一种共表达呼吸道合胞病毒融合前蛋白和黏附糖蛋白的复制缺陷型腺病毒载体疫苗的制作方法

2021-02-02 18:02:00|

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一种共表达呼吸道合胞病毒融合前蛋白和黏附糖蛋白的复制缺陷型腺病毒载体疫苗的制作方法

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种共表达呼吸道合胞病毒呼吸道合胞病毒融合前融合糖蛋白(pref)和黏附糖蛋白130-230aa(g130-230)的核苷酸序列及其制备方法和载体。

背景技术：

人呼吸道合胞病毒(humanrespiratorysyncytialvirus,rsv)是引起婴幼儿下呼吸道感染最重要的病毒病原，几乎100％的婴幼儿在2岁以内感染过1次以上。在1月至1岁的儿童死亡原因中，rsv感染引起的死亡人数约占总数的6.7％，紧随疟疾，排列第二位。在小于5岁的儿童因下呼吸道感染引起死亡的原因中，rsv感染引起的死亡人数约占总数的6.29％，紧随肺炎球菌，位列第二位。在我国，rsv是引起儿童流行性喘憋性肺炎(简称流喘肺炎)及儿童期变应性哮喘的主要病原，26.5％的婴幼儿急性呼吸道感染是由于rsv感染引起。老年人和存在免疫缺陷的病人也易遭受rsv引起的严重感染，且有感染史者易发生肺功能异常、支气管哮喘等肺部疾病。

虽然rsv重要性已被广泛认识，但是经过多年的努力，rsv的诊断、预防及治疗依然缺乏有效、可靠的方法。因此who将rsv疫苗列为二十一世纪应优先发展的疫苗之一。研发可用于预防rsv感染的疫苗，必将有助于提高婴幼儿及老年人群的健康水平，实现良好的社会效益和经济效益。

rsv属于肺炎病毒科、正肺病毒属(orthopneumovirus)，基因组为单股负链rna，编码11种蛋白，其中融合糖蛋白(fusionglycoprotein，f)和黏附糖蛋白(attachmentglycoprotein，g)为主要中和抗原。根据g蛋白抗原性的差异，rsv分为a和b两个亚型，针对g蛋白保守区的中和抗体能够抑制a、b两个亚型的rsv感染，减低疾病严重程度。f蛋白具有多个中和抗原表位，且抗原性较稳定，针对f蛋白的中和抗体对a、b两个亚型的rsv感染具有交叉保护作用，因而成为rsv疫苗研制的主要目标抗原。天然状态下，f蛋白主要有两种构象状态：即亚稳态的融合前f(prefusion，pref)和稳定的融合后f(postfusion，postf)。在已鉴定的rsvf蛋白中和抗原表位中，sitei主要位于post-f上，siteii和iv在pre-f和post-f上均存在，siteiii主要位于pre-f，sitev和仅存在于pre-f。进一步研究表明，在感染者血清中的具有保护作用的主要中和抗体是针对siteiii、v和的抗体，与post-f相比，pre-f能够诱导机体产生更高的中和活性和更好的保护作用。因此，近年来，pre-f成为rsv疫苗研制的重点。研究发现针对f蛋白的单克隆中和抗体可降低高危人群rsv感染相关疾病严重程度[8]，在rsv流行季节，这种单克隆抗体(palivizumab,帕利珠单抗)已用于对高危人群的预防。因此，当前rsv疫苗设计的首要目标是产生足够高的中和抗体。

但是，不少研究显示，尽管针对rsvf中和抗体能够降低rsv相关疾病严重程度，但高水平中和抗体并不能阻止rsv感染所致疾病，也不能阻止再次感染rsv。理想的rsv疫苗应该能同时诱导产生高滴度和多样性中和抗体。目前，现有技术中的基因工程疫苗或新型疫苗过于依赖中和抗原f蛋白，忽视中和抗原g蛋白，存在免疫原性不足的问题。

技术实现要素：

本发明的实施例首先提供了一种共表达呼吸道合胞病毒呼吸道合胞病毒融合前融合糖蛋白(pref)和黏附糖蛋白130-230aa(g130-230)的核苷酸序列及其制备方法、含有核苷酸序列的载体，以克服现有技术的问题。

为了实现上述目的，本发明采取了如下技术方案。

根据本发明的一个方面，提供了一种共表达呼吸道合胞病毒pref和g130-230的核苷酸序列，该核苷酸序列包括pref和g130-230的核酸序列，pref和g130-230的核酸序列由t2a序列连接在一起，该核苷酸序含有如pref2a3g序列所示的编码序列：

pref2a3g序列

gccaccatggaactgctgatcctgaaggccaacgccatcaccaccatcctgaccgctgtgaccttctgcttcgccagcggccagaacatcaccgaggaattctaccagagcacctgtagcgccgtgtccaagggctacctgagcgccctgcggaccggctggtacaccagcgtgatcaccatcgagctgagcaacatcaagaaaatcaagtgcaacggcaccgacgccaagatcaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagaacgccgtgaccgagctgcagctgctgatgcagagcacccccgccaccaacaaccaggctagaggcagcggaagcggacggtccctgggcttcctgctgggcgtgggcagcgccattgctagcggagtggccgtgtcaaaggtgctgcacctggaaggcgaagtgaacaagatcaagtccgccctgctgagcaccaacaaggccgtggtgtccctgagcaacggcgtgtccgtgctgaccagcaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcccatcgtgaacaagcagagctgcagcatccccaacatcgagacagtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggaaatcacccgcgagttcagcgtgaacgccggcgtgaccacccccgtgtccacctacatgctgaccaacagcgagctgctgagcctgatcaacgacatgcccatcaccaacgaccagaaaaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagagctactccatcatgagcatcatcaaagaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcccctgtacggcgtgatcgacaccccctgctggaagctgcacaccagccccctgtgcaccaccaacaccaaagagggcagcaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgataatgccggcagcgtgtcattctttccacaagccgagacatgcaaggtgcagagcaaccgggtgttctgcgacaccatgaacagcctgaccctgccctccgaagtgaacctgtgcaacgtggacatcttcaaccctaagtacgactgcaagatcatgacctccaagaccgacgtgtccagctccgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgccagcaacaagaaccggggcatcatcaagaccttcagcaacggctgcgactacgtgtccaacaagggggtggacaccgtgtccgtgggcaacaccctgtactacgtgaacaaacaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcccatcatcaacttctacgaccccctggtgttccccagcgaccagttcgacgccagcatcagccaggtcaacgagaagatcaaccagagcctggccttcatcagaaagagcgacgagctgctgcacaatgtgaatgccgtgaagtccaccaccaatatcatgatcaccacaatcatcatcgtgatcatcgtcatcctgctgtccctgatcgccgtgggcctgctgctgtactgcaaggcccggtccacccctgtgaccctgtccaaggaccagctgagcggcatcaacaatatcgccttctccaacgagggccgcggcagcctgctgacctgcggcgacgtggaggagaaccccggccccggtaccgccaccatggacgccatgaagaggggcctgtgctgcgtgctgctgctgtgcggcgccgtgttcgtgagccccagcaccgtgaaaacaaagaacaccaccaccacccagacccagcccagcaagcccaccaccaagcagcggcagaacaagccccccaacaagcccaacaacgacttccacttcgaggtgttcaacttcgtgccctgcagcatctgcagcaacaaccctacctgctgggccatctgcaagcggaagcctaacaagaagcccggcaagaaaaccaccacaaagcccaccaagaagcctaccttcaagaccacaaagaaggacctgaagccccagaccaccaagcccaaagaggtgcccaccactaagcccggaggcggcggatccacagtgaaaactaagaataccacaacaacacagacacagccttccaagcctacaacaaaacagaggcagaacaaacctcctaacaaacctaacaatgattttcactttgaagtgttcaattttgtgccttgctccatctgctccaacaatccaacatgttgggctatctgtaaacgcaaacccaacaagaaacctgggaaaaagaccaccaccaaacctacaaagaaacccacctttaaaaccaccaagaaagatctgaaacctcagacaacaaaacctaaagaagtgcctactaccaagcccggaggcggcggatccaccgtgaaaacaaaaaacacaacaacaactcagactcagccctctaaacccacaactaagcagagacagaacaagcctccaaacaagccaaacaatgatttccatttcgaagtgtttaactttgtgccatgttctatctgttctaacaatcccacttgttgggccatctgcaaaagaaagccaaacaaaaaacccggcaaaaagacaacaactaagcctaccaaaaagcccacattcaaaactaccaaaaaggatctgaagccacagacaactaagccaaaagaagtgcccacaacaaaaccctgataa

优选地，编码pref的核苷酸序列位于所述pref2a3g序列的5’端，编码g130-230的核苷酸序列位于pref2a3g序列的3’端。

根据本发明的另一个方面，提供了一种能够表达如权利要求1或者2所述的核苷酸序列的猩猩63型复制缺陷型重组腺病毒载体或人26型复制缺陷型重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体为pchad63或pad26。

优选地，所述63型猩猩复制缺陷型重组腺病毒载体或人26型复制缺陷型重组腺病毒载体应用在预防呼吸道合胞病毒疫苗中。

根据本发明的另一个方面，提供了一种含有所述的核苷酸序列的穿梭质粒载体，所述穿梭质粒载体为pshuttle63和pshuttle26。

根据本发明的另一个方面，提供了一种制备共表达呼吸道合胞病毒pref和g130-230的重组腺病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

构建含有所述pref2a3g序列的穿梭质粒载体；

用dnaassembly方法将所述穿梭质粒载体和骨架载体连接在一起，获得重组腺病毒载体质粒；

将所述重组腺病毒载体质粒转染包装细胞；

使所述包装细胞释放猩猩63型复制缺陷型重组腺病毒或人26型复制缺陷型重组腺病毒。

优选地，所述穿梭质粒载体为pshuttle63和pshuttle26。

优选地，所述骨架载体为pchad63或pad26。

优选地，所述重组腺病毒为rchad63/pref2a3g或rad26/pref2a3g，通过氯化铯密度梯度离心的方法对重组腺病毒进行纯化。

优选地，所述包装细胞为293细胞。

本发明的疫苗的施用可以采用方便的途径，例如肌内注射，鼻内和口服。本发明优选采用肌内途径，合适的剂量为1×10¹⁰vp。

由上述本发明的实施例提供的技术方案可以看出，本发明实施例的重组腺病毒携带密码子经过优化的呼吸道合胞病毒融合前蛋白和黏附糖蛋白130-230aa(pref2a3g)的基因。携带上述基因的重组质粒载体和重组腺病毒载体能够在转染/感染细胞中高效表达呼吸道合胞病毒融合前蛋白和黏附糖蛋白，插入所述核苷酸序列的重组腺病毒作为疫苗免疫动物后能够快速诱发针对呼吸道合胞病毒融合前蛋白和黏附糖蛋白的免疫反应。重组腺病毒载体呼吸道合胞病毒疫苗可以进行大规模的快速制备，具有可诱发强烈免疫反应的特点，能够用于人群的预防性免疫。

本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的一种携带外源基因的穿梭质粒酶切鉴定的电泳图。

质粒pshuttle63/pref2a3g经kpnⅰ和xhoⅰ双酶切后的电泳图。

图2为本发明实施例提供的一种重组质粒酶切鉴定的电泳图。

a：质粒pad26/pref2a3g分别经paci单酶切、bamhi单酶切和ecorv单酶切后的电泳图。

b：质粒pchad63/pref2a3g分别经mlui和avrii双酶切、ndei单酶切和ecori单酶切后的电泳图。

图3为本发明实施例提供的一种免疫印记鉴定f蛋白和g130-230蛋白表达情况。

图4为本发明实施例提供的一种重组腺病毒诱导balb/c小鼠产生的postf特异性血清igg。

图5为本发明实施例提供的一种重组腺病毒诱导balb/c小鼠产生的pref特异性血清igg。

图6为本发明实施例提供的一种重组腺病毒诱导balb/c小鼠产生的血清中和抗体。

图7为本发明实施例提供的一种重组腺病毒诱导balb/c小鼠产生的g蛋白特异性血清igg。

图8为本发明实施例提供的一种重组腺病毒诱导balb/c小鼠产生的g蛋白特异性血清igg。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施方式，所述实施方式的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。

本技术领域技术人员可以理解，除非特意声明，这里使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式。应该进一步理解的是，本发明的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或它们的组。应该理解，当我们称元件被“连接”或“耦接”到另一元件时，它可以直接连接或耦接到其他元件，或者也可以存在中间元件。此外，这里使用的“连接”或“耦接”可以包括无线连接或耦接。这里使用的措辞“和/或”包括一个或更多个相关联的列出项的任一单元和全部组合。

本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。

为便于对本发明实施例的理解，下面将结合附图以几个具体实施例为例做进一步的解释说明，且各个实施例并不构成对本发明实施例的限定。

同时提供多个中和抗原，诱导产生高滴度、多样性中和抗体和细胞免疫，是解决现有疫苗多存在免疫原性不足的有效手段。本发明首先将n67i、s215p和e487q三个突变位点引入全长rsvf基因，然后通过突变furin-like蛋白酶酶切位点，以及用linker(g4s)替代p27，获得构象稳定的pre-f(msc-tm)，然后将通过t2a核苷酸序列将pref蛋白核苷酸序列与g蛋白130-230aa核苷酸序列连接在一起获得pref2a3g。随后，获得携带pref2a3g的猩猩63型重组腺病毒。经氯化铯梯度超速离心法纯化后，经肌肉注射途径单次免疫babl/c小鼠，对疫苗的安全性、免疫原性及其免疫保护作用进行系统、全面的评价。

本发明首先提供了一种能够共表达呼吸道合胞病毒融合前融合糖蛋白和黏附糖蛋白130-230aa(pref2a3g)的核苷酸序列，所述核苷酸序列如序列1所示。

在实际应用中，可以通过63型猩猩复制缺陷型重组腺病毒载体表达所述核苷酸序列，所述重组腺病毒载体为pchad63。

本发明还提供了一种含有上述核苷酸序列的穿梭质粒载体，所述载体为pshuttle63。

本发明还提供了如上所述的猩猩63型复制缺陷型重组腺病毒载体在制备预防呼吸道合胞病毒疫苗中的应用。本发明的疫苗的施用可以采用方便的途径，例如肌内注射，鼻内和口服。本发明优选采用肌内注射，单次免疫，合适的剂量为1×10¹⁰vp。

本发明还提供了一种制备可表达呼吸道合胞病毒融合前融合糖蛋白和黏附糖蛋白pref2a3g的重组腺病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1、构建含有如权利要求1所述核苷酸序列的穿梭质粒载体；

步骤2、用dna组装的方法连接步骤(1)所述穿梭质粒载体和骨架载体，获得重组腺病毒载体；

步骤3、将步骤(2)所述重组腺病毒载体转染包装细胞；

步骤4、将步骤(3)所述细胞释放猩猩63型复制缺陷型重组腺病毒。

步骤(1)所述穿梭质粒载体为pshuttle63。

步骤(2)所述骨架载体为pchad63。

步骤(2)所述重组腺病毒载体为pchad63/pref2a3g。

步骤(3)所述包装细胞为293细胞。

在步骤(4)中，样品通过氯化铯密度梯度离心的方法对重组腺病毒进行纯化。

实施例1、pref2a3g核苷酸序列构建

1、设计定点突变引物，将n67i,s215p和e487q三个突变位点引入全长rsvf基因，突变引物5'端磷酸化，进行突变链合成反应，dpnⅰ消化扩增产物，转化到感受态细胞，提取质粒得到pcdna3.1/tm。定点突变引物见如下：

n67iprimer:5'-agctgagcaacatcaagaaaatcaagtgcaacggc-3'

s215pprimer:5'-gcagagctgcagcatccccaacatcgagacagtg-3'

e487qprimer:5'-gttccccagcgaccagttcgacgccag-3'

2、设计重叠pcr引物，以pcdna3.1/tm为模板，添加gslinker。通过凝胶电泳鉴定pcr后产物，得到preft片段，克隆到pmd18-t载体中，得到质粒pmd18-t-preft。重叠pcr引物如下：

上游引物1:5’-caacaaccaggctagaggcagcggaagcggacggtccctgggcttcctgctg-3’

下游引物1:5’-cagcaggaagcccagggaccgtccgcttccgctgcctctagcctggttgttggtg-3’

上游引物2:5’-ggtaccggatccgccaccatggaactgctgatcctgaagg-3’

下游引物2:5’-catgagctcgagtcagttggagaaggcgatattgttgatgc-3’

3、pmd18-t-preft测序后，用限制性核酸内切酶bamhⅰ和xhoⅰ分别双酶切pmd18-t-preft和pcdna3.1。凝胶电泳回收目的片段和载体，将所得的preft基因克隆到pcdna3.1载体中，得到pcdna3.1/pref重组质粒。

4、以pcdna3.1/pref为模板，设计重叠pcr引物，在两端分别添加aflⅱ和kpni酶切位点及相应保护性碱基agatct和gtcgac，扩增pref+t2a序列，重叠pcr引物如下：

上游引物：5’-agatctcttaaggccaccatggaactgctgatcc-3’

下游引物1：5’-gccgcaggtcagcaggctgccgcggccctcgttggagaaggcgatattg-3’

下游引物2：5’-gtcgacggtaccggggccggggttctcctccacgtcgccgcaggtcagcaggct-3’

用限制性核酸内切酶aflⅱ和kpni分别双酶切pshuttle26-1-3g和步骤1所得pcr产物，凝胶电泳回收载体片段和目的片段，连接、转化、获得pshuttle26/pref2a3g，即获得pref2a3g核苷酸序列。

实施例2、重组腺病毒的制备及体外鉴定

1、用限制性核酸内切酶aflⅱ和sali分别双酶切步骤2所得pshuttle26/pref2a3g和pshuttle63，凝胶电泳回收载体片段和约目的片段，连接、转化、提取质粒，用限制性核酸内切酶kpni和xhoi双酶切，电泳得到约2800bp和4000bp两条带，获得pshuttle63/pref2a3g。

2、用限制性核酸内切酶scai单酶切pshuttle63/pref2a3g，用限制性核酸内切酶hpai单酶切pchad63，运用hifidnaassembly试剂盒的方法，连接载体片段和目的片段，于dh5α感受态细胞中进行转化，提取质粒。用限制性核酸内切酶mlui单酶切，电泳得到约7500bp和28000bp两条带，用限制性核酸内切酶ndei单酶切，电泳得到约28000bp和34000bp两条带，用限制性核酸内切酶ecori和avrii双酶切，电泳得到约2000bp、12000bp和22000bp三条带，得到重组质粒pchad63/pref2a3g。

3、用限制性核酸内切酶pmei单酶切pshuttle26/pref2a3g，转染到含pad26的bj5183感受态，同源重组获得重组质粒pad26/pref2a3g。

4、转染293细胞，拯救出重组病毒rchad63/pref2a3g和rad26/pref2a3g。wb鉴定表达水平，免疫斑(dotblot)检测各重组腺病毒表达的蛋白融合前表位。

取p4代重组腺病毒病毒液各2μl，分别接种于细胞密度为80％的293细胞。48h后细胞发生病变，收集细胞，利用识别不同表位的f蛋白单克隆抗体，采用dotblot的方法检测重组腺病毒表达的f蛋白的融合前表位情况。

实施例3、重组腺病毒的应用

一、动物免疫

6-8周龄的雌性balb/c小鼠，分成3组，第0d，第一次肌肉注射免疫。在免疫后第21d，眼内眦静脉采集第一次免疫后血。第28d，肌肉注射第二次免疫。第49d，眼内眦静脉采集第二次免疫后血。第56d，经滴鼻途径进行攻毒实验，攻毒的剂量为1×10⁶pfu/50μl的wtrsv。

分组及处理如下：

第一组(g1组)：采用肌肉注射方式进行二次免疫，初次免疫物为rchad63/empty病毒液(病毒量为1×10¹⁰vp)，二次免疫物为rchad63/empty病毒液(病毒量为1×10¹⁰vp)；

第二组(g2组)：采用肌肉注射方式进行二次免疫，初次免疫物为rchad63/pref病毒液(病毒量为1×10¹⁰vp)，二次免疫物为rchad63/pref病毒液(病毒量为1×10¹⁰vp)；

第三组(g3组)：采用肌肉注射方式进行二次免疫，初次免疫物为rchad63/pref2a3g病毒液(病毒量为1×10¹⁰vp)，二次免疫物为rchad63/pref2a3g病毒液(病毒量为1×10¹⁰vp)；

第四组(g4组)：采用肌肉注射方式进行二次免疫，初次免疫物为rad26/empty病毒液(病毒量为1×10¹⁰vp)，二次免疫物为rad26/empty病毒液(病毒量为1×10¹⁰vp)；

第五组(g5组)：采用肌肉注射方式进行二次免疫，初次免疫物为rad26/pref病毒液(病毒量为1×10¹⁰vp)，二次免疫物为rad26/pref病毒液(病毒量为1×10¹⁰vp)；

第六组(g6组)：采用肌肉注射方式进行二次免疫，初次免疫物为rad26/pref2a3g病毒液(病毒量为1×10¹⁰vp)，二次免疫物为rchad63/pref2a3g病毒液(病毒量为1×10¹⁰vp)；

二、免疫后小鼠血清igg检测

待测溶液为：步骤一中免疫后第第49d采集小鼠静脉血，分离获得血清。

采用elisa方法检测小鼠的血清抗体滴度。纯化rsv按2500pfu/孔包被酶标板、融合前f蛋白(pref)按450ng/孔包被酶标板，融合后f蛋白(postf)1200ng/孔包被酶标板，elisa方法检测小鼠血清抗体igg。

三、免疫后小鼠血清中和抗体

1、按照2.0×10⁴细胞/孔的密度将hep-2细胞接种到96孔板上，培养24h。

2、将免疫后小鼠血清于56℃，灭活30min，并用2％胎牛血清的dmem培养液进行2倍稀释。不同稀释度的血清中，加入rsv-mgfp使终浓度为1000pfu/100μl，混合后于37℃孵育1h。

3、弃96孔板培养基，pbs洗涤1-2次后，将100μl混合液(含1000pfu的rsv-mgfp)加入到铺有单层hep-2细胞的96孔板中，37℃培养48h。同时设立空白对照(无病毒、无血清或抗体)、阴性对照组(有rsv-mgfp，无血清)和阳性对照组(rsv多抗替代血清)，培养2d。

4、完成步骤9后，采用多功能酶标仪spectramaxm5e检测每孔中绿色荧光蛋白的荧光强度(激发波长479nm、发射波长517nm，检测10s)。

5、实验组、阴性对照组、阳性对照组均分别减去空白对照组，利用spss建立建立实验组的线性回归方程，通过线性回归方程，计算出荧光强度减少50％的抗体滴度(ic50)。

序列表

序列1

pref2a3g序列

图1为本发明实施例提供的一种携带外源基因的穿梭质粒酶切鉴定的电泳图。

质粒pshuttle63/pref2a3g经kpnⅰ和xhoⅰ双酶切后的电泳图。

图2为本发明实施例提供的一种重组质粒酶切鉴定的电泳图。

a：质粒pad26/pref2a3g分别经paci单酶切、bamhi单酶切和ecorv单酶切后的电泳图。

b：质粒pchad63/pref2a3g分别经mlui和avrii双酶切、ndei单酶切和ecori单酶切后的电泳图。

图3为本发明实施例提供的一种免疫印记鉴定f蛋白和g130-230蛋白表达情况。

图4为本发明实施例提供的一种重组腺病毒诱导balb/c小鼠产生的postf特异性血清igg。

图5为本发明实施例提供的一种重组腺病毒诱导balb/c小鼠产生的pref特异性血清igg。

图6为本发明实施例提供的一种重组腺病毒诱导balb/c小鼠产生的血清中和抗体

图7为本发明实施例提供的一种重组腺病毒诱导balb/c小鼠产生的g蛋白特异性血清igg。

图8为本发明实施例提供的一种重组腺病毒诱导balb/c小鼠产生的g蛋白特异性血清igg。

综上所述，本发明提供的pref2a3g密码子优化核苷酸序列插入穿梭质粒pshuttle63后，与骨架载体pchad63以dna组装的方法重装并转染293细胞，包装出e1和e3联合缺失，e4orf6替换为人5型腺病毒e4orf6的重组腺病毒rchad63/pref2a3g，该重组腺病毒携带密码子经过优化的呼吸道合胞病毒融合前蛋白和黏附糖蛋白130-230aa(pref2a3g)的基因。携带上述基因的重组质粒载体和重组腺病毒载体能够在转染/感染细胞中高效表达呼吸道合胞病毒融合前蛋白和黏附糖蛋白，插入所述核苷酸序列的重组腺病毒作为疫苗免疫动物后能够快速诱发针对呼吸道合胞病毒融合前蛋白和黏附糖蛋白的免疫反应，且chad63/pref2a3g诱导产生的免疫反应优于rchad63/pref，同时，rchad63/pref2a3g和rchad63/pref诱导产生的血清抗体主要是针对pref的血清抗体。重组腺病毒载体呼吸道合胞病毒疫苗可以进行大规模的快速制备，具有可诱发强烈免疫反应的特点，能够用于人群的预防性免疫。

本领域普通技术人员可以理解：附图只是一个实施例的示意图，附图中的模块或流程并不一定是实施本发明所必须的。

本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于装置或系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述得比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。以上所描述的装置及系统实施例仅仅是示意性的，其中所述作为分离部件说明的单元可以是或者也可以不是物理上分开的，作为单元显示的部件可以是或者也可以不是物理单元，即可以位于一个地方，或者也可以分布到多个网络单元上。可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部模块来实现本实施例方案的目的。本领域普通技术人员在不付出创造性劳动的情况下，即可以理解并实施。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

sequencelisting

<110>北京交通大学

<120>一种共表达呼吸道合胞病毒融合前蛋白和黏附糖蛋白的复制缺陷型腺病毒载

体疫苗

<130>2020.12.11

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>2742

<212>dna

<213>prefusionfusionglycoproteinandthe130-230aaofattachmentglycoprotein

<400>1

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