血检测针对spike抗体滴度。

抗体滴度检测方法为elisa具体操作如下，96孔酶标板每孔包被50ngspikerbd结构域蛋白室温过夜，第二天用pbst清洗3遍，用5％牛奶封闭，37度1小时后，pbst清洗3遍，加入对应稀释比例的小鼠血清，37℃1小时后，pbst清洗3遍，加入抗小鼠igg重链轻链hrp，37℃1小时后，pbst清洗3遍，最后加入显色液显色。如图4a所示；为未经过密码子的mrna-spike疫苗免疫小鼠后，血清中抗spike抗体滴度，如图4b所示；为经过密码子优化后mrna-spike疫苗免疫小鼠后，血清中抗spike抗体滴度。对比可知经密码子优化后的mrna-spike疫苗，免疫小鼠后产生的抗体滴度更高，效果更好。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>成都欧林生物科技股份有限公司

嘉晨西海（杭州）生物技术有限公司

<120>编码sars-cov-2病毒刺突蛋白的核酸及其的应用

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