枯草芽孢杆菌表达系统及其生产α-L-AFs的方法与流程

本发明属于枯草芽孢杆菌表达系统构建技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌表达系统及其生产α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶的方法。

背景技术：

作为gras(generallyrecognisedassafe)菌种，枯草芽孢杆菌作为底盘细胞被广泛应用于生物工程中，尤其可以用于表达生产食品相关的酶类。尽管如此，枯草芽孢杆菌中的启动子工具仍然有限。应用最广泛的启动子是p43。近年来陆续报道了几种新型启动子，但它们的效率仍比不上t7表达系统中的t7启动子。t7启动子最早被用于大肠杆菌中，在t7rna聚合酶的作用下，能够非常高效地起始转录其下游的dna序列。近年来有文献报道t7表达系统可以在芽孢杆菌中发挥作用，但在枯草芽孢杆菌atcc6051a中还未见报道。枯草芽孢杆菌atcc6051a又称a164菌株，与实验室研究使用的枯草芽孢杆菌模式菌168及其衍生菌种相比，其分泌表达异源蛋白的效果更好，在含有蛋白胨的培养基中生长更快，具有更好的工业应用的潜力。

α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶(ec3.2.1.55；α-l-arabinofuranosidases；α-l-afs)可以特异性地作用于α-l-阿拉伯呋喃糖苷、阿拉伯木聚糖或阿拉伯半乳聚糖，可以水解(1,3)和/或(1,5)-位键，修剪含有α-l-阿拉伯糖基的侧链。α-l-afs可应用于多种工业加工过程，如利用生物质生产糖或医药化合物、改善饮料风味、面包储存、动物饲料处理以及纸浆脱木素等。根据序列相似性和进化关系α-l-afs可分为5个糖基水解酶家族(glycosylhydrolasesfamilies,ghs)，即gh3、gh43、gh51、gh54和gh62等。一些α-l-afs在大肠杆菌、黑曲霉或毕赤酵母中已被鉴定和过表达，但尚未报道α-l-afs在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。

技术实现要素：

本发明的目的是，提供一种枯草芽孢杆菌表达系统及其生产α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶的方法。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

本发明提供一种枯草芽孢杆菌表达系统，通过在枯草芽孢杆菌基因组的apre位点插入木糖诱导的t7rna聚合酶表达系统，建立所述枯草芽孢杆菌表达系统。

作为优选实施方案，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌164s，其通过在枯草芽孢杆菌atcc6051a的npre位点整合一份拷贝的comk得到。

作为优选实施方案，所述t7rna聚合酶表达系统的dna序列如seqidno:1所示。

本发明还提供所述枯草芽孢杆菌表达系统在生物转化或表达酶蛋白中的应用。具体地，本发明提供了所述的枯草芽孢杆菌表达系统在生产α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶中的应用。

本发明还提供所述枯草芽孢杆菌表达系统生产α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶的方法，包括如下步骤：

步骤1，合成序列如seqidno:2所示的质粒pmk4-t7，在质粒pmk4-t7中插入α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶的编码基因，得到表达质粒pmk4-t7-arbf；

步骤2，将表达质粒pmk4-t7-arbf转化至权利要求1所述的枯草芽孢杆菌表达系统得到枯草芽孢杆菌t7-arbf；

步骤3，所述枯草芽孢杆菌t7-arbf进行发酵培养分泌生产α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶。

作为优选实施方案，所述步骤1中质粒pmk4-t7-arbf的dna序列如seqidno:3所示。

作为优选实施方案，所述步骤1中α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶的氨基酸序列如seqidno:4所示。

作为优选实施方案，所述步骤3中枯草芽孢杆菌t7-arbf在木糖、木聚糖或麸皮诱导下，在lb培养基中进行发酵培养。

作为优选实施方案，所述枯草芽孢杆菌t7-arbf发酵培养的培养基为：lb培养基+3％(m/v)麸皮。

与现有的技术相比，本发明的有益效果为：

1，本发明的t7表达系统不同于其它在芽孢杆菌应用的系统，本发明利用gfp以及高效率的合成启动子p43作为对照，对基于t7启动子的外源蛋白的重组生产进行了验证。

2，本发明设计的t7表达系统由于独特的基因组整合位点，宿主细胞的高转化效率，以及t7rna聚合酶的高表达效率，使其可以在枯草芽孢杆菌中高效地表达外源蛋白；能够以廉价的麸皮为诱导物高效表达蛋白，在发酵实验中，α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶的最高酶活可以达到194.8±4.1u/ml。

3，本发明的枯草芽孢杆菌表达系统在蛋白表达、生物转化等方面具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明重组枯草芽孢杆菌164t7p构建示意图。

图2为本发明质粒pmk4-t7的示意图。

图3为本发明实施例2木糖诱导的t7表达系统和p43表达系统分别表达gfp的结果数据示意图。

图4为本发明质粒pmk4-t7-arbf的示意图。

图5为本发明实施例3枯草芽孢杆菌t7-arbf表达的重组arbf酶活随温度变化的曲线图。

图6为本发明实施例3枯草芽孢杆菌t7-arbf表达的重组arbf酶活随ph变化的曲线图。

图7为本发明木糖与麸皮分别作为诱导物获得重组arbf的表达结果比较图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。实施例中未注明具体条件的操作，按照常规条件或制造商建议的条件进行。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。

以下各实施例中使用的生物材料来源如下：

枯草芽孢杆菌164s来自实验室保藏菌种，为枯草芽孢杆菌atcc6051a(也称a164)的衍生菌：在枯草芽孢杆菌a164的npre位点整合了一份拷贝的comk。枯草芽孢杆菌atcc6051a为美国模式培养物收藏库(americantypeculturecollection)的模式菌株，6051a为其收藏号，可从美国atcc保藏中心购买获得。

大肠杆菌bl21(de3)购自生工生物工程(上海)股份有限公司。pmk4-p43-gfp的构建方法来自文献“一种芽孢杆菌中性蛋白酶启动子的克隆和验证”(doi：10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.030)。pmk4-t7为合成质粒(序列如seqidno:2所示)，将t7启动子、多克隆位点以及t7终止子插入pmk4的psti和ndei位点。dna合成及测序注释工作在生工生物工程(上海)股份有限公司完成。pmd19t为生工生物工程有限公司的克隆质粒。

实施例中使用的2×phantamastermix(货号p511-01)、iionestepcloningkit(货号c115-01)购自南京诺唯赞生物科技有限公司；sds-page凝胶试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，限制性内切酶购自takara；红霉素(货号e808819)、氯霉素(货号c804169)和d-木糖(货号d856756)购自上海麦克林生化科技有限公司，4-硝基苯基-α-l-呋喃阿拉伯糖苷(pnpa，4-nitrophenylα-l-arabinofuranoside，货号6892-58-6)购自北京凯森莱医药科技有限公司。

实施例1：重组枯草芽孢杆菌164t7p的构建

枯草芽孢杆菌164t7p是在枯草芽孢杆菌164s的apre位点整合t7rna聚合酶表达序列。枯草芽孢杆菌164s的apre位点是比较理想的整合位点，这是因为该基因表达碱性蛋白酶，对其进行替代整合可以减少宿主细胞对外源蛋白的降解。本发明将完整的含有t7rna聚合酶过表达序列(如seqidno:1所示)整合到此位点，同时敲除了该基因，然后通过消除红霉素抗性基因后得到164t7p，图1为重组枯草芽孢杆菌164t7p的构建示意图。枯草芽孢杆菌164t7p的具体构建方法如下：

(1)整合质粒pmd19t-t7p的构建

首先扩增t7rna聚合酶编码基因片段(t7rnap)，使用引物对为f77-f(5’-atgaacacgattaacatcgctaagaacgac-3’)(如seqidno:5所示)/f77-r(5’-catgctgcagaaaagaagcaggtatggaggaacctgcttctttttactattacgcgaacgcgaagtccgactc-3’)(如seqidno:6所示)，使用模板为大肠杆菌bl21(de3)基因组。然后扩增木糖启动子pxyla，使用引物对为fxy-f(5’-atcgctgcagctaacttataggggtaacacttaaaaaagaatc-3’)(如seqidno:7所示)/fxy-r(5’-gtcgttcttagcgatgttaatcgtgttcatattatggcctcctttggatcccatttc-3’)(如seqidno:8所示)，使用模板为枯草芽孢杆菌6051a的基因组dna。

使用2×phantamastermix扩增上述2个dna片段(t7rnap和pxyla)，pcr方法采用2×phantamastermix的说明书方法。扩增的pcr产物使用dpni做消模板处理后，采用axypreppcr清洁试剂盒进行dna的清洁回收，最后所清洁的dna片段通过nanodrop测定浓度。

使用融合pcr的方法连接上述两个片段，融合pcr的方法如下：

第一步，pcr反应配置体系为10μl2×phantamastermix，2个片段各200ng，添加ddh2o至体系为20μl。进行第一轮pcr反应，pcr反应条件为预变性95℃5min，然后变性95℃15s，退火60℃15s，延伸72℃3min，循环数10。

第二步，pcr反应配置体系为25μl2×phantamastermix，2.5μl引物fxy-f(10μm)，2.5μl引物f77-r(10μm)，1μl第一轮pcr反应产物，19μlddh2o。pcr反应条件为预变性95℃5min，然后变性95℃15s，退火55℃15s，延伸72℃3min，循环数30。

经凝胶电泳检测，第二步pcr扩增出了2个片段融合产物，采用axypreppcr清洁试剂盒进行dna的清洁回收，通过nanodrop测定浓度。采用iionestepcloningkit做连接构建，将pcr融合产物连接到pmd19t的xmai和kpni位点，构建方法为试剂盒说明书方法。所构建的质粒经生工测序鉴定验证后，命名为pmd19t-t7p。

(2)pmd19t-t7p的转化及消抗

使用限制酶apali处理质粒pmd19t-t7p使之线性化，然后将线性化的pmd19t-t7p转化到枯草芽孢杆菌164s，均匀涂布于含有10μg/ml红霉素的抗性平板，放置于37℃恒温箱过夜培养，对于所长出的单菌落，通过菌落pcr鉴定，阳性转化子即为转化成功的菌种。通过转化子中所带的cre/lox系统以及传代的方法进行消抗，所长出的转化子同时印章到10μg/ml氯霉素抗性平板和10μg/ml红霉素抗性平板上，在两种抗性平板上均不能生长，且通过菌落pcr鉴定敲除红霉素抗性基因ermc的重组菌，为构建的枯草芽孢杆菌164t7p。

实施例2t7表达系统表达gfp

(1)质粒pmk4-t7-gfp与枯草芽孢杆菌t7-gfp的构建

人工合成质粒pmk4-t7，参见图2，为质粒pmk4-t7的示意图。以限制内切酶bamhi和ecori酶切合成的质粒pmk4-t7，使其线性化，然后采用axypreppcr清洁试剂盒进行dna的清洁回收；同时扩增gfp，扩增gfp使用引物对为gfp-f(5’-gtttaactttaagaaaggaggatataccatgagtaaaggcgaagaacttttcac-3’)(如seqidno:9所示)/gfp-r(5’-gcttcctttcgggctttgttagcaggaattcttatttgtatagttcatccatgcc-3’)(如seqidno:10所示)，使用模板为质粒pmk4-p43-gfp，扩增产物通过限制内切酶dpni做消模板处理后采用axypreppcr清洁试剂盒进行dna的清洁回收；然后使用一种基于融合pcr的克隆技术构建质粒pmk4-t7-gfp，具体操作如下：

pcr反应体系：gfp片段200ng，线性化质粒pmk4-t7500ng，2×phantamastermix25μl，添加ddh2o至反应体系为50μl。pcr反应条件为预变性95℃5min，然后变性95℃15s，退火55℃15s，延伸72℃4min，循环数30。

最后取10μlpcr反应产物转化枯草芽孢杆菌164t7p，孵育后均匀涂布于含有10μg/ml氯霉素的抗性平板，放置于37℃恒温箱过夜培养，对于所长出的单菌落，通过菌落pcr鉴定，阳性转化子即为转化成功的菌种，随机挑取单克隆提取质粒，交由生工生物公司测序，鉴定完全正确的质粒即为质粒pmk4-t7-gfp，所对应的重组菌命名为枯草芽孢杆菌t7-gfp。

(2)枯草芽孢杆菌p43-gfp的构建

取10μl质粒pmk4-p43-gfp转化枯草芽孢杆菌164t7p，孵育后均匀涂布于含有10μg/ml氯霉素的抗性平板，放置于37℃恒温箱过夜培养，对于所长出的单菌落，通过菌落pcr鉴定，阳性转化子即为转化成功的菌种，命名为枯草芽孢杆菌p43-gfp。

(3)枯草芽孢杆菌发酵表达gfp的测定

除非特殊说明，以下培养基中均含有10μg/ml氯霉素。使用枯草芽孢杆菌t7-gfp和p43-gfp做摇瓶发酵实验：首先挑取单克隆到装有3mllb培养基(配方为10g/l蛋白胨，10g/lnacl，5g/l酵母粉)的试管中，200rpm，37℃在恒温摇床过夜培养；然后取300μl的培养物转接到装有30mllb培养基的250ml摇瓶中，200rpm，37℃在恒温摇床培养；待生长～4h或od600到1左右，向培养基中添加终浓度为1％(m/v)的木糖诱导；每隔12h取一次样，使用酶标仪测定od600和荧光强度。

实验结果见附图3，为木糖诱导的t7表达系统和p43表达系统分别表达gfp的数据比较图。图3结果表明：t7表达系统在枯草芽孢杆菌中比启动子p43的效率要高10倍以上，具有很大的应用潜力。

实施例3以木糖为诱导物表达α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶

(1)质粒pmk4-t7-arbf与枯草芽孢杆菌t7-arbf的构建

arbf编码一种细菌型的耐温，其序列是利用利用生物信息学工具通过序列比对分析获得的，氨基酸序列如seqidno:4所示，然后通过基因合成获取。在基因外源表达之前，对该序列是否具有的功能并不十分确定。通过全基因组测序及注释，找到了其中的基因arbf，推测其能。

以化学合成的编码α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶的dna为模板，进行了线性dna的pcr扩增，所f使用引物分别为arbf-f(5’-taattttgtttaactttaagaaaggaggatataccatgactgtacacaaagcgaagatg-3’)(如seqidno:11所示)/arbf-r，以及arbf-r(5’-gccaactcagcttcctttcgggctttgttagcaggaattcttattgtttcttcattctgatcacattcc-3’)(如seqidno:12所示)，扩增产物通过限制内切酶dpni做消模板处理后采用axypreppcr清洁试剂盒进行dna的清洁回收。再线性化质粒pmk4-t7与基因arbf的dna片段，通过融合pcr的克隆技术构建质粒pmk4-t7-arbf，具体操作与实施例2中的方法相同。参见图4，为质粒pmk4-t7-arbf的示意图。

取10μl质粒pmk4-t7-arbf转化枯草芽孢杆菌164t7p，孵育后均匀涂布于含有10μg/ml氯霉素的抗性平板，放置于37℃恒温箱过夜培养，对于所长出的单菌落，通过菌落pcr鉴定，阳性转化子即为转化成功的菌种，命名为枯草芽孢杆菌t7-arbf。

(2)枯草芽孢杆菌t7-arbf的发酵实验

除非特殊说明，以下培养基中均含有10μg/ml氯霉素。使用枯草芽孢杆菌t7-arbf做摇瓶发酵实验：首先挑取单克隆到装有3mllb培养基的试管中，200rpm，37℃在恒温摇床过夜培养；然后取300μl的培养物转接到装有30mllb培养基的250ml摇瓶中，200rpm，37℃在恒温摇床培养；待生长～4h或od600到1左右，向培养基中添加终浓度为1％(m/v)的木糖诱导；每隔12h取一次样，测定od600及α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶的活性及表征。

α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶活性的测定方法：α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶每水解一分子pnpa(4-nitrophenylα-l-arabinofuranoside)产生一分子对硝基苯酚(4-nitrophenol)，每分钟水解底物产生1μmol对硝基苯酚所需的酶量定义为1个活力单位。通过测定产物的生成计算酶活。首先取50μl的pnpa溶液，加入100μl经稀释的酶液，40℃水浴孵育5min；然后加入150μl的10％na2co3溶液终止反应，410nm处测定吸光值(注：酶的稀释倍数以控制最终测定od410在0.2～0.8之间为准)。测定重组arbf酶的温度和ph曲线，所采用的的温度区间为25～65℃，ph区间为3.5～9.0。同时测定重组arbf酶学特征参数。

发酵结果显示：重组arbf酶可以分泌到细胞外，参见图5和图6，分别为表达的重组arbf酶活随温度以及ph变化的曲线图。根据图5和图6可知：其最适温度为45℃，最适ph为6.5。重组arbf酶的km值为1.4±0.1mm，kcat为139.4s^-1。在木糖的诱导下，在lb培养基中，枯草芽孢杆菌t7-arbf发酵表达的重组α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶，其最高酶活性为141.4±4.8u/ml。

实施例4以麸皮为诱导物表达α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶

麸皮为小麦加工的副产物，富含阿拉伯木聚糖。通过实验发现：枯草芽孢杆菌可以通过本身的xyna和xync，水解出麸皮中的木糖残基。本部分与实施例3发酵方法的区别仅在于把诱导物木糖替换成廉价的麸皮，其他方法步骤均相同。具体发酵方法如下：

除非特殊说明，以下培养基中均含有10μg/ml氯霉素。使用枯草芽孢杆菌t7-arbf做摇瓶发酵实验：首先挑取单克隆到装有3mllb培养基的试管中，200rpm，37℃在恒温摇床过夜培养；然后取300μl的培养物转接到装有30mllb+3％麸皮(m/v)培养基的250ml摇瓶中，200rpm，37℃在恒温摇床培养每隔12h取一次样，测定od600及α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶的活性及表征。

参见图7，为木糖与麸皮分别作为诱导物获得重组arbf的表达结果比较图。木糖作为诱导物时，在lb培养基中，枯草芽孢杆菌t7-arbf发酵表达的arbf酶，其最高酶活为141.4±4.8u/ml。麸皮作为诱导物时，发酵表达的arbf酶最高酶活为194.8±4.1u/ml，是用木糖作为诱导物的1.4倍。

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

序列表

<110>中国科学院上海高等研究院

<120>枯草芽孢杆菌表达系统及其生产α-l-afs的方法

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>6647

<212>dna

<213>大肠杆菌(escherichiacoli)

<400>1

caaatgcgctgaatgcctatgttacaggaattggggccaataaacggattgtattgtggg60

atacgacgctgaacaaacttgacgattcagaaattctgtttattatgggccacgaaatgg120

gccattatgtcatgaagcacgtttacatcggtctggctggctatttgctcgtgtcgctcg180

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